このプロジェクトは、NIHからQ.李に、衝撃ファンドによるUABの医学部からQ.李への助成金1R03M​​H08127-01と7R03MH08127-02でサポートされていました。 Molette基金とオーバーン大学からのサポートが認識されている。また、作業の過程で氏PULINチェ氏と国立歌Musiienkoから技術の処遇に感謝します。

1。細胞、ウイルスや抗ウイルス化合物<ol><li>ダルベッコ改変イーグル5％ウシ胎仔血清（FCS）を含む培地（DMEM）、100U/mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンで、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞10の誘導体をBSR細胞を維持する。 </li><li>すべての3つのアッセイのために、1％のFCS、100U/mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを含むDMEM中で、プレートの細胞、5以前に最適化された。この培地は、3つのすべてのアッセイのためのアッセイ培地と呼ばれる。 </li><li> 5％CO 2及び80〜95％の湿度で、37℃のインキュベーター内のすべてのセルをインキュベートする。 </li><li>プラーク精製し、以前に説明したように8種類10 BTV（BTV-10）を伝播する。指定された各アッセイのためのアッセイ培地中BTV-10を希釈する。 </li><li> 10mMで濃度のストックを形成するために、DMSO中のすべてのテスト化合物を溶解。 -20℃で在庫を保管して</li><li>指名するためのアッセイ培地を用いて所望の濃度に化合物を希釈するDアッセイ2。 </li></ol> 2。 CTGキットを使用して、CPEベースのアッセイ<ol><li> MicroFlo選択ディスペンサーを経由して、384ウェルマイクロプレート（16×24でフォーマット黒）へのシードBSR細胞。播種密度は十分に5000細胞/であり、播種量は抗ウイルス効果の分析のために20μLです。 </li><li>細胞が完全にプレートに付着し得るまで2〜3時間細胞をインキュベートする。 </li><li>各ウェルに10μMの最終濃度の抗ウイルス化合物を加える。それを完全に混ぜる。 </li><li>希望の力価とBTVを希釈し、各ウェルに5μL表記MOIでBTVを追加します。うまく制御のために、アッセイ培地の5μlを加える。 5％CO 2及び80〜95％の湿度で、37℃で72時間感染させた細胞をインキュベートする。 </li><li> 72 hpiの、解凍し、使用前に室温までCTG緩衝液および凍結乾燥さCTG基板を平衡た。目に記載の凍結乾燥された酵素/基質およびバッファー試薬を混合して均質CTG試薬溶液を再構成するEメーカーの指示に従ってください。 </li><li> 15分間室温にアッセイプレートを平衡化させます。 </li><li>ディスペンサーにより各ウェルにCTG試薬を等量の（25μL）を追加します。暗所で室温で15分間インキュベートした後、0.1秒の積分時間でマルチモードリーダーを用いて発光シグナルを測定する。 </li></ol> 3。用量反応アッセイ<ol><li>それぞれ/ウェル抗ウイルス効果の検定のための20μLおよび細胞毒性アッセイのために25μL、播種量の5000細胞の播種密​​度とディスペンサーを経由して、（16×24でフォーマット黒）、384ウェルマイクロプレートにシードBSR細胞。 </li><li>細胞まで、5％CO 2及び80〜95％の湿度で、37℃で2〜3時間、細胞をインキュベートを、ウェルプレートに取り付けられている。 </li><li> 表1に示すように、（96ウェルプレートに相当）各化合物の384ウェルプレートの四分の一領域におけるプロセスのアッセイ。各濃度について8回の反復を割り当てる単一のアッセイ中。唯一の化合物を含まないウイルスを追加することによって、ネガティブコントロールとして化合物とウイルス、および最後の列（12 回目 ） を追加することなく、ポジティブコントロールとしての最初の列を割り当てます。 </li><li>アッセイ培地中に50μMの化合物を希釈し、20μL/ウェルの抗ウイルス効果の検定のための2 番目の列に追加します。 25μMの濃度に8チャンネル半自動ピペットを用いて、化合物を5回混合する。 </li><li> 8チャンネルの半自動ピペットを用いて、12.510μMの濃度を形成するために、よく混ぜ、次の列（ 第 3）に2 番目の欄に20μlの混合物を移す。 6.2510μMの濃度で別の2倍希釈を形成するために、次の列（4 回目 ）に3 番目の列から20μlの混合物を転送することにより、このプロセスを繰り返します。 11 列目まで、この2倍連続希釈を繰り返します。吸引し、COMPを追加し、混合した後に11 番目の列内の混合液20μlを捨てるound。 </li><li> 5μL/ウェルの容量でカラム11に列2から、各ウェルに、BTV-10、0.01のMOIに基づいて追加します。ウイルスを追加した後、各列の最終化合物濃度は次のようになります。列2が20μm、列3が10μm、および0.04μMの最終濃度でカラム11まで2倍希釈を継続した。 </li><li>カラム1に、媒体の5μl加え、細胞のみ（ポジティブ）コントロールとBTV感染として塔12へのBTVの5μL/ウエルのみのコントロール（負）として。 </li><li>細胞毒性アッセイのために、200μMの初期濃度に化合物を希釈する。同様に、100μMの濃度に列2および8チャンネルの半自動ピペットで混合5Xへの化合物の25μL/ウェルを追加。 BTVを追加しないでください。 </li><li>隣の列3、列2から25μLを吸引することで2倍系列希釈を実施し、最後の列（12日）まで継続。コラム12で、混合した後、吸引し、Mの25μLを破棄ixture。コラム2の最終濃度は100μMであるべきであり、12 番目のカラムには0.2μMである必要があります。列1はコントロール細胞である。 </li><li>両方の抗ウイルス効果および細胞毒性アッセイのために、5％CO 2および72時間後に治療のために80〜95％の湿度で、37℃でプレートをインキュベートする。上述したように（プロトコルが2.5〜2.7ステップ）CTGキットを用いて細胞生存率を測定する。 </li></ol> 4。時間型追加（TOA）アッセイ<ol><li> 5000細胞/ウェルで分配し、播​​種量を経由して15μL/ウェルで、384ウェルマイクロプレートの列1月24日（×24×16のフォーマットは黒）から種子BSR細胞。 </li><li>各化合物について、384ウェルプレート（ 表2）の半分の各時点8つのレプリカとすべて二十から四列を利用する。 10μL/ウェルのアッセイ培地を添加することにより、細胞のみのコントロールとして、列1を割り当てます。 5μL/ウェルのアッセイ培地ANを追加することで、BTV感染制御のみ（ネガティブコントロール）などのマーク欄240.01のMOIでD 5μL/ウェルウイルス/ウェル25μlの最終体積に。 </li><li>異なる時間後に感染（HPI）でカラム2月22日のような抗ウイルス効果の評価欄から偶数列を選択します。これらの列では、0.01のMOIで5μL/ウェルBTVで細胞を感染させる。別のHPIで、また/ウェル25μlの最終容量を形成するために、各ウェルに5μL/ウェルの希釈された化合物を追加します。示さ-2と-1 HPI前BTV感染にBSR細胞に化合物を添加してください。 0 HPIの場合は、同時に文化に化合物およびBTVを追加します。 </li><li>並行して、（-2、-1、0、1、2、4、8、16、指定されたように、異なる時点で添加された化合物を、唯一の対照化合物としてカラム3-23の奇数列を指定する24、48 HPI）。これらの列では、5μL/ウェルのアッセイ培地を追加し、5μL/ウェルウェル25μL/の最終容量を形成するために化合物を希釈した。 </li><li>処理後、80〜95％湿度で37°C、5％CO 2で細胞をインキュベートする。 </li><li>前述したように（プロトコルは2.5〜2.7ステップ）のCellTiter-グロキットを使用して72 HPIで細胞生存率を測定。 </li></ol> 5。データ解析<ol><li>マルチモードリーダーを介して得られた発光シグナルに基づいて、適切なインハウスソフトウェアを使用して、最初にすべてのデータを処理する。 10パーセントを超えない値を必要と平均値（平均）は、それぞれの治療のための標準偏差（STDEV）だけでなく、係数の変動（CV）を、決定する。 </li><li>生物静力学およびグラフィックソフトウェアツールに上記のソフトウェアから処理されたデータを転送します。 EC 50およびCC 50の値を決定するために、非線形回帰分析を行う。 </li></ol>

