国立衛生研究所からのサポートはしてシュライナーズホスピタル·バーンズ（GM092804、DE019938を付与）。

1。マイクロ流体デバイスの作製<ol><li>標準的なフォトリソグラフィ技術を使用して、クラス千クリーンルーム内でマスターモールドウェハを作製。パターン製造業者の指示に従って、移行チャネルを定義するための第3μmの薄いエポキシベースのネガ型フォトレジスト層を形成する。パターンセルローディングおよびケモカイン室を定義する第50μmの厚さの層。 </li><li>ポリジメチルシロキサン（PDMS）デバイスをキャストするようにパターン化ウェハを使用しています。激しく大きなプラスチック秤量トレイのプラスチックフォークを用いて5分間、開始剤（2g）を用いてPDMS（20g）に混合する。 </li><li>慎重に、金型上に、PDMSを注ぐ。 </li><li> 1時間真空乾燥器にあけ、PDMS金型を配置することによって、PDMSを脱気。 </li><li>焼くと65℃に設定したオーブンで、少なくとも3時間、PDMSマイクロ流体デバイスを治す</li><li> 1.5ミリメートルの先端径とパンチャーを使用して中央WBLCsを打ち抜く。 </li><li>穿刺を用いて全ドーナツ型のデバイスをパンチアウト5.0ミリメートルの先端径と彼女。 </li><li>粘着テープを使用したドーナツデバイスから粒子を除去する。 </li><li>脱イオン水で12ウェルプレートを洗い流してから窒素で乾燥。 5分間60℃のオーブンにプレートを置きます。 </li><li>酸素プラズマは、二回の12ウェルプレートを治療する;一回だけでは35秒してから、再度、別の35秒間のドーナツデバイスと。 </li><li>慎重にピンセットを用いてプレートのウェル内のデバイスを配置します。 </li><li> 10分間80℃に設定したホットプレート上に結合したデバイスとのベークプレート。 </li></ol> 2。マイクロ流体アッセイの準備<ol><li>直ちに酸素プラズマ処理後の素数マイクロ流体デバイスは、デバイスは、親水性及び毛細管効果がある場合、デバイスの小さなチャネルのプライミングを促進することができる。 </li><li> 5μLフィブロネクチン[原液を1 mg / mlの]と490μlのHBSSで5μLのfMLP [原液を10μm]を混合して化学誘引ソリューションを作成します。 </li><li>ゆっくりとピペット＆＃160; WBLCに化学誘引物質溶液、ゲルローディングチップ（ 図1A）を使用して。ピペット装置の外部の周りの化学誘引物質の追加の20μL。 </li><li> 15分間デシケーター中でプレートを置きます。装置に真空を適用することにより、溶液を装置及びPDMSを通って拡散される空気のサイドチャネルに注入される。 </li><li>デシケーターからプレートを取り外し、顕微鏡下でデバイスチャネルの濡れ性を確認。化学誘引物質溶液がチャンバに入ると、気泡が小さくなるように見る。気泡は、真空処理後のデバイス内に存在してはならない。 </li><li>徹底的に余分な化学誘引物質溶液を除去するための装置のWBLCと外側を洗ってください。このステップは、デバイスセンターに焦点走化性チャンバー（FCCの）のそれぞれから誘引物質の勾配を発生させる。 <ol><li>シリンジに30Gの鈍針の先端を追加し、PBSで1 mLの注射器を埋める。優しく、シリンジの針の先端を挿入ドーナツ穴の中心。そっと穴に100μlのPBSをプッシュするようにデバイス上部のPBS形の滴。 </li><li>傾斜プレートピペット装置の周りのPBS 1mlの液体がウェルの底に集まるようにする。吸引除去新鮮な緩衝液を用いて3倍の合計のために液体を繰り返しプロセス（代わりにバッファの使用メディア分離好中球がメディアにロードされる場合）9。 </li></ol></li><li>デバイスの上部に液体の下に沈むまで、メディアと各ウェルを埋める。デバイスは、勾配が安定するまで15分間放置します。実験結果と有限要素シミュレーションから理論的なデータは、これらのデバイス内の勾配は小分子（ 例えば 、fMLPで）のために、より大きな分子量（ 例えば 、IL-8）のためのいくつかの日まで24時間まで安定であることを示している。 </li><li>ゲルローディングチップを使用して、徐々に各々の全血LOAに2血液の液（または単離された好中球）をピペット丁室（WBLC）（ 図1A）。 </li></ol> 3。サンプルの調製毛細血管血液からヒト好中球<ol><li>無免疫抑制剤である健康なボランティアの指を刺すから毛細管血を収集します。すべての患者のサンプルは、書面によるインフォームドコンセントを得て、MGHとシュライナー治験審査会によって承認された手順を経て行った。 <ol><li>指穿刺採血のために、水と石鹸で手を洗い、皮膚を乾燥させます。採血管（1.65 USP/50μlの血液）をヘパリンに1ミリリットルのHBSS +0.2％HSAおよび10μlのヘキスト染色（32.4μM）を添加することによりanti-coagulant/stainストック溶液を準備します。優しく、SurgiLance安全ランセット（2.2 mmの深さ、22）を用いた指を刺し血液の最初の一滴を払拭し、株式抗凝固剤およびヘキスト蛍光染色溶液（10μl）を含むエッペンドルフチュー​​ブ内の血液の50μLを収集し、混ぜる。 </li></ol></li&gt; <li>核蛍光染色を可能にするために10分間の血とヘキスト染色をインキュベートする。採血の1時間以内にサンプルを実行します。 </li></ol>静脈血から、ヒト好中球<ol start="3"><li> 33 USPヘパリンを含む試験管に末梢静脈血の10ミリリットルを描画します。 </li><li>前述したように、メディアとヘキスト染色に静脈血50μlを加える。核蛍光染色を可能にするために10分間の血とヘキスト染色をインキュベートする。採血の1時間以内にサンプルを実行します。 </li></ol>全血からの好中球の分離 - ポジティブコントロール<ol start="5"><li>好中球を分離ヘタスターチを用いて10ミリリットル静脈全血サンプルから好中球を単離するために、無菌技術を使用する（6％w / v）の製造業者のプロトコールに従ってネガティブ選択磁気ビーズ単離キット、続いて密度勾配。 </li><li> concentrで好中球の最終的な分量を再懸濁1X HBSS +0.2％ヒト血清アルブミン/μL4000細胞のATION。実験を実行する準備が整うまで、37℃で細胞を維持する。 </li></ol>好中球走化性測定用4。顕微鏡と画像解析<ol><li> 5％、37℃、80％の湿度、およびCO 2へのバイオチャンバーの温度を設定します。 </li><li>顕微鏡（10倍以上の倍率）でタイムラプスイメージングを使用して、すぐに撮像立。 </li></ol> 5。統計解析<ol><li>手動で各試料中の少なくとも50の好中球を追跡します。 </li><li>時間をかけて、FCCに入る細胞（ 図2）を数える。 </li><li> ImageJの（NIH）（ 図2）を使用してWBLCおよびFCC間のチャネルにおける好中球の速度を計算します。 </li><li>分岐部を通過する細胞の数を計数し、終了番目FCC細胞に向かって回す細胞の数との比を計算することによって好中球の指向性を定量化する電子装置。方向性のないセルは、走化性勾配に従うため、FCCおよび出口チャネル（ 図2）に向けて同数に移行されません。 </li></ol>

