仕事はGO-バイオ認可番号0315569、教育研究のために、ドイツ連邦省によって資金を供給されています。

注：ヒト少年包皮がルーチン割礼後に小児手術から、関係法令を遵守し、インフォームドコンセントおよび倫理承認（倫理委員会シャリテ大学医学部、ベルリン、ドイツ）で得られた。 MOCにおける栽培のための組織等価物の1。生産<ol><li>肝スフェロイドを生成するために、ドロッププレートをぶら下げでHepaRGとHHSteCを集約。 <ol><li>細胞培養フラスコ中で増殖させHepaRG細胞（75 cm 2）でのトリプシン処理を達成するために、二回PBSで洗浄し、単層培養物を分化し、コンフルエントから培地を除去し、0.05％トリプシン/ EDTAを3mlを加える。 37℃で3〜5分間インキュベートし、トリプシン阻害剤6を加えて反応を停止。 </li><li> 5分間150×gで遠心HepaRG細胞は、上清を除去HepaRG細胞培養培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁し、細胞カウント。細胞生存率は&gt; 90％であるべきである。 </li><li>で、HHSteC細胞のトリプシン処理を実現する単層培養物から培地を除去し、PBSで二回洗浄し、0.05％トリプシン/ EDTAの3ミリリットルを追加するため。 37℃で5分間インキュベートし、トリプシン阻害剤6を加えて反応を停止。 </li><li>遠心機で5分間150×gでHHSteC細胞は、上清を除去は、HepaRG細胞培養培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁し、細胞カウント。 </li><li> 24の割合でHepaRGとHHSteCを組み合わせる：1 HepaRG細胞培養培地中に。これを行うHepaRG細胞培養培地中で細胞懸濁液を希釈して細胞数を調整し、4.8×10 6細胞/ mlのHepaRG細胞に1×10 5細胞/ mlのHHSteCを追加する。丁寧に混ぜる。 </li><li>懸滴およびレシーバプレートに2mlのPBSを添加することにより懸滴プレートを準備する。 </li><li>ピペット懸滴プレートの各ウェルに細胞懸濁液を20μl。常にいくつかの凝集体は対応時間は限らを失っているように、約10％より多くの吊りは、あなたが凝集体を取得するために必要以上に低下する準備手順ngの。慎重に37℃のインキュベーターでプレートを配置。スフェロイドを形成するために48時間を待ちます。 </li><li>スフェロイドを取得するためには、広い先端語尾にピペットチップを使用するか、2〜3mm程度に開口部を広げるために、滅菌ナイフで1ミリリットルピペットチップの先端をカットしてください。それらを破壊することなく、スフェロイドを処理するために、これらのピペットチップを使用してください。 </li><li>繰り返しのピペットを使用して懸滴プレートのウェルの上部に培地1mlを添加することにより懸滴プレートから注意深くスフェロイドを洗い流す。すべてのスフェロイドがオフに下落しているまで、プレートを洗浄してください。スフェロイドはわずかに円盤状の300〜400ミクロンの平均直径と、この時点で200〜300ミクロンの高さである。 </li><li>レシーバプレートでスフェロイドを収集し、よく準備ピペットチップを使用してあたり20スフェロイドの最大24ウェルの超低接着プレートにそれらを転送します。各ウェルに0.5mlのメディアボリュームを調整します。 INO 20骨材を使用して、インビボでの細胞数に係る1 / 100,000の小型化速度を得るために、1つMOC回路culate。 </li><li> MOCでさらに使用するまで37℃でスフェロイドおよび5％CO 2でインキュベートする。比較可能性を確保するために使用法の前に3日以上のスフェロイドを保管しないでください。均一なスフェロイドを取得するために、超低付着性プレートに少なくとも1日の凝集体を養う。 </li></ol></li><li>皮膚組織等価物を生成するために、2つのアプローチのいずれかを追求：パンチ生検（1.2.1）またはインビトロ組織モデルでの既製の使用（1.3.1）を使用すること。 <ol><li>さらに使用するまで無菌条件下で96ウェル細胞培養インサートおよびストアを準備するブラケット以下白熱ナイフでトランスウェルを切る。 </li><li> 30秒間の80％エタノールで包皮サンプルを滅菌し、開放リングをカットする。サンプルは2ミリメートルの平均高さを持っている必要があります。 </li><li>等しいminiaturizaを得るために、4.5ミリメートル直径の生検をカットする生検パンチを使用して、肝臓と皮膚の両方のション比。鉗子で挿入トランスウェル準備し、96ウェルに生検をロードします。表皮側を上に向けて生検を配置するように注意してください。 </li><li>場所細胞培養物はMOCでさらに使用するまでHepaRG細胞培養培地およびストア37℃で、5％CO 2を含むレシーバプレートの生検を挿入する。 2から3時間よりも長いサンプルを保管しないでください。 </li></ol></li><li> 、MOCに、様々な供給業者から購入した彼らは、96ウェルトランスウェルフォーマットであることを確認して、既製のインビトロ皮膚モデルに統合します。両方の組織を支援する最小培地を使用し、別の組織との共培養は、さらにステップで想定される場合には、ベンダが提供する細胞培養培地を使用するか。組織をサポートするために、その能力のための従来の静的実験におけるそれぞれの最小​​培地をテストします。 <ol><li>ホルダープレートから皮膚モデルを取得し、白熱ナイフでブラケット下の96ウェルインサートをカット。 </li&gt; <li> MOCでさらに使用するまでCO 2を 37℃で背受け板と店舗への挿入を置き、5％。 1日よりも長いサンプルを保管しないでください。 </li></ol></li></ol> 2. MOC製作<ol><li> 10の比でPDMSと硬化剤を混合する：1（v / v）の気泡を除去するために15分間真空下で混合物を置く。 </li><li>一方、20分間80℃でシリコンゴム添加剤を有するポリカーボネートカバープレートを扱う。 </li><li>マイクロポンプの、厚さ500μmの4 PDMSを含まない細胞培養区画と6 PDMS膜を、作成するためにカバープレートのそれぞれの穴にテフロンねじを挿入します。 </li><li> 2微小回路のマスターモールドに準備されたカバープレートを接続し、脱気したPDMSを注入する。システム内に空気の泡を統合しないように注意してください。気泡が出てくる場合は、デバイスを傾けることによって、それらを削除しよう。 </li><li> PDMS層を硬化させるために60分間80℃でシステムをインキュベート。 </li><li>デバイスからマスターモールドとテフロンネジを外し、低圧プラズマ酸化を使用して、75×25ミリメートル2フットプリントとスライドガラスにPDMS層を接合する。 </li><li>カバープレートの4つのすべての細胞培養区画に特別なスレッドMOCアダプタをねじ込みます。 </li><li>雌ルアーX 1/4 28オスアダプタに培養液を含む注射器を接続し、それらは、カバープレートのMOCアダプタにねじ込みます。 </li><li>繰り返し押し下げと注射器のプランジャーを引き上げて、マイクロ流体回路内に培地を注入。 </li><li>顕微鏡下で媒体とのチャンネルの適切な充填を確認してください。 </li></ol> MOCの3内皮化<ol><li>内皮細胞増殖培地とMOC、フラッシュ各MOC回路endothelializingとCO 2を 37℃で3日間、静的にインキュベートし、5％の前に。 <ol><li>エタノールを用いてMOCSワイプ滅菌層流ベンチの下に配置します。私n個の付加、さらに使用するために鉗子の二対および2つの六角キーを滅菌する。 </li><li>六角形のキーを使用して、MOCの組織培養区画のキャップを緩め、ピンセットを用いてキャップを取り外します。メディアを挿入した後、同じようにMOCSに再びキャップをねじ込みます。 </li></ol></li><li>ヒト皮膚微小血管内皮細胞（HDMEC）のトリプシン処理を達成するために、二回PBSで洗浄し、単層培養物から培地を除去し、0.05％トリプシン/ EDTAを3mlを加える。 37℃で5分間インキュベートし、トリプシン阻害剤6を加えて反応を停止。 </li><li> 5分間220×gで遠心HDMEC、上清を除去は、内皮細胞増殖培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁し、細胞カウント。細胞生存率は&gt; 90％であるべきである。 </li><li>内皮細胞増殖培地で希釈して2×10 7細胞/ mlの最終濃度まで細胞懸濁液中の細胞数を調整し、それを250μlの転送1ミリリットルの注射器。すべての臓器のための1 / 100,000の小型化率を維持するためにMOCへの細胞のこの濃度を適用します。 </li><li>このフィッティングから空気を追い出す、雌ルアーX 1/4 28オスアダプタにシリンジを接続し、特別なスレッドMOCアダプタにそれをねじ込みます。各MOC回路の2区画の1にアダプタを接続します。 </li><li> MOC回路の第2の区画に同じように空のシリンジを接続します。 </li><li>連続した方法で数回押し下げると2シリンジのプランジャーを引き上げて細胞を均一に注入する。顕微鏡下で細胞の注入を制御します。 </li><li>細胞がチャネル壁に付着することを可能にするために3時間、静的条件下、37℃でMOC、5％CO 2でインキュベートする。 </li><li> 、インキュベーターからチップを取り外して層流ベンチの下に置き、そして特殊な糸MOC細胞培養チャンバと注射器とMOCアダプタを交換。 </li><li> 1 COMに新鮮な培地400μlのを追加します。各MOC回路のpartment、それは静水圧によってチャネルを通じてフラッシュしてみましょう。その後、新鮮な培地300μlの両方の区画内の媒体を交換してください。 </li><li> 3.1.2で説明したように、キャップを使用してコンパートメントを閉じます。 </li><li>ポンプ制御ユニットにチップを接続します。 0.475ヘルツの周波数にポンプ速度を調整し、37℃でチップおよび5％CO 2を養う。 </li><li>すべての1〜2日各MOCコンパートメントのメディアを交換し、光学顕微鏡で細胞形態を監視します。 </li></ol>チップの4。読み込んでいます<ol><li>層流ベンチの下MOCを置き、ステップ3.1.2で説明したように、それを開く。 </li><li>組織培養区画から培地を除去し、新鮮なHepaRG細胞培養培地300μlのと交換してください。 </li><li>広い開口部とのピペットチップを使用して、各MOC回路の一組織培養区画への転送20予備形成スフェロイド（ステップ1.1.8 / 9を参照）。 Cを閉じるapが鉗子や六角キーを使用。 </li><li>鉗子を用いて各MOC回路の残りの組織培養区画に皮膚等価物を含む96ウェル細胞培養インサートを転送する。皮膚等価物の膜下に気泡形成を避けるように注意してください。これを行うためには、わずかに傾いた角度でトランスウェルを挿入して、そっと押し下げます。ピペットで、下から押し上げられ、トランスウェルの周りに余分なメディアを取り出します。 </li><li>鉗子と六角形のキーを使用してキャップを閉じます。 </li></ol> 5.ポンプ制御ユニットにチップを接続する<ol><li>所望の値に制御単位で動作パラメータを設定します。 