この作品は、ビル＆メリンダ·ゲイツ財団（助成53085）、JR Oishei財団、米国肺協会（助成金のRG-123721-N）APHにし、EACにNIH（NIDCD）フェローシップF31DC011218によってサポートされていました。

1。細菌培養の準備<ol><li> 実験に使用するための培養物を増殖させる <ol><li> 37℃の加熱ブロック中、Sの凍結ストックバイアルを解凍する肺炎球菌と新鮮なの9ミリリットルに、そのコンテンツを追加するには、ガラス培養管中の10ミリリットルの全容量0.5％酵母エキス（THY）とトッド·ヒューイットブロスを予め温め。 </li><li>文化が対数中期（ABSの600nmの ≈0.5-0.6）に達するまで37℃で静的にインキュベートする。 </li></ol></li></ol> 2。膜脱分極および破裂を検出する<ol><li> 試薬の調製 <ol><li> DiBAC 450μMの株式（3）100％のDMSO中、および蒸留H 2 O中のPIの2 mg / mlのストックを調製DiBAC 4（3）ストックは少なくとも6ヶ月間、-20℃で安定である。 PIストックは、少なくとも6ヶ月間、4℃で安定である。 </li><li>光から保護するために、ホイルに株式を包む。 </li></ol></li><li> 荷重細菌<ol><li> 2,400×gで再度室温で10分間2,400×gで遠心分離することによって、ステップ1.2.2からの細菌細胞をペレットにし、上清を除去することによって二回洗浄し、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlにペレットを再懸濁し、遠心10分間。 </li><li>上清を除去し、元のボリュームになるようにPBSでペレットを再懸濁します。これは、1mlあたりの細菌の約10 8コロニー形成単位を提供します。洗浄した細胞の（5サンプルのための十分な）1ミリリットルを取り外し、マイクロ遠心チューブに入れる。 </li><li>これらの細胞を、25 mMグルコースの最終濃度（のddH 2 Oで調製し、0.45μmのフィルターで濾過したもの）のグルコース、1Mフィルター滅菌ストック溶液25μlを追加し、37℃のヒートブロックでインキュベート15分間。注：これは、すべてのATP依存性膜チャネルと細胞成分のためのエネルギーを提供します。このステップの必要性は実験に応じて、変化し得る。 </li><li> 50μMのDiBAC 4（3）株式の5μLおよび2 mg / mlのPI株式の10μlを加える。これは、それぞれ、250nMの最終濃度および20μg/ml/ mlで提供する。上下にピペッティング数倍よく混ぜる。透明な96ウェルプレートの各サンプルウェルにこの細胞懸濁液200μlを加える。 </li></ol></li><li> 蛍光を検出する <ol><li>予め温めた（37℃）の蛍光検出プレートリーダーに置き板。 </li><li>適切なフィルタがDiBAC 4（3）（490nmの励起、516 nmの発光）とPI（535 nm励起、617 nmの発光）検出のための所定の位置にあることを確認してください。 </li><li>測定値が安定するまで（3）膜の上に、約30〜40分ごとに分蛍光測定値を取るためにリーダーを設定するか、DiBAC 4の平衡を（そして同時にモニタ）を可能にするために、これは「前処理」読書として機能します。 </li><li>プレートを取り出し、選択とIMMEDの実験エージェントを追加iately DiBAC 4時間の所望の長さのための（3）とPI蛍光の監視を継続するためにリーダーにバックプレートを配置。一度に複数のサンプルを処理する場合は、マルチチャンネルピペットを使用すると、すべてのウェルに同時にエージェントを追加すると便利です。 </li><li> Microsoft Excelなどのデータ解析プログラムに測定値をエクスポートします。膜の脱分極や破裂を評価するための時間をかけてプロット蛍光。 DiBACとPIの増加蛍光が脱分極し、破断が発生していることを示しています。 </li></ol></li></ol> 3。細胞内Ca 2 +又はK +濃度の変化で検出<ol><li> 準備試薬およびローディングバッファー <ol><li>以下の試薬を準備し、イオン感受性蛍光色素の5 mMストック（Fura-2/AMをまたはPBFI / AM、染料の50μgの入ったチューブをDMSOの適切な量を追加します）、「100X」プロベネシド（1を追加77 mgのバイアルへのPBS）。可溶化染料は、-20°Cで凍結し、一度プロベネシドは6ヶ月間、-20℃で溶液中で安定であるのに対し、3ヶ月間、溶液中で安定であることができる。 </li><li>以下のように2倍がバッファをロードする1ミリリットルを準備します。