<ol>
	<li>Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+atherosclerosis.">Inflammation and atherosclerosis.</a> Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).</li><li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil+in+vascular+inflammation.">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).</li><li>Butler, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+injury+reduces+neutrophil+directional+migration+speed+in+microfluidic+devices.">Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices.</a> PloS one. 5, (2010).</li><li>Lavrentieva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+markers+in+patients+with+severe+burn+injury.+What+is+the+best+indicator+of+sepsis.">Inflammatory markers in patients with severe burn injury. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+kit-on-a-lid:+a+versatile+platform+for+neutrophil+chemotaxis+assays.">Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays.</a> Blood. 120, (2012).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chambers+for+monitoring+leukocyte+trafficking+and+humanized+nano-proresolving+medicines+interactions.">Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).</li><li>Nauseef, W. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+neutrophil+speed+and+directionality+during+chemotaxis,+directly+from+a+droplet+of+whole+blood.">Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood.</a> Technology. , 1-9 (2013).</li><li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvin+D2+restores+neutrophil+directionality+and+improves+survival+after+burns.">Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).</li><li>Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+surgical+patients.+Relationship+to+adequate+bacterial+defenses.">Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses.</a> Arch Surg. 119, 39-43 (1984).</li><li>Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+inhibition+of+chemotaxis+in+human+plasma.">Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).</li></ol>

