このプロトコルは、細菌分泌複合体の組立機能を特徴付けるのに有用であり、宿主病原体相互作用に必要な分子機構の基本的な理解につながる可能性がある。この技術は、サンプルのネイティブ構造を維持し、無傷の細菌細胞内のタンパク質複合体の可視化を可能にし、見ることができる補完的なアプローチを統合します。細菌分泌系の構造機能関係についての理解を深めます。
この方法は、多種多様な細菌種における他のタイプの分泌系または他の細胞複合体を研究するために適応することができる。生細胞イメージング用のアガロースパッドを作ることから始めます。約30mLの1%低溶融アガロース溶液を水中に調製し、ガラスフラスコで約90秒間マイクロ波で、アガロースが完全に溶解するまで時折渦巻きます。
22×22×0.15mmのガラススライドを25×75×1.1mmガラススライドの端に置きます。次に、もう一方の端に小さいスライドを 2 つ重ねて積み重ねます。溶融アガロースの約1mLのピペットは、2つの上のガラススライドの間の中央スライドに入り、溶融アガロースの上に別の大きなスライドを置き、気泡の形成を避けることを確認した。
スライドを摂氏4度で15分間冷やし、メスまたはカミソリの刃を使ってパッドを小さな正方形にそっと切ります。25×75×1.1mmのガラススライドに両面接着フレームを固定し、スライド上に複数のパッドを置きます。レジオネラ・ニューモフィラの重いパッチを1mLの二重蒸留水に溶かします。
次いで、渦とピペットを2~3マイクロリットルの希釈液をパッドに入れる。58 x 24 x 0.15 mm のカバースリップを接着剤フレームの上にそっと置きます。明視野照明を使用してイメージングするセルを選択します。
次に、顕微鏡のソフトウェアのキャプチャウィンドウで、NDを180に、ビニングを2つずつ調整します。488ナノメートルのチャネルを使用して、サンプルを500〜1000ミリ秒に曝露し、同じパラメータでタグなしレジオネラ肺炎球菌をイメージングして蛍光の特異性を検証します。極性を定量化するには、画像のコントラストを調整して、細菌がはっきりと見えるようにします。
次に、対象領域を拡大し、領域ツールを使用して、0.25 ~1.3 マイクロメートルの長方形を極から始めて細胞質に伸ばし、長方形が細菌の境界内に残っていることを確認します。少なくとも200個の細菌をマークし、分析メニューのマスクボタンに領域を使用してマスクを作成します。マスク統計をクリックし、マスクスコープの下のオブジェクトを選択します。
次に、特徴と強度の下で平均強度と分散をマークします。データをテキストファイルとしてエクスポートし、スプレッドシートアプリケーションを使用して、各細菌の極性スコアを分散と平均強度の比率として計算します。高スループットアプリケーションでは、両面コントラスト顕微鏡を使用してデュアルチャンネル画像を取得します。
細菌が完全に分離されている視野を選択してください。次に、画像の顔チャネルコントラストを、細菌がはっきりと見えるレベルに調整します。デュアルチャンネルイメージを開き、セグメントマスク作成ウィンドウを起動します。
適切なしきい値を調整し、[オブジェクトの定義] ボタンをクリックして最小サイズを 100 ピクセルに調整して、小さなオブジェクトを削除します。[マスクをリファイン]で、[エッジ オブジェクトを削除する]を選択し、互いに隣接するバクテリアのマスクを分離します。融合タンパク質のダイナミクスを定量化するには、画像キャプチャウィンドウを開き、時間経過をマークします。
[時間ポイント数]ボックスに 2 を入力します。目的の蛍光タンパク質を発現するレジオネラ・ニューモフィラの2つの成功した画像を取得します。セルがはっきりと見えるまで、画像のコントラストを調整します。
次に、領域ツールを使用して、少なくとも 400 個のセルの中央に 0.25 0.25 マイクロメートルの正方形を配置します。次に、分析メニューの「マスクする領域」ボタンを使用して、対象となる正方形のマスクを作成します。新しい空のマスクを作成し、ピクセルツールを使用して、少なくとも 25 個のランダムセルのセル領域全体をマークします。
別のマスクを作成し、大きなブラシツールを使用してセル間の領域をマークします。最後に、マスク統計を選択し、マスク 1 のマスク スコープの下でオブジェクトが選択されていることを確認します。[フィーチャと強度] で、平均強度を選択します。
データをエクスポートし、マスク 2 のプロセスを繰り返します。マスク 3 の場合、マスク全体を選択し、平均強度を書き出します。電子凍結造影サンプルを調製するには、摂氏37度で48時間CYEアグラスレプトミズムプレート上のレジオネラ肺炎球菌の重いパッチを成長させます。
水中の細胞を約0.7のOD 600に再懸濁する。次に、コロイド状金粒子を5マイクロリットルの細胞懸濁液の20マイクロリットルに加える。グローは、その上に細胞混合物の穴のあいた炭素グリッドとピペット5マイクロリットルを排出します。
1分間放置します。フィルターペーパーでグリッドをブロットし、重力駆動プランジャー装置を使用して液体エタンで凍結します。スーパーフォルダGFPをレジオネラ・ニューモフィラ染色体に挿入した後、生細胞蛍光顕微鏡を行い、親のスーパーフォルダーGFP陰性株の蛍光シグナルとを比較した。
また、明視野顕微鏡を用いて、特定の蛍光シグナルを有する細胞の割合を調べた。DotBスーパーフォルダGFPを産生した細胞のほんの一部だけが、融合タンパク質の極地局在化を示した。DotB蛍光信号の分布を特徴付けると、極部におけるDotBスーパーフォルダGFPの強度は、サイトゾルの約2倍高いことがわかった。
DotBスーパーフォルダGFP極局所化が完全に組み立てられたタイプ4分泌系に依存しているかどうかを調べるには、野生型の個々の細胞と4種類の分泌系変異体でDotBスーパーフォルダGFPの極性スコアを決定した。実際、DotBスーパーフォルダGFPの極位置は、Dot/ICMシステムが削除されると消失しました。動的パターンは、DotB ATPaseが動的細胞種集団に存在し、後期アセンブリ反応で極局所的なドット/ICM型4分泌系に採用されたことを示した。
高スループットのcryo-ETはDotBスーパーフォルダGFPを発現するレジオネラ肺炎球菌株で無傷の4つの分泌システム装置を可視化するために使用された。細胞の再構成は、細胞エンベロープに埋め込まれた複数のドット/ICMマシンを明らかにした。DotBとスーパーフォルダGFPの全位置決めも、インタクトタイプ4分泌システムマシンに関連して決定された。
3次元サーフェスレンダリングは、スーパーフォルダGFPがドットBヘキサマーの下に配置されていることを示し、細胞質ATPase複合体の基部にディスクとして組み立てる。この手法を試みるときは、画像取得に進む前に、融合タンパク質の安定性とタグ分泌システムの機能性を評価してください。モデリングと適合は、動的パターンと構造密度を解析する方法や、構造構造の構造変化やサブユニットの局所化を評価する効果的な方法です。
この方法は、タイプ 4 のシークレット システム コンポーネントがどのように機能するか、複雑なコンポーネント内でどのように相互作用するか、および異なるサブアセンブリがどのような機能を果たすのかを理解するのに役立ちます。