<ol>
	<li>Hemati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bluetongue+virus+targets+conventional+dendritic+cells+in+skin+lymph.">Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph.</a> J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Virostatic+Agents+against+Bluetongue+Virus.">Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus.</a> PLoS ONE. 7, e43341 (2012).</li><li>Meiswinkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2006+outbreak+of+bluetongue+in+northern+Europe--the+entomological+perspective.">The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective.</a> Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).</li><li>Szmaragd, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+and+case+fatality+during+the+recurrence+of+BTV-8+in+northern+Europe+in+2007.">Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007.</a> Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).</li><li>Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+and+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Bluetongue+virus.">Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus.</a> Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).</li><li>Noah, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+luminescence+assay+is+effective+for+high-throughput+screening+of+potential+influenza+antivirals.">A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals.</a> Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).</li><li>Che, P., Wang, L., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+optimization+and+validation+of+an+assay+for+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Dengue+virus.">The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).</li><li>Li, Q., Li, H., Blitvich, B. 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Virol. 73, 251-259 (1999).</li><li>Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+human+rhinovirus+infectivity+cell-based+assay+for+identifying+antiviral+compounds.">Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds.</a> J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).</li><li>Harvey, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-inducible+packaging+cell+line+for+production+of+flavivirus+replicon+particles.">Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles.</a> J. Virol. 78, 531-538 (2004).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triaryl+pyrazoline+compound+inhibits+flavivirus+RNA+replication.">Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+protection+against+the+highly+pathogenic+H5N1+influenza+virus+by+an+antisense+phosphorothioate+oligonucleotide.">In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide.</a> Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).</li><li>Ray, D., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+flavivirus+antiviral+drug+discovery+and+vaccine+development.">Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development.</a> Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).</li><li>Severson, W. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+potent+small+molecule+inhibitor+of+hemorrhagic+fever+New+World+arenaviruses.">Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses.</a> Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).</li><li>Van Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+cellular+screening+assay+for+the+discovery+of+HIV-1+integrase+inhibitors.">A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors.</a> J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).</li><li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses.">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li><li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques.">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

抗ウイルスヒットの最初の同定については、抗ウイルス薬の発見および開発のための重要なステップの一つは、定量化可能なマーカーを選択する簡単なプロトコルを開発し、十分な信号及び10％未満のCVを求める含む、堅牢なアッセイを開発することである。ほとんどの生化学的または細胞ベースのスクリーニングは、スクリーニングプロセスで必要な再現性及びスクリーニングされる分子の...