15ミリリットルのプラスチックコニカルチューブの底では、5 mMのイオンの2μLが続く（6ヶ月2〜8℃で安定）100X PowerLoad濃縮物の20μLを分注直接PowerLoadへの感受性色素。渦を簡単に混合する。 100Xプロベネシド20μlの続くのPBS 960μLを加える。混合物を最後に1回ボルテックスする。光から保護するために、ホイルで包みます。 </li></ol></li><li> 色素で細菌をロード <ol><li>ペレットと2.2.1で説明したように中間対数期の細菌培養を洗う。 「2X」細胞懸濁液を作るために5mlのPBSで上清とペレットを再懸濁して削除します。 </li><li> 2Xロードバッファへの2倍の細胞懸濁液の1ミリリットルを追加します。これを2mlの最終容量、および最終concentrのために提供する1X PowerLoad、5μMの蛍光色素、及び1Xプロベネシドの管理ポイント。注：各測定用試料ウェル200μLを含むことになるので、この懸濁液を10サンプルのための十分な音量を提供します。 </li><li>遮光して75分間37℃の水浴でインキュベートする。注：染料は、任意の解糖基質の非存在下で染料の流出を最小限にするプロベネシドの存在下で細菌細胞にロードされる。 </li><li>洗浄1：ペレット10分間2400×gの遠心分離により細胞、上清を除去し、2ミリリットル1Xプロベネシドを含むPBS中に再懸濁します。洗浄2、3：リピートステップ3.2.4 2倍。さらに30分間37℃でインキュベートする。これは、細菌のエステラーゼのための時間が離れて内面化蛍光性色素の中から、AMエステル基を加水分解することができます。 </li><li> WASH 4：、10分間2400×gの遠心分離により細胞をペレット上清を除去し、再懸濁1Xプロベネシドを含有するPBS 2ml中。注：experimeによってはNT、グルコースは、細菌を再活性するためにここに戻って追加することができます。 </li></ol></li><li> 蛍光を検出する <ol><li> 37℃まで蛍光検出プレートリーダープレートリーダーを予熱し</li><li>所望の各サンプルについて、96ウェルプレートのウェルに（ステップ3.2.8）からロードされた細胞を200μlを加える。 （一度に1ウェル/サンプルの完了には、次の手順を実行します）。 </li><li>少なくとも（「値1」と「値2」のために380 nmの励起/ 510nmの発光340 nmの励起/ 510nmの発光）、蛍光を測定する蛍光検出プレートリーダーでよく、場所プレートの読みのベースラインを確立する1分ごとに秒。 </li><li>プレートを取り出し、（約5μLの少量の）だけでなくそれに最適な治療法を追加し、すぐにピペットを数回上下混合し、すぐに目的のためにあらゆる秒の読み取りに蛍光検出プレートリーダーに戻し置く時間の長さ。 （Ifにおいて、プレートリーダーに関連付けjectors）は、これらはまた、シームレス読み出しを停止し、プレートを吐出する必要がなくなり、所望の処理を追加するために使用することができ、利用可能である。 </li><li> Microsoft Excelなどのデータ解析プログラムに測定値をエクスポートします。値2で値1を分割して、各時点についての蛍光値の比を計算し、グラフ上の比の値をプロットする。 </li></ol></li></ol> 4。細胞内pHの変化を検出する<ol><li> 調製試薬およびキャリブレーション·バッファ <ol><li>以下の試薬を準備します。BCECF / AM（この株は3ヶ月間-20℃で安定している色素の50μgの入ったチューブにDMSOを適切な量を追加します。）の5 mMストック、100Xプロベネシド（の1ミリリットルを追加77 mgのバイアルに、PBS）を、エタノール中ナイジェリシンの1 mM保存準備周囲の緩衝液のpHに対する細胞の（細胞内pH（pHが私を平衡に必要）このストックはS6ヶ月間-20℃）での表、。、DMSO（プロトン駆動力を切り離すプロトノフォアにおけるカルボニルシアニド3 - クロロフェニル（CCCP）の0.5 mMストックはこのストックは、6ヶ月間、-20℃で安定している） </li><li> 135のKH 2 PO 4月 20 日のNaOH（一塩基）および110 mMのK 2 HPO 4月 20 日のNaOH（塩基）：以下の高カリウムバッファの10ミリリットルを用意します。フィルターは、0.45μmのフィルターを用いて滅菌する。 （これらのバッファは、使用するまで4℃で保存することができる）。 </li><li> 6.5から8.0の範囲の、少なくとも5〜6のpH値で高カリウム緩衝液を作成するために必要な割合で高カリウム緩衝液を混合する。 </li><li>次のようにバッファをロード2Xの1ミリリットルを準備します。15ミリリットルのプラスチックコニカルチューブの底では、100X PowerLoad40μlのを分配、直接PowerLoadに5 mMのイオン感受性色素を20μl続く。