Name: transplantation of tail skin to study allogeneic cd4 t cell responses in mice
Uploaded: 2014-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice at JoVE.com

This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R. We thank E. Palmer and B.T.H. Hausmann for mice and technical expertise.

このビデオ出版物およびプロトコルでは、すべての動物の手順はカントン当局バーゼルシュタット、スイスで承認された動物プロトコルに従って行った。可能な限り無菌状態ですべての手順を実行します。 外科1。準備<ol><li>使用前にすべての手術器具やガーゼをオートクレーブ。 </li><li>暖かいパッドを加熱して、テーブル（ 材料/方法の表 ）に手術器具を整理します。 </li><li>指ストリップ包帯を開きます。 （ガーゼが完全に覆われていることを確認してください）​​綿棒で創傷パッドの上にワセリンを適用します。 </li><li>マウスの重さおよび鎮痛ブプレノルフィン0.05 mg / kg体重を管理します。注意：これはすぐに移植後鎮痛を提供します。 </li></ol>移植のためのテール皮膚の2。準備<ol><li> CO 2窒息とDあたりのドナーマウス（ 例えば、IA BM12）を安楽死させる切除する前に消毒液で尾をisinfect。 </li><li>きれいなプラスチック板に黒のストライプを下にして尾を置き、中央のライン全体で縦にカットし、スキン層のみが関与する表面的な切開を行う。 </li><li>把持鉗子を使用して、尾から肌をやってのける。 </li><li> 10ミリリットルのHBSSで満たされた10cmの細胞培養皿の中で尾の皮膚を置く。 </li></ol> 3。外科的手技<ol><li>透明インダクションボックスの3％イソフルラン溶液を吸入によってレシピエントマウス（ 例えば、C57BL / 6）を麻酔。注意：マウスは、手術平面麻酔を達成することは3〜5分かかります。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。 </li><li>暖かいパッドの上にマウスを置き、つま先をつまんで、各動物レフ口マスクとロバを経由して1.5％イソフルランを適用します。 </li><li>レシピエントマウスの背側部位（ 例えば、C57BL / 6）を剃るとドライガーゼSWを使用して、汚染の毛を取り除くAB。 </li><li>無菌性溶液で剃毛移植部位を消毒。 </li><li>背の右/中央のサイトにある鉗子で皮膚をつまんで、約1×0.6cmの円形の切開を作るために湾曲したハサミを使用しています。 </li><li>出血が発生した場合は、その後、滅菌綿棒で傷口をきれいに。 </li><li>切開の大きさを評価し、メスを用いて尾部皮膚から推定サイズの移植をカット。 </li><li>移植を丸めるコーナーをトリム。 </li><li>滅菌綿棒で、メス、HBSSの乾燥過剰に移植をロードし、レシピエントマウスの移植床に置きます。 </li><li>ドナーとホストの皮膚の重複を回避し、独占的に接触領域に組織接着剤を適用します。 </li><li>マウスの腰の周りにしわなしに石膏を適用します。 </li><li> （3ミリメートルシフト）は、マウスに石膏を固定するための接着剤の非弾性包帯を適用します。 </li><li>包帯の上腹、サイト内の3ミリメートル程度ハサミで切開する。注：これは、trのを回避することである回復期のマウスの歯のapping。 </li><li>麻酔から口にマスクを外し、目を覚ましまで加熱パッド上に移植されたマウスを保持します。 </li><li>完全に回復した場合にのみケージに移植されたマウスを戻し、包帯がきつすぎるではないことを確実にするために彼らの移動性を評価します。 </li><li>次の手術に進む前に70％エタノールですべての手術器具を滅菌する。 </li></ol> 4。術後ケア<ol><li>飲料水（4 mg / ml）をにパラセタモール含有シロップを追加し、7日のためにそれを管理します。 </li><li>それが回復した後、動物の部屋にマウスを返します。 </li><li>密接に包帯が所定の位置にある時間（1週間）のために、うつ病やその他の行動の変化（食事や不動）、異常な外観（グルーミングの欠如）や姿勢（PILO - 勃起や猫背の姿勢）を含む臨床兆候をマウスを監視します。 </li></ol> 5。包帯除去（6-7日後の移植） <ol><li> Anes透明インダクションボックスの3％イソフルオラン液​​の吸入によるthetizeマウス（上記参照）。 </li><li>動脈ハサミで包帯や絆創膏をカットし、慎重にそれらを削除します。注：移植部位の伸縮を避ける。 </li><li>臨床徴候のために移植されたマウスを監視する（4.3参照）、皮膚移植片（ 表1）の拒絶のために得点。注：グラフ、スコアシステムは、背の皮膚に比べて尾部皮膚に異なる髪のテクスチャを利用しています。移植とその拒絶反応の出現は3等級に分類されている。 C57BL / 6免疫応答性マウスの同種皮膚（MHC IIの不一致、 例えば、アイオワBM12）移植片は、通常12から15日後に移植（自分のデータと、15〜20）内で拒否されます。 </li></ol>