開示する特別の利害関係はありません。

本研究では、血液の小滴（2μL）から好中球の走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォームを開発しました。積極的に好中球の移行からのRBCのオンチップ·機械的ろ過は、好中球を活性化することにより、成果物を導入する傾向があるような密度が10の勾配などの煩雑な細胞分離方法は、ポジティブ選択11、または負の選択12の必要性を回避する。 RBCの機械的...

<html>好中球の人身売買は、アテローム性動脈硬化症1、細菌感染症や敗血症2を含む多くの炎症状態の進行と解像度を決定する上で重要な役割を果たしており、傷害3を焼く。健康と病気の状態への主要な貢献のために、好中球数は、多くの場合、臨床および研究実験室で検討標準的な血液分析の一部である。しかし、ほとんどのユビキタス試験の一つであるにも関わらず、感染症や敗血症の診断における好中球数の値が頻繁に4を疑問視されている。例えば、熱傷患者における好中球の1の研究では、好中球数及び好中球遊走機能は相関しないことを明らかにした。好中球が単独で数えることを意味して免疫状態3の正確な指標ではありません。測定することはより困難であるが、好中球の機能的能力は、広範囲の条件でより価値として提案されている。 tは &quot;&gt;重要なのは、好中球の欠陥の多くは一過性であり、恒久的な遺伝的欠陥によってトリガされず、大部分は最近まで、診療所で見過ごされてきた区別は。火傷の文脈では、好中球遊走はもちろん中に監視することができた炎症状態または感染3の指標として、患者の治療が、彼 ​​らは大量の血液を必要とするため、現在の研究室（Boydenチャンバー、ダン室、マイクロピペットアッセイ）で使用される従来の移動アッセイは、臨床現場に翻訳することができず、面倒で時間のかかる好中球の単離技術（ 表1）。好中球の単離のために必要な血液の量は、一つのサンプルのみを可能にし、多くの場合、偶数のプーリングを必要とするため、これらのアッセイはまた、マウスなどの実験小動物における好中球走化性の過渡的変化を監視するために使用することができない単一のアッセイのための複数の動物から血液が、例えば、関係する研究では、M複数の時点にわたるultiple条件や治療は、潜在的に、現在の走化性アッセイを用いて、マウスの数千を必要とする可能性があります。これは、損傷、感染症との関連で、免疫機能の複雑な力学を理解したり、多くの場合、マウスモデル5で研究を燃やすために行うことができる基本的な生物学的研究を制限します。 最小限の血液量を必要としながら、迅速なロバストである好中球機能アッセイの必要性に対処するために、我々は、全血の小滴から直接好中球走化性を測定するマイクロ流体デバイスを開発した。これは、血清6および7を含む血小板を全血には多くの要因が、好中球機能に影響を与えることが知られている。なお、全血のマイクロ流体アッセイはin vitroアッセイで8走化性における変化を測定するとき、好中球のインビボでの微小環境を維持するために、試料の処理を最小限に抑えることが有益である。このアプローチわずか数分（ 表1）に、従来の技術を用いて時間で好中球遊走アッセイに採血からの時間を低減する。全血のマイクロ流体プラットフォームは、実験期間のための安定した直線的誘引物質勾配を生成し、可動部品がなく、外部の圧力源（ すなわちシリンジポンプ）を必要としない。全血のマイクロ流体デバイスの設計における重要な特徴は、機械装置の移動路に入るのRBCをフィルタリングする赤血球（RBC）を濾過コムの組み込みである。このろ過櫛の右ターンはおそらく赤血球で詰まることになるサイズ排除濾過の必要性を防ぐため、WBに積極的に移行し、好中球に到達する化学誘引物質勾配を遮断する。 12または24ウェルプレート中の全血のマイクロ流体装置の組み込みは、ヒトまたはマウスの好中球走化性siを複数のメディエーターのスクリーニングを容易にする同時進行。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:179px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:191px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Device Fabrication</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">SU8&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Microchem</td>
			<td style="width:179px;">Y131273</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:191px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:179px;">Sylgard 184 1.1 lb. Kit</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Standard glass slides</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">125495</td>
			<td style="width:191px;">1 X 3 inches</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Glass-bottom plate</td>
			<td style="width:191px;">MatTek</td>
			<td style="width:179px;">P12G-1.5-14-F</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm</td>
			<td style="width:191px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:179px;">15081</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm</td>
			<td style="width:191px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:179px;">15072</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Microfluidic Assay Preparation and Analysis</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Gel-loading pipet tip</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">02-707-139</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Syringe</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientfic</td>
			<td style="width:179px;">309602</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Blunt tip needle, 30g &#189; in.</td>
			<td style="width:191px;">Brico Medical Supply</td>