渦を簡単に混合する。 100Xプロベネシド40μlの続くのPBS 900μLを加える。 VORT元の混合物を最後に1回。光から保護するために、ホイルで包みます。 </li></ol></li><li> 色素で細菌をロード <ol><li>ペレットとは、2.2.1で説明したように中間対数期の細菌培養の8ミリリットルを洗う。上清、「4X」細胞懸濁液を作るために2mlのPBSに再懸濁ペレットを削除します。 </li><li> 2Xロードバッファへの4倍の細胞懸濁液の1ミリリットルを追加します。これは2ミリリットルの最終容量、および2X細胞の最終濃度は、2倍PowerLoad、50μMの蛍光色素、及び2Xプロベネシドを提供します。 </li><li>遮光して40分間30℃の水浴でインキュベートする。 NOTE：染料は30℃より低い温度で、染料の流出を最小限にする任意の解糖基質の非存在下で細菌細胞中にロードされる。 </li><li>洗浄1：ペレット10分間2400×gでの遠心分離により細胞が、過剰な色素を取り除くために上清を除去し、4ミリリットルのPBSに再懸濁2XプロベネシドAを含むND 1 mMグルコース（細菌をreenergizeため）。 WASH 2、3:4 mlのPBS（1×細胞の最終濃度のため）中の最終的な再懸濁を2×プロベネシドおよび10mMグルコースを含有するで2回繰り返して、ステップ4.2.7。 </li><li> 5分間37℃でインキュベートする。これは、細胞が完全に活性化し、離れて内面化BCECF出身エステル基を切断するために、細菌のエステラーゼのための時間を確保することができます。 </li></ol></li><li> バックグラウンド蛍光を確立し、 インビボ較正曲線で <ol><li> 37℃まで蛍光検出プレートリーダープレートリーダーを予熱し</li><li>バックグラウンド蛍光を決定するために、細菌を除去し、96ウェルプレートのウェルにろ液を200μlを追加する（ステップ4.2.7）からロードされたと通電細菌懸濁液を約500μlのフィルター滅菌する。 </li><li> （490 nmの励起/ 530 nmの発光が蛍光を測定するための蛍光検出プレートリーダーにプレートを置き1分間の「値1」と「値2」のために440 nmの励起/ 530nmの発光）。このバックグラウンド蛍光は、較正曲線と実験サンプルの両方の比率の計算の前に減算されるべきである。 </li><li> in vivoでの検量線を得るためには、（6.5から8.0の範囲）に異なるpH値で、一度、高カリウム緩衝液中で再懸濁ステップ4.2.7からロードされ、通電細胞の500μlのアリコートを洗う。 </li><li>周囲の緩衝液のpHに対する細胞の細胞内pHを平衡化し、5分間37℃でインキュベートした試料を20μMのナイジェリシンを追加します。 96ウェルプレートのウェルに200μlの細菌の/ pH緩衝液の組合せを追加します。 </li><li>各ウェルのための安定した読み取りを確立するために数分間の蛍光を測定する蛍光検出プレートリーダーにプレートを置きます。 Microsoft Excelなどのデータ解析プログラムに測定値をエクスポートします。 </li><li> BAを差し引いckground蛍光値、値2で値1を分割して蛍光値の比を計算する。検量線を作成し、各pH緩衝用の比の値をプロットする。 （細菌にロードされた蛍光色素の量が毎回変化するように較正曲線は、ロードされたセルのすべての新しいバッチのために生成されるべきである）。 </li></ol></li><li> 細胞内pHの変化を測定する <ol><li>所望の各サンプルについて、96ウェルプレートのウェルに（ステップ4.2.7）からロードされたと通電細胞を200μlを加える。 </li><li>蛍光検出プレートリーダーにプレートを置き、5分間ごとに5秒のサンプルの蛍光を測定する。 </li><li>プレートを取り出し、他のウェルへの関​​心の1つのウェル（細胞内pHを低下させるためのポジティブコントロールとして機能）と実験の薬剤を10μMのCCCPを追加します。正確に時間をかけてその効果を比較するために、AMを使用して、同時に選択のCCCPとエージェントを追加ultichannelピペット。 </li><li>直ちにプレートリーダーにプレートを戻し、10分間蛍光ごとに5秒を計測し続ける。追加の対照として、プレートを取り出して、周囲の緩衝液のpHに細菌のpH Iを平衡化するためにすべてのサンプルに、20μMニゲリシンを追加し、5分間読み取っ。 </li><li>バックグラウンド蛍光値を差し引いた後、各サンプルの蛍光の比率を計算する。較正曲線から、各読み取りのためのpH iを補間する。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、宣言する競合する金融利害関係はありません。