0から8000ミリバール、0から-800ミリバールの真空、および0.24〜2.4 Hzの周波数をポンプに空気圧を変更します。時計回りまたは反時計回りのポンピング方向を設定します。 </li><li>層流ベンチの下からMOC含む組織同等物を取り外し、ポンプ制御ユニットに接続します。 </li><li> numeratに続いてチューブ上のイオンは、MOC上のそれぞれのフィッティングに空気圧チューブを挿入します。 </li><li> 37℃でMOCの育成及び5％CO 2インキュベーター内または、生きた組織のイメージングの場合は、37℃にチップを加熱し、インキュベーターの外チップを育成するMOCサポートを使用。標準の顕微鏡下MOCで細胞を培養するために加熱されたサポートを使用してください。 </li></ol> 6.実行メディア交流、サンプリングメディアと物質への暴露<ol><li>組織培養し、細胞の代謝活性のタイプを考慮して、毎日または隔日ルーチンメディア交換を行います。 <ol><li>インキュベーターからMOCを取得し、メディアの流量を制御し、汚染を確認するために顕微鏡下でそれを観察する。 </li><li>空気圧チューブを抜いてポンプ制御ユニットからMOCを外します。エタノールワイプを使用してMOCを殺菌し、層流ベンチの下に置く。 </li><li>組織培養COMPを開くステップ3.1.2で説明したように、肝細胞スフェロイドを含むartment。 </li><li>スフェロイドを中断することなく、ピペットを用いてコンパートメントから200μLまで削除し、ディープウェルプレートの空のウェル中の培地を保存する。直接メディアサンプルを分析したり、ディープウェルプレートを閉じて、さらなる分析のために-80℃でメディアサンプルを保存する。 </li><li>最大250μlの新鮮な細胞培養培地でMOCの培地を交換し、キャップを閉じます。培地量の差を除去し、システムを閉じる際に、チップから漏れる少量による損失のアカウントを置き換える。 </li><li>組織完全性をチェックするために、この時点で皮膚等価物を保持している組織培養コンパートメントの蓋を開けます。システムに気泡を導入しないように注意してください。キャップを閉じます。 </li><li> 5.3ステップ、そしてインキュベーター内MOCを配置に従って、MOCのポンプ制御部のチューブを接続する。 </li></ol></li></ol> 7。デイリーメディアサンプルを分析し、オンライン分析の実行<ol><li>オンラインライブセルイメージングまたはオフラインを使用して、毎日の培地試料を分析することによって、組織培養性能を分析する。標準ルーチン酵素アッセイ（ 例えば 、乳酸脱水素酵素（LDH）活性）またはELISA（ 例えばアルブミン濃度）によって、後者を実行します。オンライン分析は、以下に説明する。 </li><li> （中に希釈6.1.1 6.1.4への手順で説明するように、内皮MOCのメディアを取り出し、および10μgの200μlの両方の組織培養区画内/ mlのフォアアセチル化コンジュゲートした低密度リポタンパク質（LDL）のソリューションを交換してください細胞培養培地）。 </li><li>キャップを閉じます。 5.3ステップに従って、ポンプ制御装置MOCに接続して、マイクロ流体回路内に均一に溶液を分配するために0.475 Hzで30分間それをポンプ。 </li><li>ポンプを停止し、37℃で3.5時間、5％CO 2のために静的にMOCインキュベートする。 </li><li>同様トンOステップ7.2は、両方の区画からアセチル化LDL溶液を除去し、2区画の1に新鮮な培地400μlのと交換してください。 </li><li>静水圧は、マイクロ流体チャネル回路を介してメディアをドライブできるように3から5分間待ちます。 </li><li>新鮮な培地300μlで流れた培地を交換し、また新鮮な培地300μlの第二の組織培養区画を埋める。 </li><li>ステップ3.1.2によると、MOCを閉じます。蛍光顕微鏡下でそれを入れて、細胞の成長および生存を観察します。 </li><li>栽培を継続するために戻ってインキュベーターで染色されたMOCを置きます。各次のメディア交換に細胞外に漏れるの汚れを取り除きます。 </li></ol> 8. MOCからの組織等価物を取得し、エンドポイントの解析を実行します<ol><li>エンドポイントの実験の終了時MOCからの組織同等物を分析して取得します。 <ol><li>肝臓、皮膚、Eを取得するために6.1.4へのステップ6.1.1で説明したように、MOCからquivalentsは、各組織培養区画からメディアを取り出します。 </li><li>鉗子を用いてMOCから皮膚を含む96ウェル細胞培養インサートを取り外し。鉗子で一方の側にそれを把持し、それを下に引いて、カバーから慎重に膜をはがし。この時点で、皮膚等価物を失わないように注意してください。 </li><li>クライオ埋め込む化合物中の皮膚等価物を保持する膜を凍結し、さらなる分析まで-80℃で保管してください。 </li></ol></li><li>カットピペットチップを使用してそれらをピペッティングすることにより、組織培養室から同様に肝臓同等物を削除する（ステップ1.1.8 / 9参照）。 <ol><li>クライオ埋め込む化合物中の肝スフェロイドを埋め込む。あまりにも多くの液体を転送し、ピペットで余分な流体を除去しないように注意してください。埋化合物の上にスフェロイドを置き、培地を除去した後、完全にそれらを囲むようにスフェロイドの上部にさらにクライオ化合物を添加する。 </li><li>肝臓同等物を凍結し、さらなる分析まで-80℃で保管してください。 </li></ol></li><li>以前のプロトコル10で説明したように、組織特異的なマーカー8μmのセクションや染色にクライオミクロトームで組織同等物を切断することにより、エンドポイント分析を実行します。 </li></ol>

