多微生物敗血症のセカールスラリーモデルは、ユニークな新生児病態生理を解剖するための強力なツールです。これは可変であり、人道的エンドポイントは十分に記述されていません。ここでは、cecalスラリーを調製し、実験動物に注入するための高度に標準化された手順を提示します。
さらに、データ駆動型アプローチを使用して、できるだけ早い時点でモリバンドの子犬を特定します。冷凍セカールスラリーストックを準備してみましょう。これは、少なくとも5匹の成体マウスからcecalの減少をプールし、無菌デキストロース水で懸濁し、後で使用するためにマイナス80で貯蔵することによって行われる。
男性や女性を使用できますが、実験のためにマウスの性別、年齢、背景を一定に保つ必要があります。まず、解剖のためのツールを準備しましょう。これらには、皮膚用のハサミと鉗子のセットと内臓のための第2セットが含まれる。
使用前に少なくとも30分前にホットビーズの殺菌剤をオンにします。70%エタノールにツールを浸し、少なくとも1分間ホットビーズ滅菌器に浸します。70%エタノールでペーパータオルのマットをスプレーし、他のツールの非滅菌ハンドルにツールの滅菌部分に触れることなく、滅菌装置からツールを取り外します。
ペーパータオルの上に置いて冷まします。生物学的安全キャビネット内のマウスを解剖する。マウスの足を23本のゲージ針を使用して発泡スチロールボードにピン留めし、マウスが腹部を上がるようにします。
腹部に70%エタノールを吹き付けます。滅菌鉗子とはさみを使用して、皮膚を切り抜き、はさみで腹膜内層から皮膚を緩め、鼠径部から胸骨、左右に長方形の領域を切り開きます。腹周りの毛皮を取り除く。
腹部を切り抜ける新しい無菌ツールのペアに切り替え、長方形の開口部を作ります。体全体で左右に実行する必要があります、cecumを識別します。結合組織を破壊して腸からセカムの枝を識別し、腸から離れてセカムを切断します。
計量紙の滅菌シートの上に置きます。滅菌ツールを使用して、セクカムの両端を切断します。鉗子でセカムの真ん中を保持し、平らな金属のへらを使用して、転がり運動を使用してセカールの内容物を端部から静かに押し出します。
内容物を収集し、あらかじめ計量した15ミリリットルの遠心管に入れ。最大5匹のマウスから同じチューブにセカール内容物をプールします。すべての内容が追加されたら、再度チューブの重量を量ります。
各チューブのセカール内容物に添加するデキストロース水の量を計算するには、チューブ内のcecal内容物の重量をミリリットル当たりのミリグラム単位で必要な濃度で割ります。セカール内容物の再懸濁のために氷の上にデキストロース水のアリコートを保管してください。cecal内容物を含む15ミリリットルの遠心管に必要量のデキストロース水を加えます。
チューブを垂直および水平に約30秒間渦を出します。直径数ミリメートルにわたって粒子状の存在を観察し、存在する場合は、すべての粒子が目に見えて消えるまで渦を続けます。50ミリリットルの遠心分離管を氷の上に置いて濾液を採取し、無菌70マイクロメートルセルストレーナーを上に取り付けます。
ピペット4ミリリットルの再懸濁ススラリーを、細胞ストレーナーの上に1本の15ミリリットルチューブから回収管に入れた。粒子を上下に2~3回ピペットして再中断する。気泡を軽く押し出して、フィルター処理される液体がなくなるまでピペットチップで内容物を攪拌しながら、濾過速度を上げます。
これには約 30 秒かかります。セカールスラリーの各チューブ間のセルストレーナーを変更しますが、すべての内容物を同じ50ミリリットルのコレクションチューブにプールします。あなたのストックが40ミリリットルを超える場合は、15秒間ボルテックスし、新しい遠心管に20ミリリットルを入れます。
スラリーを500マイクロリットルアリコートの極低温バイアルに分けます。3つのバイアルの間のスラリーを渦。マスターストックを氷の上のバイアルに入れておいてください。
マイナス80でアリコートを貯蔵することにより、セカールスラリー製剤中の有酸素コロニー形成ユニット濃度は6ヶ月の期間にわたって変化しない。セカールスラリーが準備できたので、体重調整されたセカールスラリーの用量で7〜8日齢のマウスのごみに挑戦するためにそれを使用することができます。スラリーの致死性は用量依存性である。