極性およびサイズが、膜および細菌内のイオン濃度の変化の整合性の変化を検出するために古典的な電気生理学的方法を用いて提示するための制限にかかわらず、我々は、S.、これらの事象を測定する方法を記載している肺炎連鎖球菌は、蛍光色素を用いた。私たちのプロトコルは、肺炎球菌、一般的に細菌種について記載したいくつかの一つのために記載し、その種の最初の?...

我々の研究室では、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する（腫瘍細胞に対して致死メイドヒトα-ラクトアルブミンの場合）HAMLETというヒト乳由来のタンパク質-脂質複合体を同定するだけでなく、細菌種の1,2種々を殺すことができるしている。特に敏感であることが判明した種は、最大の感度と死2,3のアポトーシス様表現型を示す肺炎球菌 （肺炎球菌）で、気道を標的とするものだった。膜脱分極および特定のイオン輸送イベントは、真核細胞におけるアポトーシスの間に十分に説明され、重要なイベントである、放射性TPP +イオンおよびJC-1とTMREを含む蛍光色素は、ミトコンドリア膜3の脱分極を示すために使用されてきたミトコンドリア、特に-5。そこで、我々は我々の努力を集中として肺炎球菌におけるこれらの膜関連機能に対するハムレットの影響についての詳細を学ぶために求められてプロセスにおける新規抗菌治療法やワクチン候補を識別するための大きな可能性を秘めた、細菌におけるアポトーシス様の表現型の機構部品のよりよい理解を開発しています。 我々の機構的研究のためのプロトコルを確立しようと、我々は、真核生物系において十分に記載された方法論とは対照的に、細菌膜6,7の電気生理学およびイオン輸送メカニズムを詳述した非常に少数の公開された研究があることを発見した。これは主に小さい微生物の大きさとその表面構造、巨大プロトプラストを用いたいくつかの研究は、混合成功を用いて実施したが、特に細胞壁の存在、すなわち、パッチクランプ法のような従来の真核生物の方法を使用するための膜のアクセスを制限することに起因する8,9。それは人間を必要とするため、これらの巨大プロトプラストとの仕事は、ほとんどの細菌種のための理想的な、あるいは現実的な方法ではないので、ipulated細菌は、非天然および非生物状態で、実行された細菌細胞膜の極性の制限された研究は、主に、フローサイトメトリーを採用しており、シアニン、オキソノール蛍光染料の使用は、10-16。 単一時点に一つの細菌から個々の蛍光測定値を収集する、フローサイトメトリーの代わりに、我々は、時間の経過、96ウェルプレート形式で細菌懸濁液の蛍光強度を検出する蛍光検出プレートリーダーを使用することを選択した。これは、はるかに大きく単純かつ容易に種々の時点での細菌の集団を処置するため、連続的フローサイトメトリーを用いて達成することは困難であり、長期間にわたって集団全体の蛍光動力学を監視することができた。 （ミトコンドリアと共に使用するための上記のものを含む）の電位感受性蛍光色素の様々なテストした後、我々は、使用した最高の技術的かつ実用的な成功を達成し極性の変化を監視するDiBAC 4と呼ばれるビス-オキソノール色素（3）（ビス- （1,3 -ジブチル酸）トリメチンオキソノール）。 我々はまた、貴重同時に、ヨウ化プロピジウム（PI）を用いて、膜の完全性の混乱を監視することを見出した。この色素は、核酸に結合すると蛍光を発するが、細菌細胞膜の完全性は、それ生死染色アッセイにおいて、死細胞を検出するために使用される一般的成分作り、危険にさらされたときにこれを行うことができるだけである。 PIに加えて、緑色およびTO-PRO-1、SYTOXアクションが類似していると以前にフローサイトメトリー検出法17を用いて、いくつかの研究中の細菌のために使用されている蛍光染料である。私たちは、私たちは与えられたサンプル中DiBACと同時にその蛍光をモニタリングすることができ、その励起波長にPIを使用することにしました。 我々の研究では、我々は、ハムレットのほか、殺菌作用を持つ別の関連タンパク質 - 脂質複合体を観察している肺炎球菌3,18,26の処理時の両方の色素の蛍光の増加によって示されるように、細菌の膜の脱分極や破裂を誘発さELOA、として知られている。両方の複合体のために、我々はDiBAC 4の蛍光強度（3）脱分極が破裂する前に発生したことを示す、前のPIの強度の増加に増加し、であることが観察され、したがって、我々の殺菌性タンパク質-脂質複合体により誘導される特定のイベントインタレスト。この区別は、膜の破裂などの自体が非特異的な脱分極を引き起こす可能性があり、確認することが重要です。測定及び分析の両方DiBAC 4（3）及びPI蛍光動態同時にボランティア蛍光法の代わりに、フローサイトメトリーを使用することのさらなる利点である二つの膜事象との間のこの関係を調べることができた。 細菌イオン流出を監視するには、の取り込みを測定するなど、放射性同位元素を使用して以前のいくつかの成功があった45 Caの我々はまた、我々の最近の研究18、21で使用した肺炎球菌19,20、2 +。しかしながら、これらの放射性イオンでの作業は、いくつかの欠点を有する。彼らは、高価な時間がかかり、厄介であることができ、また、目的の同位体に依存して、危害を加える実験を行う個体を露出させることができる。さらに、それは経時的に急激な変化を監視することは困難である。したがって、我々は、イオン感受性蛍光指示薬色素のアセトキシメチル（AM）エステルのバージョンを採用して測定する別の方法の方を向いて。単独で、指示色素が充電され、容易に膜を通過しないが、親油性のエステル基を加えて、今非荷電分子は細菌の膜を通過することができる。内部に入ると、細菌エステラーゼは有意に細胞を終了する能力を遅らせ、染料tを可能にする、細胞内の遊離し、再荷電染料を残して、エステル基を開裂Oは、時間の経過とともに内部に蓄積されます。しかしながら、これらのエステル色素の使用は、負荷検出、および成功種々の方法を用いて、細胞内Ca 2 + H + 22-24と16の変化を検出するために、いくつかの細菌種に記載されている。 細胞内Ca 2 +の変化やS.