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J., Domansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfabricated+Array+Bioreactor+for+Perfused+3D+Liver+Culture.">A Microfabricated Array Bioreactor for Perfused 3D Liver Culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 78 (3), 257-269 (2002).</li></ol>

ウーヴェ·マルクスは記事で使用する多臓器チッププラットフォームを生産·販売TissUse社の最高経営責任者（CEO）である。 この刊行物は、コーニング社によって付与された賞で賄われました

ここで説明MOCプラットフォームは長期培養期間10,16上に動的な媒体流条件で、様々な起源の組織を培養するための安定した強力なツールを表します。この例では、プラットフォームは、一次細胞（HDMEC）、細胞株から生成された組織等価物（肝​​臓凝集体）、及び組織生検と前述の共培養を培養するために使用した。 MOCは、結合された媒質回路内に最大28日間、3組織の共培養を維持することができました。著者の知る限り、これは生検、初代細胞および細胞株を含むマルチ組織の共培養は、4週間に渡って行われたのは初めてです。 マイクロ流体システムの主要な欠点​​の1つは、流体回路の表面材料に付着する小分子の親和性である。体積比表面がマイクロ流体システムにおいて特に高いため、この効果は17より顕著になる</s&gt;アップ。ここで紹介するチャネルの安定HDMECカバレッジは、MOCへの分子の付着を防止する生物学的障壁として作用するかもしれない。また、血液凝固を防止する、全血の循環のための血液適合性容器として機能することができる。臓器等価物の完全な血管新生は、まだ達成されていないただし、媒体置換として全血を使用することは不可能である。 インビトロと生成さ組織の血管新生に既存の作業は有望であると、さらなる研究18,19への道を案内する。 これは、肝細胞がインビトロ静的二次元培養条件の下で20時間にわたってそれらの肝臓特異的機能を失う傾向にあることがよく知られている。ある種の薬物の代謝を研究する場合にはそのようなチトクロームP450ファミリーの酵素を、代謝、特別な重要である。シトクロムP450 3A4、多くの生体異物の生体内変換に関係する酵素、およびシトクロムP450 7Aは、ワットHICHは、胆汁酸合成に関与する、14日間にわたってMOC培養集約肝臓で発現させた。これは、薬物代謝研究を考慮して、代謝的に活性な表現型の維持を示している。静的培養物と比較してMOCにおける凝集体の増加したアルブミン産生率は、適切な培養条件のために、追加の指標である。 23しかし、値は一次ヒト肝細胞培養物24のものに到達しなかった-この試験中に観察されたアルブミン産生率は21 HepG2細胞を含む流体チップにより得られた以前に報告された値に匹敵するまたはそれ以上であった。さらに、MOCシステムは、その一時的なレイアウトで、胆汁の別々の分離を可能にしない。 MRP-2染色によって示されるように、集約偏と形成された毛細胆管様構造中の細胞。しかし、これらの細管は、胆汁を集める技術的なチャネルに接続されていなかった。この非生理ミックス血液区画と胆汁のると、システムの将来の再設計で対処する必要がある。 流量特性の調整は、特に肝臓のような剪断応力に敏感な組織に関連して、重要度の高い25である。組織によって知覚されるせん断応力の量は、2つの方法で変更することができる：第一に、ポンプの膜を押し下げるために使用される空気の圧力は、システム内のピークせん断応力値を低下させる、低下させることができる。第二に、組織は、細胞外マトリックスに埋め込まれたレイヤリングまたはトランスウェル培養インサートで培養することができる。後者は、多孔質膜と、基礎となる電流から組織を保護する。これらの調整は、MOC、実験を開始する前に、各臓器に相当するため、個別に実行する必要がある。 144ビートの高い、まだ生理学的、心臓の活動に対応し、例えば2.4ヘルツの拍動動作、時/分、ヒトにおいて、剪断応力がで測定微小回路のチャンネルは、約25ダイン/ cm 2に達する 。これは微小血管系におけるスケールの上限で生理的剪断応力に相当し、従って、チャネルの内皮化を含む実験のために十分に適用可能である。提示MOCシステムの現在のマイクロ流体のレイアウト二臓器コンパートメントを接続する唯一のメディア回路で構成されてしかし、一つのポンピング速度と剪断応力速度は、システム全体のために選択されな​​ければならない。したがって、それぞれの単一の器官のニーズに流動特性の正確な調整が必ずしも実現可能ではない。 さらに、注意は、一般的な培地に細胞を調節する際に注意しなければならない。細胞は、 インビトロ細胞培養のための標準であるので、従って、全く個別の細胞培養培地は、それぞれの組織モデルのために使用することができない、複合メディア回路にMOCで培養される。最小限の複合培地処方は、予めとtを定義する必要彼細胞は、この新しいメディアに段階的に調整する必要がある。 2日間の新しいメディアの古い80％/ 20％の調整手順は、次に50％/ 50％、20％/ 80％、続いて、完全な交換は常に我々の手での培養物の合理的な細胞生存率および機能性をもたらした。 MOCシステムの現在のマイクロ流体レイアウトは、最大3つの組織の共培養することができます。人体の少なくとも10個の最も重要な器官の共培養は、恒常性を達成するために必要とされる。したがって、提示システムは、特定の組織 - 組織相互作用ではなく、物質の真の全身性の応答を予測することができる。以上の臓器キャビティを含むようにMOCのさらなる開発が想定される。さらに、システムの有効性は、参照化合物のセットを用いて示されるべきである。好ましくは、（例えば、トログリタゾンなど）、臨床試験中に失敗した化合物は、MOCにおけるそれらの性能について試験される。そのような複雑なシステムの真の検証はまだBが阻害され、一方でYこのと同様のシステムの毒性学的パフォーマンスに多くのデータを収集する機能評価のためのバイオマーカーおよびエンドポイントに関する標準化の欠如は、彼らの信頼性と適用領域を広げるます。

