この作品は、AMK崔に、NIHの助成金P01のHL108801、R01-HL60234、R01-HL55330、R01-HL079904によってサポートされていました。 S. Ryterはラブレース呼吸研究所から給料のサポートを受けた。

注意：ブリガムアンドウィメンズ病院/ハーバード大学医学部地域での施設内動物管理使用委員会では、次の手順を承認した。 1。盲腸結紮穿刺同じ背景（C57BL / 6）、8〜10週齢の雄性のマウスを使用してください。雌マウスは、敗血症誘発致死に対する男性よりも耐性がある。 8週間以上経過したマウスは、CLP後の生存の点で若いマウスより少ない変数結果を生成します。 N約比較群当たり10匹のマウスが生存分析のために使用されるべきである=。 N = 3-5マウスは、オートファジーアッセイに適しています。 <ol><li>げっ歯類の手術のため適切であるべきである無菌の小さな手術器具（つまり、メス、はさみや鈍い解剖学的鉗子）を使用します。 </li><li>麻酔液を調製：PBSの7.95ミリリットルにキシラジン（AnaSedインジェクション100 mg / ml）を150μlのとケタミン（Ketaset700μlのを追加&#160; CIII、100ミリグラム/ Ml）を。 </li><li>手順の間に無菌状態を確保するために、手袋、フェイスマスク、外科ガウンを着用してください。 </li><li>動物を秤量する。腹腔内注射することによって、それらを麻酔（IP）μL（Gにおける10倍の体重）の用量で、ステップ3に記載されている混合物。例えば、22グラムの重さのマウスについて、麻酔薬の混合物の10x22 = 220μLを管理します。従って、キシラジンおよびケタミンの最終的な用量は、それぞれ、17および80 mg / kg体重である。その麻酔が十分であることを確認し、四肢のない屈曲はつま先のピンチの後に生成されるべきではない（注）。麻酔下ながら、乾燥を防ぐために、目に眼軟膏を使用してください。 </li><li>仰向けに清潔な作業面に動物を配置します。尾と後ろ足が研究者の方に向いている。アルコール（70％エタノール溶液）を用いて、腹部皮膚を消毒注：手術領域を完全に剃毛されるべきである、との接触を介して創傷の汚染を避けるために毛皮。また、最適には、循環温水パッドは、手術中に麻酔したマウスの正常体温を維持するために使用されるべきである。 </li><li>メスを用いて、小さな長手皮膚切開を平行にし、約1cmの正中線を左。腹腔内にまだ浸透しない。最初の切開を拡張するために、小さなはさみを使用してください。 </li><li>腹筋を特定し、腹腔へのアクセスを得るためにそれらを分析。 </li><li>鈍い解剖学的鉗子を使用して、盲腸を特定し、腹膜腔の外に移動。 （これは致命的な出血につながる可能性）腸間膜血管を傷つけないように注意してください。 </li><li>中間グレードの敗血症を達成するために、盲腸の60％を連結する。に等しいまたは盲腸結紮の75％以上は、一般的に低悪性度敗血症に等しいまたは盲腸結紮結果の25％未満のに対し、高品位な敗血症をもたらす。 （これは腸の継続性をブロックすることができる）回盲弁を連結しないように注意してください。 </li><li> αを用いることにより21 Gの針は、結紮に近い1スルーとスルー穿刺（2穴）で盲腸を穿孔。穿孔の方向は、腸間膜から盲腸の対腸間膜側にある必要があります。腸間膜血管を穿刺しないように注意してください。 </li><li>針を外します。静かに2穴を通して開存性を確認するために連結した盲腸を絞る、糞の量が少なく、それらを通して押出されるべきである。 </li><li>腹腔内に連結し、パンクした盲腸を移動します。 注：偽マウスの場合は、ステップ1.10から1.12をスキップしてください。 </li><li>腹部の筋肉組織を閉じるために針をカットして、シルク手術用縫合糸の6-0を使用してください。腹部の皮膚を閉じます針をカットして、シルク手術用縫合糸の6-0を使用してください。 </li><li>熱及び水分補給を交換する1ミリリットル予め温めた（37℃）を注入する生理食塩水を腹腔内処置中に失われた。その蘇生するまで加熱ランプ下マウスを置く（注）。最適には、より安全な加温装置（SU循環温水パッド）などのchが代わりに加熱ランプを用いることもできる。 </li><li>術後鎮痛を達成するためにブプレノルフィン（0.05 mg / kg体重のSC）を注入する注：それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは動物を無人のままにしないでください。完全に回復するまで、外科的治療を受けている動物は他の動物の会社に返却すべきではありません。 </li><li>食料と水に無制限にアクセスして戻ってケージ内の動物を配置します。彼らは（そのような触れたときに移動する障害やチアノーゼなどの臨床徴候によって示される）瀕死になったときにマウスを安楽死されます。彼らは前に安楽死を死ぬことを避けるために、マウスを4時間毎に確認してください。 </li></ol> 2。組織の収穫と固定<ol><li> 4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液を調製：889ミリリットルのPBSに37％のPFAの111ミリリットルを追加。 </li><li> CO 2誘導性昏睡またはケタミン/キシラジンのいずれかを使用して、マウスを犠牲に高用量でolution。 </li><li>清潔な作業面にマウスを固定。それを消毒する70％エタノール溶液を用いて腹部や胸部の皮膚にスプレー。 </li><li>腹部や胸部の皮膚だけでなく、気管領域をカバーする皮膚を除去するために、メスと小さなハサミを使用してください。 </li><li>その周囲の組織（筋肉や結合組織）を除去することで気管を明らかにした。 </li><li>気管の周り（針を切断せずに）縫合糸を配置します。まだそれを締めないでください。 </li><li> 「挿管」気管に小さな末梢静脈カテーテル（20 G）を使用してください。気管涙を避けるために、カテーテル挿入の際には注意が必要です。気管の最大直径がちょうど輪状軟骨の下にあることに注意してください。 </li><li>気管/カテーテルの周りに縫合糸を締めます。気管にカテーテルの唯一のプラスチックカニューレを残して針を外します。針は、プラスチック製のカニューレを挿入するためのガイドワイヤとしてのみ働いた。 </li><li>気管内にプラスチック製のカニューレを固定した後、目を切断するE腹筋、腹部を開き、ダイヤフラムを明らかにした。 </li><li>針を用いて、気胸（胸膜腔への空気の、すなわち挿入）を生成する振動板を穿刺する。肺はその後崩壊しなければならない。 </li><li>小さなハサミを使用して、胸骨（胸骨切開）に沿って切断し、振動板を取り外し、胸郭を削除し、心臓や肺を明らかにした。 </li><li>気管に挿入プラスチックカニューレを通して、30cmのH 2 Oの圧力下でのホルムアルデヒド溶液で肺を固定します。 </li><li>処理まで肺を取り出して、24時間、4％PFAにそれらを配置し、その後、70％エタノール溶液中。 </li><li>心臓、肝臓、腎臓を特定し、削除します。同様にして、処理まで24時間加熱し、続いて70％EtOH溶液中の4％PFAに入れます。 </li></ol> 3。 GFPマウスとGFPスライドの表示<ol><li>ステップ1、および術後の手順で説明するように、GFP-LC3マウスにCLPと偽手術を行うプロトコールのステップ2で説明したようにS。 </li><li>パラフィンに組織（すなわち、肺、心臓、肝臓、腎臓）を埋め込み、シリアル5μmの切片でそれらを切る。 </li><li>パラフィン溶融し、組織が半透明表示されるまで30〜60分間60℃でインキュベートすると、GFP染色の準備ができ、。 </li><li>キシレンまたはキシレン代替物、5分間のキシレン1、キシレン2、キシレン3の標準的な段階的な一連の脱パラフィン後、段階的エタノールシリーズの3分間のインキュベーション：次いで100％、95％、75％、蒸留水ですすぐ。 注：パラフィン、サンプルのバックグラウンドを増加させる組織乾燥を避ける後</li><li> 10〜20分間マイクロ波処理することにより、クエン酸緩衝液（10mMクエン酸ナトリウム酸、0.05％ツイーン20、pHが6.0）を用いて、抗原回復を行う。組織乾燥を避けるために、定期的にバッファを交換するように注意してください。 </li><li>ソリューションは抗原回復を完了するために、ベンチで20分間冷却してください。 </li><li> PBSで2〜3倍を洗ってください。過剰の緩衝液とTRAを削除nsfer乾燥を防ぐために、スライドボックスや他の加湿チャンバー内の水平位置までラックからスライドします。 </li><li> PBS中10％正常ロバ血清（また5％のウシ血清アルブミン、または好ましくは二次抗体が生成された動物由来の血清）を用いて室温で45〜60分間ブロック。 </li><li>加湿チャンバー内で4℃で一晩、PBSで1:100希釈で一次GFP抗体のサンプルをインキュベートする。優しく組織と均質な接触を促進し、蒸発を防ぐために抗体を用いて組織の上パラフィルムの小片を適用します。 注：残りの工程は室温で行われる。 </li><li>過剰の一次抗体を除去し、PBSで5回洗浄します。室温で1〜2時間、PBS中の二次抗体1:500-1:1,000でインキュベートする。 </li><li>過剰の二次抗体を除去し、PBSで5回洗浄します。所望であれば、この段階でスライドを対比染色。 </li><li>蛍光二次抗体を使用した場合、70％エタノールFで0.1％スーダンブラックインキュベートまたは15〜20分は、自己蛍光を低減します。組織の周囲から過剰スーダンブラックを拭き取り、20分かけて、PBSで5回洗浄します。 </li><li>カバーガラスでサンプルをマウントし、マウントソリューションがセットされるまで、水平に保管してください。 </li></ol> 4。代替プロトコル：GFP-LC3の直接検出<ol><li> 50/50 V / 10月のPBS Vの〜500ミリリットルでカニューレを挿入し、膨張させ、肺。 </li><li>クリオモールドの底に10月に少量を入れて10月に埋め込む。 </li><li>金型内で解剖し、肺複合体を慎重に配置します。 </li><li>メチルブタンドライアイスを使って冷やしかけて徐々に凍結する。 </li><li>組織が完全に覆われ、固体凍結されるまで、より多くの10月を追加します。 -80℃のドライアイスや店舗を続ける</li><li>クライオを使用して、光からのセクションを保護する5〜10μmの厚さの切片を切った。店舗のセクションおよび-80℃での残りの組織</li><li> 、イメージングのためのスライドを準備冷凍庫からセクションを削除し、すぐに乾燥を防ぐために、PBSのドロップを適用するには。 </li><li> 4％PFAで30分間固定してください。 PBSで洗浄します。 </li><li> 10分間、DAPI /ヘキストを適用します。 PBSで3回洗浄します。 </li><li>カバーガラスでサンプルをマウントし、マウントソリューションがセットされるまで、水平に保管してください。 </li><li>エピ蛍光または共焦点顕微鏡を用いた画像。最長1ヶ月間、4℃で保存するサンプル。 </li></ol> 5。電子顕微鏡のための組織の準備<ol><li>固定するために約1ミリメートルの立方体に組織を切る。 </li><li> 0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH7.4中の2％ホルムアルデヒド、2.5％グルタルアルデヒドで組織を固定します。 </li><li> 1〜2時間、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で洗浄します。 注：固定組織を4℃で0.1 Mカコジル酸ナトリウム中で保存することができる</li><li> 1時間、0.2Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中の1％四酸化オスミウムで修正を投稿してください。 </li><li> 10分3Xのために、0.2Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で洗浄します。 </li><li> 70％エタノール、20分2Xで脱水。 90％エタノール、10分2Xで脱水。 100パーセントエタノールで脱水、20分2倍。 </li><li> 10分間、2×ためのプロピレンオキシド（エポキシプロパン）でインキュベートする。 </li><li> 1時間酸化プロピレン/エポキシ樹脂混合物（50:50）でインキュベートする。エポキシ樹脂混合物は、次のとおりです。24グラム寒天100樹脂、13グラムドデセニル無水コハク酸、13グラムメチルナジック酸と1ミリリットルのN-ベンジルジメチルアミン。木べらを使って使い捨てビーカーに完全に混合する。 </li><li> （これは、残りのプロピレンオキシドが蒸発することを可能にする）キャップされていないバイアル中で一晩、エポキシ樹脂とインキュベートする。 </li><li>新たに調製した樹脂で標識カプセルに埋め込むことができます。 48時間60℃で重合する。 </li><li>電子顕微鏡フィルム上に80または60 kVの透過型電子顕微鏡を用いて撮影した組織切片。印画紙に画像を印刷するか、などのデジタルメディアを格納。 </li><li>核を含む無傷の細胞におけるオートファゴソームの形成を分析します。低倍率視野の（e。gで 2,000〜4,000 X）は、有核細胞を同定するために使用することができる。典型的には6,800-10,000 X番目の画像は、のために使用されるオートファゴソーム定量化である。適切な統計表現のための15〜30のフィールドから、単位面積あたりのオートファゴソームを数える。オートファゴソームは、後期autophogosomes充填液胞に似ていた二重膜構造を持っています。 </li></ol>