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Evidence for three states of MHC expression with distinct roles for IFN-gamma.</a> Journal of immunology. 155 (10), 4559-4566 (1995).</li><li>Surquin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+deficiency+prevents+eosinophilic+rejection+and+uncovers+a+role+for+neutrophils+in+the+rejection+of+MHC+class+II+disparate+skin+grafts.">IL-4 deficiency prevents eosinophilic rejection and uncovers a role for neutrophils in the rejection of MHC class II disparate skin grafts.</a> Transplantation. 80 (10), 1485-1492 (2005).</li><li>Gaylo, A. E., Laux, K. S., Batzel, E. J., Berg, M. E., Field, K. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

皮膚移植拒絶反応およびT細胞依存耐性を研究するために広く用いられる方法である。皮膚移植モデルが確立されて以来、いくつかの適応および変更が適用されている。記載された手順では、IA BM12尾の皮膚移植が麻酔ガス（イソフルラン）を用いて行われる。ガス麻酔を使用すると、移植されたマウスへのストレスを減少させる実行し、マウスの回復の時間が短縮されます。手順は、耳や背皮膚組織よりも多くをカールする傾向がある、尾の皮膚を修正するために組織接着剤を採用しています。しかもこれがカーリングを軽減し、背側切除部位での尾の皮膚の位置を向上させるようにエッジを切断し、トリミング前の尾の皮膚を平らにすることが重要です。 移植片拒絶または受諾を評価するためには、TRAの得点を容易にするために、移植片の中央に（C57BL / 6マウスでは、例えば ）ブラックストライプと尾の皮膚を準備するために必要である髪質の違いに基づいてnsplants。 MHCクラスIIのIA BM12分子の変異は、排他的に（同じ遺伝的背景の）免疫担当し、免疫不全マウスにおけるCD4 + T細胞を活性化させる。一方で、これは結果の解釈を容易にするが、他方で、それはCD4 + T細胞の調査にメソッドを制限する。 例えば 、他のT細胞サブセット、他のドナーからの尾の皮膚へのT細胞の活性化を拡張するために、IA BM1マウスおよびBALB / cまたはDBAマウスを含む様々な遺伝的背景を含め、同じ遺伝的背景を移植することができる。 急性拒絶反応の研究では、MHCクラスII溝内に天然に存在する突然変異マウスにおける臓器拒絶反応を研究するための同種異系のCD4 + T細胞の活性化から利益を得る。 C57BL / 6マウスに、ほとんどの研究USIと一致している、移植後14日以内に、IA BM12の皮膚移植片を拒絶したIA BM12皮膚移植を、15〜20 ng の 。また、急性拒絶モデルは広く遺伝子欠損マウスからのCD4 + T細胞の同種異系潜在性を試験するために使用される。実際に、IFN-γ - / -マウスは、遅延IA BM12皮膚移植片拒絶（未発表データ及び16）を示した。抗体も同様に遅延した拒絶15,17,18をブロックの投与により、IFN-γをブロックする。これは、Ag提示および内皮細胞（12牧師）上のMHCクラスIIの発現を開始する中でのIFN-γの重要な役割を示している。パーフォリン欠損マウスは、IA BM12皮膚移植片拒絶21を遅らせなかったので、サイトカインの役割は、拒否 ​​の方が重要であると思われる。実際、IL-6の管理は、おそらくIFN-γ産15をダウンレギュレーションすることにより、長期の移植片生存をもたらした。また、好中球はIL-4欠損マウスにおける19 IA BM12の皮膚移植片の拒絶反応において主要な役割を果たすように見える</suP&gt;自然免疫と獲得免疫細胞由来のサイトカインの微調整を示している。この仮説は、マウス20におけるABT-100ブロックサイトカイン分泌や遅延IA BM12移植片拒絶反応を観察することによって強化される。免疫応答性マウス（未発表データ）中の抗CD3抗体の遅れIA BM12皮膚移植片拒絶を投与。 - / -およびRAG2 - / -マウスは、最大100日間、同種皮膚移植片を受け入れるまた、我々は、T細胞欠損CD3εことを示した。これらのマウスにおける寛容を容易に戻すことができ/免疫応答性C57BL / 6マウス由来のCD4 + T細胞の養子移入によって破壊した。 2×10 4個の CD4 + T細胞または抗原特異的ABM細胞の移動は、14日目の周りIA BM12移植片拒絶反応を誘導するのに十分である。単離さVα2Vβ8陽性ABM細胞は、しかしながら、拒絶反応の前にリンパ節に大規模な増殖およびIFN-γ産生を示した拒絶反応は、I-Abm12エクスプレスに依存していた皮膚移植におけるイオン。 要約すると、このマウスモデルは、拒絶または耐性の間の低T細胞数の活性化を研究するための優れた方法である。尾皮膚移植は実行が容易であり、重篤な生理学的効果を招くことなく、T細胞の同種異系応答を研究するために、異なる遺伝的背景を有するマウスに適用することができる。また、このモデルは、皮膚移植寛容を誘導するか、または壊す化学的および生物学的物質との介入のための理想的です。