においても、K +及びH +レベルを監視したいという要望とハムレットおよび他の化合物で処理すると、肺炎は 、我々が正常に効率的に細菌細胞に蛍光指示薬色素をロードするためのプロトコルを作成しました。陰イオントランスポーターとPowerLoad、積載効率を高めライフ·テクノロジーズからの独自の化合物をブロックすることにより、色素の保持を増加させ、両方のプロベネシドを必要とした細菌に効果的なローディング。 （K +を検出）のFura-2/AM（Ca 2 +の検出 ）、PBFI / AM、およびBCECF / AM（のH +を検出）が成功裏にカプセル化されていないと、カプセル化の両方肺炎球菌STにロードされた蛍光検出プレートリーダー18、21を用いて（K +脱共役剤）およびCCCP（H +共役剤）をバリノマイシン、例えばイオノマイシン（Ca 2 +の脱共役剤）などのイオノフォア、添加後に得られた蛍光パターンの測定を可能にする雨。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Todd Hewitt</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">249240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4170</td>
			<td>Make up in deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PowerLoad</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P10020</td>
			<td>100X concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Probenecid</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P36400</td>
			<td>Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Fura-2/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">F1221</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBFI/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P1267</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nigericin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">3246-01</td>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">4012-01</td>
			<td>dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">NaOH</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">5565-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCECF/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B1170</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">CCCP</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;dissipating the electrical potential and the H+ gradient.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Culture tube&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">53283-802</td>
			<td>Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Spectronic 20D+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">15 ml plastic conical tube</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Clear 96-well polystyrene microtiter plate</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Plate reader</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Synergy 2 Multi-Mode&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:143px;">Microplate Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Gen5 software</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Gen5&#8482; Software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring changes in membrane polarity, membrane integrity, and intracellular ion concentrations in streptococcus pneumoniae using fluorescent dyes