			<td style="width:179px;">BN3005</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Vacutainer, Heparin</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Human serum albumin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">A5843-5G</td>
			<td style="width:191px;">0.2% final concentration in HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">F0895-1MG</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">fMLP</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">F3506-10MG</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;">SLN240</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Hoescht stain</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:179px;">H3570</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Positive Control&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">HetaSep</td>
			<td style="width:191px;">STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td style="width:179px;">7906</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit</td>
			<td style="width:191px;">STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td style="width:179px;">19257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Equipment</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Plasma Asher</td>
			<td style="width:191px;">March Instruments</td>
			<td style="width:179px;">P-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Lindberg/Blue M Oven</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:179px;">13-258-30C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Stainless Steel Precision Tweezers</td>
			<td style="width:191px;">Techni Tool</td>
			<td style="width:179px;">758TW458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">08-594-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Dataplate Digital Hot Plate</td>
			<td style="width:191px;">Alpha Multiservices</td>
			<td style="width:179px;">PMC 720&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Nikon TiE inverted microscope</td>
			<td style="width:191px;">Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective</td>
			<td style="width:191px;">Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">MRH20101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon</td>
			<td style="width:191px;">Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">500-L200NI2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:211px;">DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters - 25mm Emitters</td>
			<td style="width:191px;">Chroma - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">31013v2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600x1200 pixels</td>
			<td style="width:191px;">Qimaging - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td>RET-2000R-F-M-12-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed whole blood

好中球は、感染および血液中のそれらの数に対する保護において重要な役割を果たして頻繁に診療所で測定される。低好中球数は感染症の高いリスクについて警告サインであるが、血液中の高い好中球数は、通常、進行中の感染症の指標である。その機能を達成するために、好中球はまた、感染症が発生する組織内に、彼らの人生の大半を費やし、血液から効果的に移動できるようにする必要がある。その結果、移行する好中球の能力の欠陥は、好中球は、血液中の適切な数で存在する場合にも、感染症のリスクを高めることができます。しかし、診療所での好中球の遊走能を測定することは、時間がかかり、困難な作業であり、多量の血液、及び専門的な知識が必要になります。これらの制限に対処するために、我々はまわり、未処理の血液の一滴を必要とする好中球遊走のためのロバストなマイクロ流体アッセイを設計した好中球の分離の必要性を通気し、簡単な顕微鏡で定量化することは容易である。このアッセイでは、好中球は、化学誘引物質源に向かって、小さなチャネルを通して、血液の液滴から直接移行します。同じチャネルを介して赤血球の粒状流れを防止するために、我々は、選択的に赤血球の進行をブロックすることになり直角と機械的にフィルタを実装した。我々は、指穿刺および静脈血から採取された血液の液滴からの好中球遊走を比較することによりアッセイを検証した。我々はまた、精製された好中球のサンプルから好中球の遊走これらの全血（WB）のソースを比較し、3ソース間の一貫性の速度と方向性を見つけた。このマイクロ流体プラットフォームは、健康と病気における好中球機能の理解を進めるために役立つクリニックや研究環境で、人間の好中球遊走の研究が可能になります。