このような皮膚、心臓、腎臓などの固形臓器の移植は現在、世界の医療行為1の標準的な手順である。正常に移植された臓器は、ドナーの主要組織適合性抗原を認識するレシピエントの免疫系の活性化によって拒絶することができる。このため、移植患者は免疫抑制剤2を用いた治療を必要としています。マウスでの同種皮膚移植は1955年にメダウォアらによって設立され、後に主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIおよびIIとして記述対象となる分子を同定するために有用だった。それ以来、皮膚移植モデルを連続的に変更され、T細胞サブセットの役割および移植片拒絶2-4を抑制するのに化学的および生物学的介入の関連性を研究するために適合されている。耳とトランクから肌を準備するのがより困難であると尾の皮膚5よりも低酸素症や壊死を受けやすい。しかし、移植手順は同様である。また尾の皮膚移植のモニタリングは、皮膚の特徴的な髪の質感が容易です。 この記事では、CD4 + T細胞媒介同種移植片拒絶およびマウスにおける寛容の様々な側面の研究を可能にし、MHCクラスIIミスマッチ尾皮膚移植のための詳細な手順を提供します。 （IA BM12と呼ばれる）MHCクラスII分子IA b は6-9の天然の三点突然変異は、C57BL / 6マウス8における皮膚同種移植片の拒絶反応を誘導するのに十分である。 IAのBM12分子は、種々のαβ-T細胞受容体Vα2Vβ8-TCR特異的T細胞は、TCR-トランスジェニックマウス10を生成するために、同定され、そのうちC57BL / 6マウスからの（TCR）の鎖を用いてCD4 + T細胞を活性化する。 Vα2Vβ8-TCR特異的T細胞の養子移入は、免疫不全C57Bに拒絶モデルを確立するために使用されているL / 6 RAG2 - / - IA BM12皮膚を移植したマウス。 ドナーとレシピエント間の遺伝的差異は、移植受容と拒絶の結果に影響を与える。移植の異なる種類があります。自家移植は、レシピエント個体自体からの移植である。 syngraftsおよび同種移植片は、それぞれ遺伝的に同一と遺伝的に無関係な個人からの移植である。別の同種臓器移植の受け入れは、患者とマウスモデル11,3,4における化学的および生物学的介入によって実証されている。基本的なアプローチでは、抗CD3抗体で処理したC57BL / 6マウスIA BM12尾皮膚（未発表データ）の生存期間の延長を示した。レシピエントマウスにおける移植の前にCD4 +およびCD8 + T細胞の枯渇は、MHCクラスIおよびIIミスマッチ移植片（12改訂）の受入れをもたらした。興味深いことに、皮膚移植片の拒絶反応は、CD4 +の存在に依存する</sup&gt; T細胞（12牧師）。このモデルでは、調節性T細胞と抗体または抑制との共刺激分子を遮断することによって、異なる免疫細胞間の特異的相互作用を標的とする（未発表データ）寛容を誘導し得る。実際、CD40およびCD28の両方を遮断することは、長期的な皮膚同種移植片寛容13,14につながった。 尾の皮膚移植は他の臓器の移植に比べて実行​​が容易であり、監視が容易です。また、尾の皮膚移植は、調製が容易であり、他の皮膚組織よりも虚血を受けにくい。注入された麻酔薬とは対照的に、移植時の麻酔ガス（イソフルラン）の使用は、プロシージャおよび受信者の回復時間の両方を短縮します。不完全な創傷治癒および移植片拒絶につながる可能性尾皮膚移植のカールは、組織接着剤の適用によって防止される。さらに、IA BM12尾皮膚移植モデルでは、排他的に、CD4を活性化させる<sup&gt; +（同じ遺伝的背景の）免疫応答性および免疫不全マウスの両方においてT細胞は、結果の解釈を容易にする。 このプロトコルは、化学的、生物学的な介入を可能にし、信頼性の高い再現性があり、容易に監視マウスモデルを説明しています。モデルは、尾の皮膚移植の拒絶と寛容の誘導を調査対象としています。