薬剤開発のための現在の単層または懸濁細胞培養アッセイは、ヒト細胞の微小環境をエミュレートし、従って、迅速な脱分化および初代ヒト細胞培養物における機能の喪失につながることに失敗している。より高い生理学的関連性を持つ組織モデルは、臨床試験にそれらを認める前に、化合物の有効性および安全性を予測するために必要とされる。最近、 インビトロ細胞培養技術の標準は、 インビボ組織微小環境を模倣することを目指し、三次元多細胞モデルに向かって二次元単層培養から進化した。これらのシステムは、すでに化合物1,2の作用様式のより正確な予測に向けて大きな改善を示している。さらに、細胞の高度に特殊ニーズにインビトロ培養条件に適応することは特に興味深い。 インビトロ条件下での基準では、重要なCULさまざまそのような栄養と酸素の供給、蓄積物の除去、およびしばしば、ほとんどの場合、十分に制御できない細胞に作用する機械的な力としてトゥーレパラメータ。多くの器官は、物質と溶存酸素の生理学的に関連する濃度勾配を有している。しかし、これらの高度に規制され、最適化された条件は非常に不安定な環境につながると携帯開発3を制限し 、in vitroでの条件の下での組織の周りに制御不可能な拡散勾配に明確な反対している。したがって、より安定し、インビトロ条件下で 、特により定量化は、長期間にわたって生存及び分化細胞を維持するために必要とされる。培地成分は、定期的に除去され、置換されて灌流システムは、多くの場合、組織の直接周囲に係る静置培養よりも良好に特徴付けかつ制御可能である。静的条件、細胞分泌物および培養培地の栄養素の拡散勾配下培養細胞3を囲むことがあります。組織の周りによく特徴付けられた培地流量を導入することは、細胞の分泌物が灌流を通じて豊かな媒体と混合させる。これは、安定した細胞の表現型を確保し、全体の分析時間4を通して酵素発現代謝、定義された細胞の微小環境の生成を可能にする。 多臓器チップ（MOC）における最近の開発は、システムがテスト中に必要な物質の量の減少につながる、マイクロスケールバイオリアクターの小培地と細胞塊の要件に設計された組織の周りの制御媒体流の利点を組み合わせたベース。組織培養のためのいくつかのマイクロ流体システムは、これまでに5,6に記載されている。これらのシステム内の組織対流体の比は、生理学的に関連する細胞のクロストークをシミュレーションする際に特に重要な役割を果たしている。しかし、そのような外部のポンプやメディア貯水池の使用などの技術的な制限、に、目全体的に、ほとんどのシステムでメディア循環量eは、組織体積に比べて大きすぎる。シュラーらのグループは、細胞培養区画内及び生体内の関連組織から流体比7,8 中の物質の適切な滞留時間を確保するシステムを開発した最初の。これはまた、「他の組織」の区画を表す、96ウェルプレートにまで外部リザーバーをスケーリングすることにより達成された。我々のMOCプラットフォーム内の​​循環媒体ボリュームを最小にするために、我々は、外部メディア回路の必要性を排除する、蠕動オンチップマイクロポンプを集積。このマイクロポンプは、メディアフロー速度とせん断応力速度9の選択可能な数でシステムを動作することができる。 500μmの幅と100μmの高さのマイクロ流体チャネルシステムは、各96ウェルプレートの1ウェルのサイズを有する、2つの標準化された組織培養空間を相互接続する。業界標準のウェルプレートのサイズに付着するSは、トランスウェル形式で作成、既存の組織モデルの統合を可能にする。さらに、トランスウェル細胞培養インサートの垂直位置は、直接流体の流れにさらされない組織モデルの栽培を可能にする、調整可能であるが、持ち上げられ、基礎となる電流から遮蔽することができる。同様に、気液界面培養物は、このシステムを用いて実現可能である。 MOCプラットフォームは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）層2ミリメートル高い恒久的に流体密なマイクロ流体回路を形成するために、低圧プラズマ酸化により接合されている75×25 mm 2以上のフットプリントを有するガラス顕微鏡スライドから製造される。各チャネルおよび細胞培養区画を含むPDMS層は、標準的なソフトリソグラフィーとレプリカ成形9により製造される。この試験中に使用されるMOCのマイクロ流体設計では、それぞれ2つのセルcを保持し、チップ当たり2つの別々のマイクロ流体回路から構成され100μmの高いチャネルシステムによって相互接続ultureコンパートメント。これは、1つの多臓器チップを使用して、2つの個別の二組織の同時培養の性能を可能にした。ポンピング周波数/分の40μlの培地流量を得るために調整した。 この二組織MOC設計は生理的流れの条件下で、複合メディア回路ではあるが、別個の培養空間に肝スフェロイド及び皮膚パンチ生検を共培養する能力を提供した。均一なスフェロイドを形成するために1：分化したHepaRG細胞を24の割合で、ヒト肝星細胞（HHSteC）と共に凝集させた。この比は、肝細胞のほぼ倍の数は、インビボでの状況と比較して使用しても、でも、先の実験10で観察されたように、最適であることが見出された。皮膚は、このように局所物質の曝露を可能にする、トランスウェル細胞培養インサート内の空気 - 液体界面で培養した。これらの組織モデルは、28日間共培養されたこのシステムの包括性を実証するMOCでAYS。さらに、チップのマイクロ流体チャネル回路は、完全に、より密接に血管系をシミュレートするために、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（HDMEC）で覆った。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HepaRG cells</td>
			<td style="width:163px;">Biopredic International</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>undifferentiated cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HHSteC</td>
			<td style="width:163px;">ScienCell Research Laboratories</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">cells and all culture supplements</td>
		</tr>
		<tr height="171">