全血（WB）好中球走化性アッセイは、fMLPの勾配（ 映画S1）に向かう好中球の蓄積を測定することにより確認した。結果は、好中球（ブルー）が積極的に全血（ 図3Aと動画S1）から移動することができますが赤血球を濾過コームにトラップされていることを確認。全血のマイクロ流体装置によって形成された安定な化学誘引物質線形勾配（緑色）は、FITC-標...

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Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

このプロトコルは、堅牢で再現性の全血の1滴からヒト好中球走化性を測定するように設計分析について詳しく説明します。このアプローチは、好中球の分離のための必要性を回避し、アッセイ準備時間のほんの数分を要する。サンプル量が限られているマイクロ流体チップは、乳幼児や小さな哺乳類では時間の経過とともに好中球走化性の反復測定を可能にします。

未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

microfluidic-platform-for-measuring-neutrophil-chemotaxis-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K ビュー.  Massachusetts General Hospital. このプロトコルは、堅牢で再現性の全血の1滴からヒト好中球走化性を測定するように設計分析について詳しく説明します。このアプローチは、好中球の分離のための必要性を回避し、アッセイ準備時間のほんの数分を要する。サンプル量が限られているマイクロ流体チップは、乳幼児や小さな哺乳類では時間の経過とともに好中球走化性の反復測定を可?...

ビデオ: Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

マイクロ流体プラットフォームを使用した高スループットのタンパク質発現ジェネレータ

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

生物工学

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

多臓器チップ - 長期マルチ組織の共培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white blood cells and platelets that are suspended in blood plasma. Due to the abundance of the RBCs (40% to 45% of the blood volume), their behavior dictates the rheological behavior of blood especially in the microcirculation. At very low shear rates, RBCs are seen to assemble and form entities called aggregates, which causes the non-Newtonian behavior of blood. It is important to understand the conditions of the aggregates formation to comprehend the blood rheology in microcirculation. The protocol described here details the experimental procedure to determine quantitatively the RBC aggregates in microcirculation under constant shear rate, based on image processing. For this purpose, RBC-suspensions are tested and analyzed in 120 x 60 &#181;m poly-dimethyl-siloxane (PDMS) microchannels. The RBC-suspensions are entrained using a second fluid in order to obtain a linear velocity profile within the blood layer and thus achieve a wide range of constant shear rates. The shear rate is determined using a micro Particle Image Velocimetry (&#181;PIV) system, while RBC aggregates are visualized using a high speed camera. The videos captured of the RBC aggregates are analyzed using image processing techniques in order to determine the aggregate sizes based on the images intensities.

The protocol described details an experimental procedure to quantify Red Blood Cell (RBC) aggregates under a controlled and constant shear rate, based on image processing techniques. The goal of this protocol is to relate RBC aggregate sizes to the corresponding shear rate in a controlled microfluidic environment.

赤血球凝集の動的な調査のための制御されたマイクロ流体環境

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

全血からの超高感度のタンパク質検出のための全自動遠心マイクロ流体デバイス

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

粒子の空間追跡のための多重化された電子の検出とマイクロ流体プラットフォーム

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

二層流体プラットフォームシロイヌナズナ実生の根毛の形態のイメージング

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける縦断的イメージングのためのマイクロ流体プラットフォーム

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループット マイクロ流体プラットフォーム

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...