膜脱分極及びイオンフラックスはエネルギー論およびシグナル伝達を含む深く細胞機能に影響を与えるそれらの能力に起因する生物系において広範に研究されているイベントである。電極の使用法およびパッチクランプの両方を含む蛍光および電気生理学的方法は、周知の真核細胞におけるこれらの事象を測定するために開発されてきたが、微生物中で同様のイベントを測定するための方法はより複雑と組み合わせて、その小さなサイズが指定されて開発することがより困難なことが証明されている膜を遮蔽する細菌の外表面。 肺炎球菌 （肺炎球菌）における死の開始の我々の研究の中、当社は、極性の変更、整合性、および細胞内のイオン濃度を含む膜イベントの役割を解明したいと考えました。文献の検索、我々は非常に少数の研究が存在することがわかった。他の研究者らは、イオンインフルエンザを測定するための放射性同位元素の取り込みや平衡を監視していた主にグラム陰性生物におけるXESと膜電位との研究の限られた数は、膜電位を測定するためのカルボシアニン又はオキソノール蛍光色素を用いてある程度の成功を見て、またはイオン感受性の細胞透過性アセトキシメチル（AM）エステルバージョンで細菌をロードした蛍光指示薬色素。したがって、我々は、グラム陽性生物S.、膜電位、破裂、及びイオン輸送を測定するためのプロトコルを確立し、最適化肺炎連鎖我 々は、ビス-オキソノール色素DiBAC 4を使用してプロトコルを開発した（3）および細胞非透過性色素ヨウ化プロピジウムは、それぞれ、膜の脱分極および破裂を測定するための方法、ならびに最適レシオメトリック色素のAMエステルと肺炎をロードするフラ-2、PBFI、蛍光検出プレートリーダーを用いて、それぞれのCa 2 +、K +、およびH +の細胞内濃度の変化を検出するためのBCECF。これらのプロトコルは、肺炎球菌のための彼らの初のである及びこれらの染料の大部分は、他の細菌種に使用されていない。我々のプロトコルは、S.のために最適化されてきたが肺炎球菌は 、我々は、これらのアプローチは、他の細菌種における同様の研究のための優れた出発点を形成すべきであると信じています。