<table><tbody><tr><td>Betadine standard solution</td><td>Mundipharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton swab</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>31025060</td><td></td></tr><tr><td>Dafalgan , UPSA</td><td>Bristol Myers Squibb UPSA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hansaplast finger strips</td><td>Beierdorf AG</td><td>REF.76861</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl tissue adhesive</td><td>Braun</td><td>REF.1050052</td><td></td></tr><tr><td>Leukotape classic , 2 cm x 10 m</td><td>BSN Medical SAS</td><td>REF.02204-00</td><td></td></tr><tr><td>PBS, Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010015</td><td>GIBCO</td></tr><tr><td>Sterile gauze, 5 x 5 cm, 8 ply</td><td>MaiMed GmbH</td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>Narrow pattern forceps</td><td>FST</td><td>11003-12</td><td></td></tr><tr><td>Fine iris scissor curved</td><td>FST</td><td>14095-11</td><td></td></tr><tr><td>Fine iris scissor</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Mayo scissors</td><td>FST</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Artery scissors ball tip 11.5 cm</td><td>FST</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps</td><td>FST</td><td>11021-14</td><td></td></tr><tr><td>Surgical blade No. 20</td><td>Swann-Morton LTD</td><td>3006</td><td>Carbon steel</td></tr><tr><td>Surgical blade handles</td><td>Swann-Morton LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 1 ml</td><td>ARTSANA</td><td></td><td>Disposable</td></tr><tr><td>Temgesic, buprenorphine</td><td>ESSEX Chemie AG</td><td></td><td>0.3 mg/ml</td></tr><tr><td>Tissue Culture dishes 10 cm, 60.1 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Vifor SA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warm pad</td><td>Solis</td><td></td><td>Type 223</td></tr></tbody></table>

transplantation of tail skin to study allogeneic cd4 t cell responses in mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