			<td height="171" style="height:171px;width:216px;">HepaRG Medium</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">William&#39;s Medium E&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% FCS&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 U/ml penicillin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 &#181;g/ml streptomycin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 &#181;g/ml human insulin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 2 mM L-glutamine&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">HDMEC Medium</td>
			<td style="width:163px;">PromoCell</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:163px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>add 2% to HepaRG media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:163px;">Biowest</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsininhibitor</td>
			<td style="width:163px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MAXYMum Recovery Tips</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>1000 &#181;l Pipet Tips Wide Bore</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">384-Well Hanging Drop Plate</td>
			<td style="width:163px;">3D Biomatrix</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Tissue culture flasks</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>75 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-low attachment plate</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>24-well</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transwell cell culture inserts</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">96-well unit,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.4 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deep well plates</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">96-well, 1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biopsy punch</td>
			<td style="width:163px;">Stusche</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>4.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass microscope slide</td>
			<td style="width:163px;">Menzel</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>footprint of 75 x 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polydimethylsiloxane</td>
			<td style="width:163px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon rubber additive</td>
			<td style="width:163px;">Wacker Chemie</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Wacker Primer G790</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubes for air pressure</td>
			<td style="width:163px;">SMC Pneumatik GmbH</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Polyurethan-Schlauch, metrisch</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alumin ELISA</td>
			<td style="width:163px;">Bethyl Laboratories</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:215px;">Human Albumin ELISA Quantitation Set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactate dehydrogenase assay</td>
			<td style="width:163px;">Stanbio Laboratory</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>LDH Liqui-UV kit</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Alexa Fluor 594 acetylated LDL</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