すべての実験のために、1サンプル、各ウェルに存在する条件のセットがあります。このように、各トレースが経時細菌の全集団の蛍光強度を表す。結果は、処理されたサンプルと未処理の対照のそれの蛍光を明確に区別して、容易に解釈すべきである。動態および蛍光の観察された変化の程度は、監視される事象の可能なメカニズムと程度に関する情報を提供することができる。 <...

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Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

真核生物に見られるものとは異なり、主にそのサイズが小さいなどの細菌内の詳細膜の脱分極とイオン濃度の変化は、測定困難な従来の方法を作ることを研究の不足があります。ここでは、蛍光技術を利用して重要なグラム陽性病原体肺炎連鎖球菌におけるこのようなイベントを監視するための詳細なプロトコール。

メンブレン極性膜完全性、細胞内イオン濃度の監視の変更<em&gt;肺炎球菌</em&gt;蛍光染料を使用

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

monitoring-changes-membrane-polarity-membrane-integrity-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

13.5K ビュー.  University at Buffalo, State University of New York. 真核生物に見られるものとは異なり、主にそのサイズが小さいなどの細菌内の詳細膜の脱分極とイオン濃度の変化は、測定困難な従来の方法を作ることを研究の不足があります。ここでは、蛍光技術を利用して重要なグラム陽性病原体肺炎連鎖球菌におけるこのようなイベントを監視するための詳細なプロトコール。 

ビデオ: Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

免疫・感染学

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em&gt;クラミジア</em生細胞内&gt;液胞の成長ダイナミクス

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

の莢血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;膨張反応を使用して、

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

の莢膜血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;ラテックス凝集による

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, immunodiagnostics and more recently as therapeutic agents. Traditional methods for labeling antibodies with small molecules require purified antibodies at relatively high concentration, involve multiple dialysis steps and have limited throughput. However, several applications, including the field of Antibody Drug Conjugates (ADCs), will benefit from new methods that will allow labeling of antibodies directly from cell media. Such methods may allow antibodies to be screened in biologically relevant assays, for example, the receptor-mediated antibody internalization assay in the case of ADCs. Here, we describe a method (on-bead method) that enables labeling of small amounts of antibodies directly from cell media. This approach utilizes high capacity magnetic Protein A and Protein G affinity beads to capture antibodies from the cell media followed by labeling with small molecules using either amine or thiol chemistry and subsequent elution of the labeled antibodies. Taking fluorescent dyes as surrogates for small molecules, we demonstrate the on-bead labeling of three different mouse antibodies directly from cell media using both amine and thiol labeling chemistry. The high binding affinity of antibodies to Protein A and Protein G ensures high recoveries as well as high purity of the labeled antibodies. In addition, use of magnetic beads allows multiple samples to be handled manually, thereby significantly improving labeling throughput.

The on-bead method for labeling antibodies with small molecules enables labeling of a small amount of antibodies directly from cell media. This method is compatible with amine and thiol chemistry, and can handle multiple samples in parallel, manually or using automated platforms.

磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いた蛍光色素で抗体ラベリング

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I molecules also known as cross-presentation (CP). CP plays an important role not only in the stimulation of na&#239;ve CD8+ T cells and memory CD8+ T cells for infectious and tumor immunity but also in the inactivation of self-acting na&#239;ve T cells by T cell anergy or T cell deletion. Although the critical molecular mechanism of CP remains to be elucidated, accumulating evidence indicates that exogenous antigens are processed through endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) after export from non-classical endocytic compartments. Until recently, characterizations of these endocytic compartments were limited because there were no specific molecular markers other than exogenous antigens. The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of these endocytic compartments. Using this purified microsome, we reconstituted the ERAD-like transport, ubiquitination, and processing of the exogenous antigen in vitro, suggesting that the ubiquitin-proteasome system processed the exogenous antigen after export from this cellular compartment. This protocol can be further applied to other cell types to clarify the molecular mechanism of CP.

The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of the cellular compartments where exogenous antigens are processed by endoplasmic reticulum-associated degradation in cross-presentation.

外因性の抗原クロス プレゼンテーション内の小胞体関連分解膜コンパートメントの精製

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

2 光子レーザー顕微鏡を用いた細胞膜修復法

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...