このプロトコルは、ユーザーが移動、浸潤、および増殖などの腫瘍細胞行動にクリニックで使用される侵襲的な外科的処置の影響を研究することを可能にする。この方法は、侵襲的処置の前後に同じ腫瘍をユニークに視覚化することを可能にし、非縦断的アプローチで見逃すことができる洞察を提供する。麻酔付きの成人マウスのつまみつまみへの応答の欠如を確認した後、立体的なフレームにマウスを取り付け、鼻クランプと2つのイヤーバーで頭を固定します。
体温を維持するために加熱ランプを使用し、動物の目に軟膏を適用します。鋭利なはさみを使用して、目から頭蓋骨の基部に頭蓋骨の毛皮を剃り、露出した皮膚を殺菌するために70%エタノールを使用します。皮膚を円形に切り、綿棒を使って露出した骨膜を削り取ります。
綿棒で余分な溶液を取り除く前に、1%リドカインの低下、および1:100,000濃度のエピネフリンを5分間治療します。シアノアクリル酸接着剤を使用して皮膚の端を頭蓋骨に付着させ、4倍の拡大で解剖ステレオ顕微鏡の下に立体フレームを配置します。次に、表面的な5ミリメートルの直径、円形の溝を右頭頂骨に慎重に掘削します。
そして、溝に皮質緩衝液の滴を適用します。薄い鉗子を使用して骨のフラップを持ち上げて脳表面を視覚化し、曲がったテーパードの非常に細い点鉗子を使用して硬膜を取り除きます。出血が発生した場合は、吸収性ゼラチンスポンジを使用して止血を行います。
腫瘍細胞注射の場合、約3マイクロリットルの細胞を、ポイントスタイルの2本の針を備えた5マイクロリットルのガスタイトな注射器にロードする。ステレオタキシックマニピュレータアームの針を固定し、露出した組織から皮質バッファーを取り除きます。頭蓋骨切除術の途中に注射器の先端を置き、頭蓋骨の表面から0.5ミリメートルの深さで針を挿入します。
次に、皮質バッファーを1滴の皮質を頭蓋骨の骨組に加え、マイクロシリンジポンプインジェクターを使用して、毎分250〜400ナノリットルの速度で細胞を送達する。頭蓋イメージングウィンドウを準備するには、窓の下の気泡を避けるために、皮質バッファーを頭蓋骨開頭部位にシリコーンオイルの滴で置き換えます。露出した脳を6ミリメートルのカバースリップで密封し、カバースリップと頭蓋骨の間にシアノクリレート接着剤を塗布します。
その後、細かいピンセットを使用して、カバースリップを頭蓋骨に軽く押し付けます。適切な実験タイムポイントで、マウスの顔を撮像ボックスに置き、25倍の水の目標を最も低いz位置に設定します。目的に大量の水を加え、顕微鏡の37°Cの暗い気候室にイメージングボックスを移します。
水滴がカバースリップに触れるまで、頭蓋イメージングウィンドウのカバースリップに目的を持って来てください。そして、蛍光モードを使用して、接眼レンズを通して腫瘍を観察し、細胞を焦点にします。レーザーを正しい波長に調整し、ライブモードを選択します。
イメージングに関心のある複数の位置を選択した後、その座標をソフトウェアに記録します。各位置のZスタックを定義して、腫瘍細胞分解能を損なうことなく腫瘍細胞の最大体積を獲得し、画像間のステップサイズを3マイクロメートルに設定します。次いで、20分毎に異なる位置で腫瘍体積の画像を2時間取得し、各画像取得前に目的に水を加える。
最後の画像が取得されたら、完全な回復まで監視と加熱パッドにマウスを転送します。最初のイメージングセッションの1日後に、実証されているようにステレオタックシックフレームで麻酔マウスを固定し、アセトンを浸した綿棒を使用して、接着剤が柔らかくなるまでカバースリップの端を拭きます。カバースリップの下に25ゲージの針をスライドさせ、それを持ち上げるために薄いポイント鉗子を使用し、新鮮な皮質バッファーで頭蓋切除術を水和します。
25ゲージ針で腫瘍を1ミリメートルの深さまで穿刺し、無菌ゼラチンスポンジで出血を止め、新鮮なシリコーンオイルで脳の表面を密封する。その後、傷口の上に新しい6ミリメートルのカバースリップを接着します。画像解析では、顕微鏡ソフトウェアプログラムでタイムラプスLIFファイルを開き、プロセス、プロセスツール、およびマージタブを選択します。
時系列の最初の画像を選択し、最初にクリックします。時系列の 2 番目の画像を選択し、2 番目をクリックします。[寸法のマージ] で、時間に対して [t] を選択し、[適用] をクリックします。
2 つのタイムポイントを持つ新しいファイルが生成されます。連続する 3 つの z スタックのタイムラプス シリーズを個別に追跡した後、タイムラプス イメージを含むフォルダーを ImageJ にドラッグします。タブプラグイン、トラッキング、および MtrackJ を選択します。
個々のセルを追跡するには、[追加] を選択し、各タイムポイントで各セルをクリックします。次に、[メジャー] をクリックし、ファイルを保存してトラックのメジャーを抽出します。個々の腫瘍細胞の移動は、zスタックの異なるxy平面で経時移動経路を追跡することによって決定され、生検前および生検後の回遊細胞の割合としてプロットすることができる。
腫瘍細胞増殖率は、糸球体に対するH2Bタグ付dendra2凝縮に基づいて定量化し、生検前および生検後の分裂細胞の割合としてプロットすることができる。同じ腫瘍における生検前後の移動速度の分布を比較すると、介入後に回遊細胞の数が増加し、関連する低速から非遊動細胞の数が減少することが明らかになった。腫瘍当たりの平均では、生検様傷害が行われると、非生検マウスと比較して、回遊細胞の割合が1.75倍に増加することが観察される。
遊動腫瘍細胞の割合は、最終的には対照マウスと生検マウスの両方で減少するが、生検マウスは依然として対照マウス全体よりも高い遊覧能力を示す。腫瘍細胞増殖行動はまた、非生物細胞化対照マウスに対して、経時の生検時の有糸分裂事象の数の1.52倍の増加を示す。なお、生検を伴わない頭蓋イメージングウィンドウ置換後に腫瘍細胞移動または増殖の誘導は認められず、腫瘍細胞増殖および移動速度の上昇が生検様傷害によって特異的に引き起こされることを示している。
頭蓋イメージング、移植、および置換ステップの間に、高精度で外科的なスキルを持って作業することが重要です。広範な練習が必要な場合があります。