標準インビトロ組織培養物は、組織に酸素および栄養の供給の拡散を制限する、静的な条件下で行われる。流体システムは、改良された供給特性を示す、多くの場合、組織比に非生理学的に高い媒体を有する、それらの大きな媒質要件によって妨げられる。したがって、代謝物を希釈した細胞は、その周囲を調整することができませんされている。この研究で提示MOCは、マイクロ流体チャネルシステムによって、二つの別々の組織培養区画、標準的な96ウェルプレートの1ウェルの各サイズに接続する。システム·オン·チップとポンプの統合の小規模システムが唯一の200から800μLのメディア·ボリュームで動作することを可能にする。それぞれ、肝臓および皮膚組織の同時培養（約26μlの総組織量を有する）、1：1〜31：これは8の組織比総全身媒体に対応する。男は7の重さで、総細胞外液量毛細血管間の流体体積が1の組織比生理学的細胞外液につながる、5.1 Lでwhereof 3kgを、14.6 L：4である。したがって、MOC全体循環系内のメディアの量は、生理学的状況に比べてまだ大きい。しかも、それは多臓器系5のために、これまでに報告された組織の比が最小のメディアを表す。業界標準の組織培養形式が保持されるように、研究者は、共通の流体の流れ内に存在し、既に検証され、静的な組織モデルを組み合わせることができる。 図1は、可能なMOC単一組織または多組織の同時培養の実験設備の概略図を示す。組織生検、インビトロで一次細胞株または初代細胞からの組織等価物を96ウェル細胞培養インサートを使用して、または組織培養区画内に直接配置することのいずれかによって培養することができると生成さ。細胞培養区画を相互接続するチャネルシステムは、100μのようにM高は、これらの寸法を超えた組織等価物は、培養区画内に保持されます。主要HDMECsとMOC回路の内皮化は生物学的な血管構造を提供することにより、前進、より生理的な培養条件に向けた更なるステップを可能にします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig1highres.jpg" width="700" /> 図1：MOC文化の略図組織等価物は、MOCに接種し、動的条件下での単一培養または共培養として栽培、標準インビトロ条件下で調製されている。毎日のメディアサンプルとエンドポイント分析が行われる。ポンプを駆動する空気圧が上からMOCに接続された3つの青のチューブを介して適用されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52526/52526fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </a&gt; 図2に示すように、内皮化プロトコルに続いて、マイクロ流体チャネル回路のコンフルエントHDMECカバレッジは、動的培養の4日以内に得られる。細胞は、容易に、MOCチャネルの壁に付着し、コンフルエントな単層を作成し、せん断に沿って細長い応力（ 図2B）。以前に報告されたように9さらに、細胞は、チャネルの全周をカバーする。内皮細胞形態におけるさらなる変化は、培養終了時まで培養4日後に観察されなかった。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig2.jpg" /> 図2：内皮MOCチャンネルヒト皮膚微小血管内皮細胞（HDMEC）は、マイクロ流体回路内のコンフルエント単層を形成した。細胞は、MOC文化の23日後にアセチル化LDLで染色した。 （A）全体メートルicrovascular回路は、せん断応力に沿って細長い細胞および（B）細胞で覆われていた。スケールバー：（A）が1000μm及び（B）は100μm。 13 -このモデルシステムは、以前の薬物代謝研究11に適していると報告されたように、別の実験では、一貫性のある円盤状の肝細胞スフェロイドは、懸滴培養の2日間HepaRGとHHSteCから形成される。デモのために、各MOC回路の一方の組織培養区画96ウェル細胞培養インサート20スフェロイドを播種した組織は、非内皮MOCSを使用して動的条件下で14日間以上培養した。主要材料の凝集または量の任意の数の直接的区画に又は細胞培養インサートを使用して統合することができる。 MOCから検索した後にスフェロイドの免疫蛍光染色は、李のための強力な、均質な発現を示している版-典型的なサイトケラチン8/18と位相が、私は、酵素チトクロームP450 3A4および7A1代謝（ 図3Aおよび3B）。小管輸送体、多剤耐性タンパク質2（MRP-2）の染色は、偏表現型と基本的な毛細胆管様のネットワーク（ 図3C）の存在が明らかになった。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig3.jpg" /> 図3 :. MOCにおけるヒト人工肝臓マイクロ組織培養。MOCで14日間培養肝凝集体（A）サイトケラチン8/18（赤）及び（B）チトクロームP450 3A4（赤）および7A1（緑色）について染色した。 （C）小管輸送体MRP-2（緑色）の発現は、青色核染色。スケールバー：100μmである。 アルブミンの産生が肝組織培養のいずれかの必須の前提条件であるように、ハチを有するN MOCにおける肝臓の典型的な活動を監視するために選択。アルブミン産生のために毎日の培地試料を分析して、静置培養（ 図4）に、および文献11に報告された値と比較して、MOC培養における生産速度の有意な増加を示している。アルブミン合成速度の増加は、MOC培養において増大した酸素と栄養の供給に起因している可能性があります。したがって、MOCは、アルブミン産生肝臓に典型的な挙動を、高め、代謝的に活性な状態で14日間の培養期間にわたって肝臓凝集体を維持することができる。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig4.jpg" /> 図4：MOC中と静的培養での肝の単一組織培養物のMOCアルブミン産生におけるフォーティーン日間の肝スフェロイドパフォーマンス 。データは、平均±SEMである（n = 4）を。 CHEのSubsystemic反復投与毒性試験OECDガイドラインなしで定義されている動物でのmicalsや化粧品は、曝露の21〜28日を必要とします。 410「用量経皮毒性繰り返し：28分の21日間の研究を「長期皮膚肝共培養は、規制要件に対応するために最大28日間、ここで例示されている。気液界面を、96ウェル細胞培養インサートに皮膚生検を培養することにより、後に皮膚物質の曝露のために提供される。