最初のアプローチで、C57BL / 6マウスのIA BM12同種移植片およびIA B型syngraftsを移植した。包帯除去後の、C57BL / 6マウス（ 図1A）における接触ゾーンの閉鎖せずに移植片、創傷治癒の徴候をマニフェスト。 syngraftsながら包帯を除去した後、CD4 + T細胞媒介炎症は、移植後13日以内に、C57BL / 6マウス（キャラクターいっぱい図1B-C）で壊死領域（赤い斑点）の外観およびIAのBM12の同種移植片の拒絶反応につながった最大100日間（ 図1B-C、白抜きの記号）のために許容された。これらのデータは、免疫応答性C57BL / 6マウスにおけるIAのBM12移植片の急性拒絶反応の進行を示している。 種々の研究は、MHCクラスIIミスマッチ尾の皮膚の拒絶反応が同種異系CD4 + T細胞（12改訂）の存在に依存することを実証している。確かに、T細胞欠損CD3ε - / - &lt;/ SUP&gt;マウスおよびT-およびB-細胞が欠損RAG2 - / -マウスは、完全な創傷治癒を示し、C57BL / 6マウス（ 図2）13日以内に移植片を拒絶し、一方、IA BM12は 、100日（ 図2）までグラフト耐容。 IA BM12ミスマッチ尾の皮膚の受容は重篤な疾患の病理のないマウスモデルにおいて、同種CD4 + T細胞およびそれらのエフェクター機能の研究を可能にする。 - / -およびRAG2 -確立されたCD3εにおける寛容を破壊する/ -マウスは、CD4 + T細胞を養子移入した：2×10 4ポリクローナルC57BL / 6 CD4 + T細胞（14日以内IAのBM12移植片の拒絶反応を誘導するのに十分であったデータは示さず）。 - / - 50,000〜100,000 C57BL / 6 CD4 + T細胞の移入は、CD3εにおける移植片拒絶反応プロセスを加速せず、RAG2 - / -マウス。これらのデータは、allogenの役割を強調する急性皮膚移植片拒絶モデルにおけるEIC CD4 + T細胞。 この尾の皮膚移植モデルの利点は、CD4 + T細胞の機能解析を容易に抗原特異的CD4 + T細胞の養子移入することによって行うことができることである。トランスジェニックマウスABM 9は 、非特異的CD4 + T細胞の影響を受けることなく、活性化および集団の表現型の挙動を描写するための理想的なツールと考えられている。 13日間（ 図3A-B）内- / -マウス2×10 4個の抗原特異的ABM細胞の移動は、RAG2におけるIAのBM12移植片の拒絶反応を誘導するのに十分であった。また、ABM細胞は、単離が容易であり、Vα2Vβ8-TCR鎖（ 図3C）の式を用いて追跡することができる。 - / -マウスを調べたRAG2移植IA BM12におけるサイトカインのABM細胞増殖および生産。 ABM細胞が増殖しextensieFluor670希釈アッセイ（ 図3D）によって決定され、ABM細胞の最大30％が、PMA刺激（ 図3E）の際のIFN-γを産生しvelyとして。 まとめると、これらのデータは、比較的少数の同種異系CD4 + T細胞は最小限の重度の病状を有する同種異系T細胞の分析のために、この理想的なモデルをレンダリングする、IA BM12の皮膚移植片の拒絶反応を誘導するために必要とされることを示している。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51724/51724fig1highres.jpg" width="500" /> 図1。同種と同系尾の皮膚を用いたマウスの移植。 （A）C57BL / 6マウスを、同種異系（IA BM12）および同系（IA b）は尾部皮膚た（n = 5群）を移植した。写真は、7日目に包帯を除去した後（右）の同種移植片（左）とsyngraftsを示す。（B）スコア、および（C）拒絶または最終的なモニタリングの日まで7日目からの皮膚移植片の生存（100日目）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51724/51724fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51724/51724fig2highres.jpg" width="400" /> 。図2は、同種移植片マウスにおけるT細胞の不在下で許容されるの生存RAG2 - / - IA BM12 - C57BL / 6マウスに移植した皮膚移植片、CD3ε - / -およびRAG2 - / -マウス（n = 4-6グループごと）および拒否され、受け入れられた移植片の図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51724/51724fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in"SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51724/51724fig3highres.jpg&quot;幅= &quot;500&quot; /&gt; 。図3抗IA BM12特異的CD4 + T細胞は増殖し、移植片拒絶の間、IFN-γを産生する（A）スコアおよびIA BM12尾の皮膚RAG2における移植片の（B）生存- / -マウス（n = 5）養子2×10 4個の抗原特異的ABM細胞を移した。ABMの増殖細胞のトランスABMマウスのリンパ節から単離されたABM細胞（C）Vα2Vβ8染色。（D）eFluor670希釈液との（E）IFN-γ産生PMA- - / - IA BM12の皮膚のリンパ節から分離ABM細胞が移植されたRAG2刺激した。養子ABM細胞移入後9日目マウス（n = 5マウス） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51724/51724fig3highres.jpg" target="_blank">には、ここをクリックしてください。</a>この図の拡大版を表示します。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="569"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:84px;">グラフトスコア</td><td style="width:485px;">説明</td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 3 + </td><td>赤いエリアはなく、光沢のある黒のストライプの存在</td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 2 + </td><td>小さな赤い領域の外観、光沢のあるブラックストライプや乾燥の損失</td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 1 + </td><td>大きな赤い部分の見え方、黒いストライプと収縮</td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 0 </td><td>移植片拒絶は、80％の壊死のように定義</td></tr></tbody></table> 表1。グラフトスコアシステム。移植とその拒絶反応の出現はケイトですテールと背皮膚に異なる髪のテクスチャを利用して、3グレードでgorized。