<ol>
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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-{beta}1+protects+against+mesangial+cell+apoptosis+via+induction+of+autophagy.">TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy.</a> J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).</li><li>Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+factors+affecting+mortality+rate+after+sepsis+in+a+murine+cecal+ligation+and+puncture+model.">Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model.</a> Surgery. 94, 331-335 (1983).</li><li>Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+determines+susceptibility+during+murine+septic+peritonitis.">Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis.</a> J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).</li><li>Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. 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著者らは、宣言するために、競合金融利害関係はありません

CLPの主な利点は、（低-中·ハイグレードからIE）異なる重大度の敗血症を調査する研究者を可能にすることである。誘導された敗血症の重症度は、盲腸結紮の長さ（最も重要な決定因子）に影響され、穿刺に使用される針のサイズ及び孔の数が15を行った。また、マウス系統、性別、敗血症の重症度に影響を与えることができる、いくつかの株は、他のものよりも影響を受けや...

敗血症、感染に対する全身性炎症反応は、批判的に、重症患者1における主な死亡原因を表します。最大60％ の2の相当な死亡率を持っていることが多い複数菌敗血症につながる腹腔内感染症、敗血症症例の20％を占め、。敗血症関連死亡率は、主に、その後の臓器不全3,4で多臓器不全に起因する。この病気の発症メカニズムへの追加調査が緊急に新規でより効果的な治療法の開発を促進するために必要とされる。 盲腸結紮穿刺（CLP）法は、 生体内で敗血症をモデル化するための一般的に使用される手順です。盲腸のように、複数菌腹膜炎、血液（菌血症）、敗血症性ショック、多臓器不全への細菌の移動と、最終的には死を5年の穿刺の結果、細菌がいっぱいです。一般的には、CLPが臨床反映していると認められている現実をより正確なげっ歯類へのエンドトキシンあるいは精製された細菌の注射などの従来の技術よりも、このように、CLPは、したがって実験的誘導と、敗血症の発症機序の調査のためのゴールドスタンダード（非制限なくが）6と考えられている。このモノグラフでは、敗血症の発症機序は、オートファジーを含めるかどうかを評価するために設計されたプロトコルを記述します。 オートファジー、進化的に保存された細胞プロセスは、損傷を受けたタンパク質やミトコンドリアなどの細胞小器官のターンオーバーを促進し、細菌7,8を含む細胞内病原体のクリアランスに重要な役割を果たしている。オートファジーの際に細胞質タンパク質または細胞小器官は、その後、分解9リソソームに送られるオートファゴソームと呼ばれる二重膜結合小胞の中に隔離されている。多くのタンパク質は、オートファジー関連遺伝子の哺乳類相同体（ATG）として同定されている、もともとオートファジーの過程を制御する酵母で同定された。微小管関連タンパク質-1軽鎖3B（ホスファチジルエタノールアミン抱合体）-IIをLC3BするLC3B-I（フリー体）から（LC3B）（Atg8のホモログ）の変換は、オートファゴソームの形成9の主要なステップである。オートファジー機能不全は老化と癌や神経変性疾患10を含むヒトの疾患と関連している。さらに、オートファジーは、免疫細胞8による抗原提示、リンパ球の開発、サイトカイン分泌などの自然免疫と獲得免疫に影響を与えます。これにより、オートファジーはまた、感染に対する全身性炎症反応（ すなわち、敗血症における）において役割を果たし得ることが合理的と思われる。 現在までにいくつかの方法は、 インビボでの組織損傷におけるオートファジーの役割を評価するために記載されている。これらは、緑色蛍光タンパク質（GFP）-LC3発現マウスや車の定量化の使用を含む電子顕微鏡による組織内のファゴソーム（これらの2つの方法が、このモノグラフで説明します）。追加の方法は、組織ホモジネートにおけるオートファジータンパク質発現の定量化、および（他の箇所に記載されるように）自食フラックスの解析11-13を含む。このレビューの目的は、実験的敗血症のコンテキストで、生体内でオートファジーを評価するための現在のプロトコルを提供することです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >GFP-LC3 Transgenic Mice</td>
			<td >Riken (Japan)</td>
			<td >RBRC00806</td>
			<td >GFP-LC3#53</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >568-0606</td>
			<td>Xylazine HCl Injection Vet</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >995-2949</td>
			<td>Ketaset Inj 100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A405-20</td>
			<td>Histology Grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A407-1</td>
			<td>For Sterilizatiion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >silk surgical sutures 6-0</td>
			<td >Owens &#38; Minor</td>
			<td >2300-0078OG, 017624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >buprenorphine-HCl</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >614-5157</td>
			<td>Buprenex Ampules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde (37%) solution</td>
			<td >JT Baker</td>
			<td >S898-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >xylenes</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>X3P-1GAL </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP monoclonal antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>G10362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoescht</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>944403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OCT</td>
			<td >VWR scientific</td>
			<td >25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan Black</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-203760</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate</td>
			<td >Electron microscopy Sciences</td>
			<td>15960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >propylene oxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>240397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar 100 resin</td>
			<td >Agar scientific</td>
			<td > R1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>46346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >methylnadic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-benzyldimethylamine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>185582</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice

実験的敗血症は、盲腸結紮および穿刺複数菌による敗血症を引き起こす（CLP）法を用いて、マウスにおいて誘発することができる。ここで、プロトコルは、CLPの技術を用いて、マウスにおいて様々な重症度の敗血症を誘発するために設けられている。オートファジーは、ストレスや病原体の侵入に対する基本的な組織反応である。実験的敗血症のコンテキストで、生体内でオートファジーを評価するには、2つの現在のプロトコルもここで提示されています。 （I）緑色蛍光タンパク質（GFP）-LC3融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスは、CLPに供される。 GFPシグナルの局所的な増強（斑点）、免疫組織化学的アッセイ法または共焦点のいずれかによってアッセイされるように、このようにして、オートファジー経路の改変された活性化を増強オートファゴソームの形成を検出するために使用することができる。 （オートファジー刺激のマーカーとしての）単位面積当たりの組織（II）の強化自己貪食液胞（オートファゴソーム）の形成は、電子顕微鏡を用いて定量することができる。敗血症に対するオートファジー応答の研究が重要であるCOMP組織が感染に反応するメカニズムを理解することのonent。この分野の研究成果は、最終的に救命医療における大きな問題である敗血症の病因を理解に貢献することができる。

菌血症は、CLP誘発性敗血症14の後には早くも6時間などのマウスに存在する。 （悪寒、頻呼吸および損なわれた運動活性を含む）、敗血症の臨床徴候は、処置後、約12時間後に表示されます。 CLPを受けたマウスは、腹膜炎の誘導後約18時間で死に始める。より深刻な、より増加し、敗血症で致死15です。 CLP後7日目で約60％の死亡率のミッドグレードの敗血症の結果は（この時間...

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Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

実験的敗血症は盲腸結紮穿刺（CLP）の方法を用いて、マウスにおいて誘発することができる。 CLP誘発性敗血症の文脈においてインビボでオートファジーを評価するための現在のプロトコルがここに提示されている：（GFP）-LC3マウスを用いたオートファジーを測定するためのプロトコル、および電子顕微鏡法によってオートファゴソームの形成を測定するためのプロトコル。

マウスにおけるオートファジーを研究するためのモデルとして、盲腸結紮穿刺誘発性敗血症

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

cecal-ligation-puncture-induced-sepsis-as-model-to-study-autophagy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.1K ビュー.  Brigham and Women's Hospital. 実験的敗血症は盲腸結紮穿刺（CLP）の方法を用いて、マウスにおいて誘発することができる。 CLP誘発性敗血症の文脈においてインビボでオートファジーを評価するための現在のプロトコルがここに提示されている：（GFP）-LC3マウスを用いたオートファジーを測定するためのプロトコル、および電子顕微鏡法によってオートファゴソームの形成を測...