新しい線量滴定を持つすべての新しいストックのためのあなたの施設で所望の致死量を決定する必要があります。.1リットル当たり1つのセカールスラリー注射アリコートが用意されている。接種を100マイクロリットルの体積に正規化し、ごみ中の動物ごとに最も近い10マイクロリットルに丸めます。
チャレンジアリコートを準備するには、3つの計算、必要なスラリーストックの量、デキストロース水の追加量、およびごみ内の各子犬の丸みを帯びた体積が必要です。各計算の実行方法の詳細は、プロトコルのセクション 3 にあります。これらの計算をすべての実験に手作業で行うと時間がかかり、実験エラーに寄与するため、在庫濃度、所望の線量、ごみの重量を入力するプロトコルと一緒にスプレッドシートをダウンロードすることができ、スラリーストックの量、デキストロース水の量、および子犬あたりの実際の体積が自動的に返されます。
このシートを印刷して、動物に挑戦する準備ができたら持って行くことができます。生物学的安全キャビネットに注射アリコートを準備し、氷の上に保管してください。注射器をロードする前に、マイクロ遠心チューブを20回フリックして混ぜます。
子犬は28ゲージのインスリン注射器で挑戦されます。スラリーを描画する前に、マイクロ遠心チューブの中および外に挑戦アリコートの300〜500マイクロリットルを刺激し、排出することによってアリコートを混ぜます。その後、チャレンジアリコートの約150マイクロリットルを引き上げる。
これは、任意の7〜8日の古い子犬のための注入量よりも大きくする必要があります。スポイターから泡を取り除くために注射器をフリックし、任意の気泡を排出するために注射器にわずかに引き戻します。このプロセス中に針やプランジャーシャフトに触れないでください。
マウス用のセカールスラリーの計算量がシリンジにロードされるまで、余分なセカールスラリーをマイクロ遠心チューブに戻します。セカールスラリーは腹腔内注射で投与される。あなたの動物のケア機関でプロトコルに従ってこれを実行します。
漏れを最小限に抑えるために、下向きに子犬を傾け、脚と生殖器の間に針を挿入し、針を浅く皮下に保ちます。約1センチメートルの針を挿入した後、下に押して、針が腹骨を穿刺するのを感じるまで前進し、その後ゆっくりとプランジャーを押し落とします。あなたが入ったのと同じルートに従って針を慎重に引き出し、あなたがそうするように中指をリラックスさせます。
ラボノートブックの漏れに注意し、最終結果からかなりの漏れがある動物を省略することを検討してください。このセクションでは、多微生物敗血症に挑戦したマウスとそれに対応する人道的エンドポイントで観察するさまざまなレベルの健康を概説します。新生児マウスを含む任意の手順のために、我々は新しいケージに寝具材料を転送します。
これはあなたの手袋にダムの匂いを転送し、彼女のケージに繰り返し入り込むからダムのストレスを軽減します。私たちは、手順の終わりまで監視された子犬を保持するために、またはゴミ全体がダムのケージに戻る準備ができているときに監視するために、新しいケージに第二の巣を作ります。背中にマウスを置き、4秒以内に右に機能することを監視します。
それが正しい場合は、さらに8秒待ってモビリティのレベルを決定します。挑戦されていないマウスや回復中のマウスは、多くの場合、複数のステップを連続して実行することで、その環境を正しく探索できます。自分自身を右にし、権利無気力としてその環境を探索するためにいくつかのステップを踏むことができるマウスを再グループ化します。
これらのマウスは、一歩を踏み出している間に転倒し、足が不安定に見える可能性があります。右にすることができず、水平から90度を超える股関節の動きを持つマウスは、右移動に失敗するようにグループ化します。このマウスは最終的に正しいが、4秒以内にすることはできません。
その股関節の動きのために、それは右移動に失敗するようにグループ化されています。右にすることができず、水平から90度以下の股関節の動きを持っていた子犬は、右無気力に失敗するようにグループ化されます。これは、腰が水平から90度を超えないと右無気力に失敗するようにグループ化されているマウスの別の例です。