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Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

マウスにおける同種のCD4 T細胞応答を研究する尾皮膚の移植

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.5K ビュー.  University of Basel and University Hospital Basel. Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

ビデオ: Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. The aim of this video-article is to provide the viewer with a step-by-step visual demonstration of skin transplantation using the mouse model. The protocol is divided into 5 main components: 1) harvesting donor skin; 2) preparing recipient for transplant; 3) skin transplant; 4) bandage removal and monitoring graft rejection; 5) helpful hints. Once proficient, the procedure itself should take &lt;10 min to perform.

Allogeneic skin transplantation is a standard model to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. This video-article provides a visual tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&gt;C57BL/6 skin transplant.

マウス皮膚移植

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

生物学

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

免疫・感染学

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in eradicating cancerous cells. However, the origins and replenishment of tumor antigen-specific CD8+ T cells within the tumor microenvironment (TME) remain obscure. This protocol employs the B16F10-OVA melanoma cell line, which stably expresses the surrogate neoantigen, ovalbumin (OVA), and TCR transgenic OT-I mice, in which over 90% of CD8+ T cells specifically recognize the OVA-derived peptide OVA257-264 (SIINFEKL) bound to the class I major histocompatibility complex (MHC) molecule H2-Kb. These features enable the study of antigen-specific T cell responses during tumorigenesis.
Combining this model with tumor transplantation surgery, tumor tissues from donors were transplanted into tumor-matched syngeneic recipient mice to precisely trace the influx of recipient-derived immune cells into transplanted donor tissues, allowing the analysis of the immune responses of tumor-inherent and periphery-originated antigen-specific CD8+ T cells. A dynamic transition was found to occur between these two populations. Collectively, this experimental design has provided another approach to precisely investigate the immune responses of CD8+ T cells in TME, which will shed new light on tumor immunology.