共培養実験は、複合メディア回路における三組織の共培養は、生存可能で、28日間の代謝活性のある保つことができるかどうかを証明するために内皮MOCSに例示的に行われている。 培地上清中のLDH活性の分析は、その後、約80 U / lの（ 図5）で一定に滞在し、培養の最初の8日間、着実に減少するレベルを明らかにした。これが後の時点で、システム内の人工なく、安定した組織の代謝回転を示している。肝臓のシングルに3組織共培養の比較-tissueと肝臓 - 内皮共培養実験、大幅に減少したLDHレベルは、特に皮膚を含まない培養中の最初の日の間に、見つけることができた。皮膚単一組織MOC培養は明らかなように、高LDH活性のこの最初の期間内に細胞死が（データは示さず）、皮膚の培養区画に主に発生した。これは、皮膚のパンチの結果として生検を囲む創傷領域に起因する可能性があります。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig5.jpg" /> 図5：内皮MOCにおける内皮MOCS（MOCのLi-VA）と肝臓·皮膚共培養における肝臓の単一組織培養物（MOC Li）と、肝臓培養のメディア上清中のMOC LDH活性のフィフティーン日間の組織のパフォーマンス （MOCリー-Va-SK）。データは、平均±SEMである（n = 4）を。 28日間の培養期間の間、肝スフェロイドはMOC aの底に付着したND細胞は、隣接するスフェロイド間の多層接続を形成する、から生まれました。これは、組織の機能を妨げませんでした。免疫蛍光法によるエンドポイント解析は、シトクロムP450 3A4染色（ 図6A）によって示されるように肝細胞スフェロイドは、MOC共培養の28日後に依然として代謝的に活性であることを示した。ビメンチン染色（ 図6B）に示すようにHHSteCは、肝臓全体に相当全体に分布していた。ビメンチン染色強度の増加は、細胞が、スフェロイドから成長した領域で観察することができた。フォン·ヴィレブランド因子（vWF）の染色は、内皮細胞が組織に深く浸透していなかったことを示したが、外肝細胞（ 図6C）との直接細胞-細胞接触していた。 スタティックコントロールの染色はelevatを示しながら、皮膚生検の免疫組織化学染色は、基底膜（ 図6D）にテネイシンCとコラーゲンIVの発現を示したテネイシンC（ 図6E）のレベルを編。テネイシンCは、創傷治癒、炎症過程および線維症の間にアップレギュレートされることが示されている動的な培養物14,15における線維静的の処理ではなく、誘発を示唆している。 MOCで28日間共培養後の組織の安定した細胞生存率および機能性は、システムが共通の媒体回路に最大3つの組織の組み合わせを維持することができることを証明する。初代細胞、ならびに組織モデルおよび生検は、MOCシステムで同時に培養することができる。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52526/52526fig6highres.jpg" width="700" /> 図6：28日間の多組織培養物の性能肝臓同等物及び皮膚生検は、内皮MOC中で培養し、細胞機能は、Iは、シトクロムP450酵素（A）相の免疫染色によって示された3A4肝臓組織中（赤）、（B）、ビメンチン（赤）、（C）サイトケラチン8/18（赤）およびvWF（緑色）。静的な条件下でのMOCまたは（E）で28日間（D）のための共培養皮膚生検は、テネイシンC（赤）とコラーゲンIV（緑）、ブルー核染色のために染色した。 MOC培養の28日後の皮膚の（F）H＆E染色。スケールバー：100μmである。

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The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture | Bioengineering | Video

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

多臓器チップ - 長期マルチ組織の共培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

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28.4K ビュー.  Technische Universität Berlin. Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

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High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

マイクロ流体プラットフォームを使用した高スループットのタンパク質発現ジェネレータ

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

生物工学

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

ICPMSサンプル導入のためのマイクロ流体チップ

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

二層流体プラットフォームシロイヌナズナ実生の根毛の形態のイメージング

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

ドライ フィルムのレジストを用いた電気化学マイクロ流体バイオ プラットフォーム: デバイス作製、チップの試金の準備、およびシステム操作

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける縦断的イメージングのためのマイクロ流体プラットフォーム

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

長期無細胞遺伝子発現の伝導のための多層マイクロ流体プラットフォーム

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

動的圧縮で軟性細胞を刺激するマイクロ流体プラットフォーム

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...