右非移動性の子犬に失敗すると、揺れたり振動したりする可能性がありますが、股関節の動きがない脚があります。手足は伸び、引っ込む可能性がありますが、横方向の動きはありません。子犬は目に見えて病気で、人道的なエンドポイントに達しています。
これは、右の非移動型子犬に失敗する別の例です。その腰は左から右に揺れないが、その足は振動する。ダムのケージを扱うとき、授乳ダムが実行された場合、子犬は巣から引きずり出すことができます。
私たちはこれらを置き換え、巣の仲間から離れている他の散らばった子犬をチェックします。これらの散乱した子犬が右無気力に失敗した場合、彼らは人道的なエンドポイントにあります。ここでは、敗血症モデルのカプランマイヤー生存曲線です。
モニター・タイム・ポイントは、接続された SOP にあります。生存曲線に沿った任意の時点で、マウスが右非移動に失敗していることが判明した場合、それは人道的なエンドポイントにあり、安楽死させる。チャレンジ後12~21時間の間に、マウスは病気に見え、マウスの約半数は片側で右に行くことができ、残りの半分は両側のどちらかの側に失敗する。
これは、マウスが健康スコアを脱線し始め、右非移動に失敗する人道的エンドポイントに到達する時間枠です。これらは、この時間枠で観察された健康スコアの代表的な結果です。生存者グループと非生存者グループは、現時点では、健康状態スコアに基づいて差別化することはできません。
この疾患段階では、チャレンジ後21〜48時間で、人道的エンドポイントの割合が最も高い。また、両側に正しく機能できないマウスの大半は病気から回復せず、正しい非移動基準に加えて人道的エンドポイントの新しい基準となることも観察しました。この病気の段階で観察された健康スコアは、生存者を非生存者から分離した。
両側に右にすることができなかったマウスの大半は、病気から回復しませんでした。このデータは、挑戦後21時間から始まる人道的エンドポイントの新しい基準は、両側に正しく失敗したマウスを安楽死させるべきであることを支持する。48時間以上の挑戦後、多くのマウスは、より多くの活性とより良い右反射を表示し始めるでしょう。
この期間に人道的エンドポイントの割合が低いにもかかわらず、マウスはまだ脱線して病気になる可能性があり、人道的エンドポイントの監視が必要です。この時間枠の間に、最終的に非生存者としてグループ化されたマウスのいくつかは、ある時点で活性が増加したが、後に悪化し、人道的エンドポイントに達した。これは、彼らが悪い健康結果を表示し始める場合、頻度の増加と病気の動物の継続的な監視を必要とします.
対人訓練を受け、この教育ビデオのみを観察する独立した実験者は、記録されたテストビデオを使用して調査官と同じスコアを割り当てる能力でテストされました。この説明ビデオは正確な行動分類をもたらす。人道的エンドポイントの尺度である右非移動性新生児マウスに正しいスコアを割り当てる能力は、60の新生児マウスのうち決定され、行動の平均97%が正確に区別され、誤認されたのはわずか3%であった。
次に、右に失敗した新生児マウス、または4秒以内に右にできた新生児マウスを分化する能力をテストした。これは人道的エンドポイントのもう一つの尺度であり、新生児マウスの97%で正確に割り当てられ、子犬の3%は誤って権利として割り当てられていた。ここでは、マウスの挑戦時間と比較した体重変化率の代表的な結果を示します。
生存者と非生存者の間の平均体重変化は、挑戦後24時間で分離し始めたが、グループ間には多くの重複がある。20%以上の体重を失ったが、まだ病気から回復した生存者がいました。体重の変化は、健康スコアの違いに比べて結果を予測する上で効率的ではなかったため、マウスが人道的エンドポイントにあるかどうかを判断する際の基準として使用されていません。
結論として、あなたは今、凍結セカールスラリーのストックを準備し、重量調整用量を計算することができるはずです。そして、人道的エンドポイントのために新生児マウスを注入し、監視する。これがあなたのマウス研究のための貴重なリソースになることを願っています。