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Here, we present a tumor transplantation protocol for the characterization of tumor-inherent and periphery-derived tumor-infiltrated lymphocytes in a mouse tumor model. Specific tracing of the influx of recipient-derived immune cells with flow cytometry reveals the dynamics of the phenotypic and functional changes of these cells during antitumor immune responses.

マウスにおける腫瘍浸潤CD8+ T細胞の動態を評価するための腫瘍移植

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

がん研究

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Murine Full-thickness Skin Transplantation

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited application to humans, skin transplantation in mice has been widely employed for transplantation research. The procedure is easy to learn and perform, and it does not require delicate microsurgical techniques nor extensive training. Moreover, graft rejection in this model occurs in a very reproducible immunological reaction and is easily monitored by direct inspection and palpation. In addition, secondary skin transplantation with donor-matched or third-party skin grafts can be performed on more complex transplant models as an alternative and uncomplicated method to assess donor-specific tolerance. The complications are low and are in general limited to anesthesia overdose or respiratory distress after the procedure. Graft failure, on the other hand, occurs commonly as a result of poor preparation of the graft, incorrect positioning in the graft bed, or inappropriate placement of the bandage. In this article, we present a protocol for full-thickness skin transplantation in mice and describe the important steps necessary for a successful procedure.

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established model to study rejection in an alloimmune setting. Here, we provide a tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&#62;C57BL/6 full-thickness skin transplant.

マウス全層皮膚移植

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research. 
Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

This novel model for orthotopic hind limb transplantation in the mouse, applying a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis, provides a powerful tool for in&#160;vivo mechanistic immunological research related to vascularized composite allotransplantation (VCA).

マウスで同所後肢移植

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

医学

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying the mechanisms of normal and malignant hematopoiesis and are the gold standard for identifying effective chemotherapies for many malignancies. PDX models are possible because many of the mouse cytokines also act on human cells. However, this is not the case for all cytokines, including many that are critical for studying normal and malignant hematopoiesis in human cells. Techniques that engineer mice to produce human cytokines (transgenic and knock-in models) require significant expense before the usefulness of the model has been demonstrated. Other techniques are labor intensive (injection of recombinant cytokine or lentivirus) and in some cases require high levels of technical expertise (hydrodynamic injection of DNA). This report describes a simple method for generating PDX mice that have exogenous human cytokine (TSLP, thymic stromal lymphopoietin) via weekly intraperitoneal injection of stroma that have been transduced to overexpress this cytokine. Use of this method provides an in vivo source of continuous cytokine production that achieves physiological levels of circulating human cytokine in the mouse. Plasma levels of human cytokine can be varied based on the number of stromal cells injected, and cytokine production can be initiated at any point in the experiment. This method also includes cytokine-negative control mice that are similarly produced, but through intraperitoneal injection of stroma transduced with a control vector. We have previously demonstrated that leukemia cells harvested from TSLP-expressing PDX, as compared to control PDX, exhibit a gene expression pattern more like the original patient sample. Together the cytokine-producing and cytokine-negative PDX mice produced by this method provide a model system that we have used successfully to study the role of TSLP in normal and malignant hematopoiesis.

Described here is a method for producing exogenous cytokine in patient-derived xenograft (PDX) mice via weekly intraperitoneal injection of a cytokine-transduced stromal cell line. This method broadens the utility of PDX and provides the option for transient or sustained exogenous cytokine delivery in a multitude of PDX models.

サイトカイン形質導入ストローマ細胞株注入による患者由来異種移植片における外因性サイトカインの発現

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to eradicate tumors. However, its application is limited by the development of graft-versus-host disease (GVHD), a major complication of BMT. GVHD is evoked when T-cells in the donor grafts recognizealloantigen expressed by recipient cells and mount unwanted immunological attacks against recipient healthy tissues. Thus, traditional therapies are designed to suppress donor T-cell alloreactivity. However, these approaches substantially impair the GVL effect so that the recipient&#39;s survival is not improved. Understanding the effects of therapeutic approaches on BMT, GVL, and GVHD, is thus essential. Due to the antigen-presenting and cytokine-secreting capacities to stimulate donor T-cells, recipient dendritic cells (DCs) play a significant role in the induction of GVHD. Therefore, targeting recipient DCs becomes a potential approach for controlling GVHD. This work provides a description of a novel BMT platform to investigate how host DCs regulate GVH and GVL responses after transplantation. Also presented is an effective BMT model to study the biology of GVHD and GVL after transplantation.