BTV属オルビウイルス 、 レオウイルス科に試作品の二本鎖RNAウイルスである。 BTVは、世界中の1,230億ドル/年の損失と、ヒツジ、ヤギ、牛や他の家畜動物を含む家畜の中で最も重要な疾患の一つです。エキゾチックBTV血清型は、に記載されている重要な動物の病原体である「米国農務省ハイ帰結家畜病原体。 &quot;最近では、再興BTVの北欧3,4間でいくつかの国で牛や羊の病気の大発生を引き起こした。その経済的重要性の結果として、モデル系として、BTVは、広範囲の分子遺伝学的および構造的研究の主題であった、いくつかのワクチンが開発されている。しかし、抗ウイルス薬の発見のための適切なアッセイがないために、BTVに対して利用可能な抗ウイルス薬は存在しない。 モデル系としてBTVを用いた最近のハイスループットスクリーニング（HTS）のキャンペーンでは、dは、eveloped最適化され、アルボウイルス5に対する潜在的な広域スペクトル抗ウイルス薬を識別するために、CPEベースのアッセイを検証しました。 CPEベースのアッセイは、迅速かつ観察可能なCPE /アポトーシスを誘導した5-7多数のウイルスに対する抗ウイルス薬物の発見に使用されている十分に認識アッセイである。我々のシステムでは、ポストBTV感染、CPEは、HeLa、BSRおよびHEK 293T 8を含む脊椎動物細胞において明らかである。 BTV誘発CPEを監視し、セルタイターグロ細胞生存度試薬キット（CTGキット）9を含む種々の細胞生存率検出法を用いて定量することができる。このキットは、代謝的に活性な生細胞の存在を示す細胞のATPの定量に基づいて培養物中の生存細胞の数を提示し、決定する。最適化された条件下で、ここに提示され、CPEベースのアッセイは、「ミックスと測定」1段階プロトコル、および安定した発光シグナルと柔軟性との実現可能性を示した。一方、毒性化合物REDUcing細胞生存率は、このCPEベースのアッセイで除外されます。 CPEベースのアッセイは、BTVに対する抗ウイルス薬の発見のためにその堅牢性と信頼性を示し、潜在的な抗ウイルス鉛化合物（Sの6小説クラスターの同定をもたらすNIH分子ライブラリ小分子リポジトリ（MLSMR）をスクリーニングするために使用されています）5。 潜在的な抗ウイルス化合物はCPEベースのアッセイを用いて同定された場合には、抗ウイルス効果および細胞毒性2の範囲を決定するために、10濃度の用量応答アッセイに供される必要がある。抗ウイルス効果は、50％阻害濃度（IC 50）又は50％有効濃度（EC 50）として表される、ベースラインと最大値の間のウイルス誘導CPEを半阻害する薬物の濃度である。抗ウイルス剤の細胞毒性は、50％細胞毒性濃度（CC 50）、 すなわち 、濃度ベースラインと最大値との間の細胞毒性の50％を誘導する薬剤である。 50％のSI（SI 50）と表記の選択指数（SI）は、ウイルス誘発CPEに対する抗ウイルスの特異性を決定する、CC 50 / IC 50から計算されます。 IC 50（またはEC 50）は 、CC 50およびSI 50値は、抗ウイルス化合物は強力な、さらなる薬物開発のために選択的であるかどうかを決定する重要な尺度である。 抗ウイルスがインビトロで明白な毒性を示さなかった、まだ防止ウイルスはCPE及び生産的なウイルスのライフサイクルを誘導した場合には、そのMOA 2を特徴付けることが重要である。我々は、抗ウイルスによって影響されるウイルスのライフサイクルの可能な工程（単数または複数）を決定するためのToAアッセイを行うことにより、このような特徴付けを開始した。一般に、抗ウイルス化合物を、異なる時間前又は後のウイルス感染で細胞に添加した。抗ウイルスが感染した細胞に添加した場合のその標的へ投稿前のステップに添加されたものと比較した場合、TEPは、感染の過程で、より低い活性をもたらすであろう。したがって東亜の研究では、いずれかのウイルスのライフサイクルまたはウイルスのライフサイクルに関与するホスト機器に、化合物の抗ウイルス効果、およびその潜在的なターゲットを決定するために重要である。 3つ全てのアッセイについて、細胞生存率を、製造業者の指示5以下CTGキットを用いて決定した。この検出システムは、様々なインハウスソフトウェアを使用して分析することができる適切な発光信号を出力する。各アッセイは、少なくとも8レプリカを三重に検証され、実施された。すべての得られたデータについては、平均値（AVE）、標準偏差（STDEV）、および共効率的変動（CV）を含む三のパラメータは、アッセイのロバスト性を決定するために分析した。アッセイのロバスト性が決定されると、データは、さらに分析し、種々の生物静力学およびGRAPHIを用いてプロットされCツール2。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1134218</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1000185</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gbico</td>
			<td>1049769</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>TB288</td>
			<td>For cell viability measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Diluted from 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiviral huashilcompounds</td>
			<td>NIH MLSMR and de novo synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTV-10</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSR cell</td>
			<td>Developed in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For luminescent signal reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo select dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Adding cells, virus, and reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom microplate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>28908031</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen. 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 5</td>
			<td>For biostatic analysis and plot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus

BTVに対する潜在的な抗ウイルス剤を同定するために、我々はここで紹介する3つのアッセイを開発し、最適化および検証されています。 CPEベースのアッセイは、化合物は、任意の抗ウイルス効果を示し、大きな化合物ライブラリーをスクリーニングするために使用されているかどうかを評価するために開発された最初のアッセイであった。一方、抗ウイルス剤の細胞毒性はまた、CPEベースのアッセイを用いて評価することができる。用量応答アッセイは、 すなわち 、50％阻害濃度（IC 50）または有効濃度（EC 50）、ならびに細胞毒性のその範囲（CC 50）、選択された抗ウイルス効力のための範囲を決定するために設計された。のToAアッセイはBTVウイルスのライフサイクルやホスト細胞機構に影響の可能性の間に新たな抗ウイルス剤の基本的なメカニズムを決定するために、最初のMOAの研究のために使用した。これらのアッセイは、細胞培養系における抗ウイルス効果を評価するために不可欠であり、我々の最近の研究のために使用されているリードBTVに対する新規抗ウイルス薬の数の同定にING。

1。化合物の抗ウイルス効果細胞ベースのCPEアッセイは、以前に開発され最適化され、2,5記載のようにBTVに対する新規抗ウイルス薬を同定するために、発光ベースのCTGキットを用いてin vitroで検証した。 10用量応答アッセイは、生細胞5,11で提示細胞のATPの定量に基づいて培養物中の代謝的に生存可能な細胞の数を測定することによって同定されたリー...

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Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

細胞変性効果（CPE）ベースのアッセイ、用量応答アッセイとTime-of-付加（TOA）アッセイを含む3つのアッセイは、同様に、開発され最適化され、検証され、ブルータングウイルスに対する新規な抗ウイルス（BTV）を識別するために利用されている新たに同定された抗ウイルス薬のための可能な作用機序（MOA）を決定するように。

タングウイルスに対する新規抗ウイルス剤の同定のためのアッセイ

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.9K ビュー.  University of Alabama at Birmingham. 細胞変性効果（CPE）ベースのアッセイ、用量応答アッセイとTime-of-付加（TOA）アッセイを含む3つのアッセイは、同様に、開発され最適化され、検証され、ブルータングウイルスに対する新規な抗ウイルス（BTV）を識別するために利用されている新たに同定された抗ウイルス薬のための可能な作用機序（MOA）を決定するように。 

ビデオ: Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

プラークアッセイを通じてウイルス濃度の測定：伝統と新しいオーバーレイシステムの使用

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

免疫・感染学

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

C型肝炎ウイルスに対するヒトラクトフェリンの細胞取り込みおよびそれに関連する抗ウイルス活性を監視するために、免疫蛍光

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

抗ウイルス化合物の同定および評価のための早期のウイルス侵入アッセイ

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

ヒト好中球由来の巨大食細胞の新規亜集団の開発および同定<em&gt;インビトロ</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

蛍光ベースのノイラミニダーゼ阻害アッセイ抗ウイルスのノイラミニダーゼ阻害剤クラスにインフルエンザウイルスの感受性を評価します

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

全血豚で表されるコーディングおよび非コーディングの RNA クラスの識別

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...