Graft-versus-host disease is a major complication after allogeneic bone marrow transplantation. Dendritic cells play a critical role in the pathogenesis of graft-versus-host disease. The current article describes a novel bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in the development of graft-versus-host disease and the graft-versus-leukemia effect.

移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Adoptive Cell Transfer: Introducing Donor Mouse Splenocytes to a Host Mouse and Assessing Success via FACS

Source: Meunier Sylvain1,2,3, Perchet Thibaut1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3 
1 Unit for Lymphopoiesis, Department of Immunology, Pasteur Institute, Paris, France 
2 INSERM U1223, Paris, France 
3 Universit&#233; Paris Diderot, Sorbonne Paris Cit&#233;, Cellule Pasteur, Paris, France 
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, France
Adoptive cell transfer is a method for introducing cells into a patient or study organism in order to treat a disease or study a biological process, such as haematopoiesis. Aims of adoptive transfer are various; it can be used in fundamental biology as well as in medical sciences (1, 2). In mouse models, migration and distribution of transferred cells can be studied and followed by a tracking system (cell surface marker, staining by CFSE, etc.). In cancer studies on mouse models, transfer of specific cell populations can be used as experimental treatment against tumors. Another example for this technique is creation of chimeric mice by transfer of bone marrow cells to irradiated mice or mice with a severe immunodeficiency phenotype. This mouse model can be used to assess the impact of gene deletion on a specific cell population for instance. Transfer of bone borrow cells is also used in human medical treatment. When patients are irradiated in case of cancer therapy, adoptive transfer of bone marrow allows immune system reconstitution.
The first step in this technique is to obtain the cell population of interest. The technique chosen to isolate this population depends on the level of specificity of the targeted population. The largest level of selection is the whole organ, in which all cell populations present in the organ are taken. A more precise method is selection of a target cell population, often selected by one cell surface marker. The ideal method to sort cells in this case is by magnetic sorting. Finally, the most stringent level is the selection of cells by several cell surface markers to sort very specific cell populations. Flow cytometry sorting is the most popular method for this level of selection. Once population of interest is obtained, it can be transferred to the host. Before adoptive transfer it is essential to ensure compatibility between host and donor. Indeed, regardless of transfer goal, compatibility is crucial to assure cells adoption by the host without cells rejection.
In this lab exercise, we demonstrate the adoptive cell transfer technique by transferring splenocytes from a CD45.2 mouse into a CD45.1 Rag&#947;c mouse (lacking lymphocytes) and four days later confirm the splenocytes transfer using flow cytometry (see Figure 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10504/10504fig1.jpg" /> 
Figure 1: Schematic representation of adoptive transfer. (1) Splenocytes are isolated from CD45.2 mice and (2) transferred in CD45.1 Rag&#947;c mouse, control mouse is injected with PBS only. (3) 4 days after adoptive transfer, splenocytes are recovered from mice and (4) analyzed by flow cytometry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10504/10504fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

マウスにおける同種のCD4 T細胞応答を研究する尾皮膚の移植

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マウス皮膚移植

移植片対宿主病の誘導および

マウスにおける腫瘍浸潤CD8⁺ T細胞の動態を評価するための腫瘍移植

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

マウス全層皮膚移植

マウスで同所後肢移植

サイトカイン形質導入ストローマ細胞株注入による患者由来異種移植片における外因性サイトカインの発現

移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム

養子細胞移植:宿主マウスへのドナーマウス脾細胞導入とFACSによる成功評価