אנו מודים לד&quot;ר איב L. יאנין על הערותיו הפורה והצעות. ברצוננו להודות לHH גד לChik / רן וג Combredet לתמיכה הטכנית שלה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון פסטר, המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique (CNRS), המכון הלאומי דה לה סנטה et de la משוכלל ונדיר Médicale (INSERM), קרנו Institut - Infectieuses חוליי פסטר (סטינג התכנית לPOV וHM- L), Nationale סוכנות הידיעות לשפוך la משוכלל ונדיר (ANR-RPIB, תכנית סטינג 2.0 לPOV), ואת &quot;Conseil d&#39;האזורי Ile-de-צרפת&quot; (כימי ספריית הפרויקט, מענקי N ° אני 06-222 / R ואני 09-1739 / R כדי HM-L.). העבודה על CHIKV / רן נתמכה על ידי ArbOAS הפרויקט (מענק ANR 2010-INTB-1601-1602).

1. הכנת צלחות בת 96 היטב עם תרכובות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז צלחות אם 96 היטב המכילות 10 פתרונות מניות מ&quot;מ של תרכובות כימיות בDMSO מ-20 ° C לטמפרטורת חדר. תרכובות לדלל 5x בDMSO להשיג צלחות דילול 96 היטב ביניים ב2 מ&quot;מ. דילול מושגת על ידי pipetting 5 μl ל20 μl של DMSO וערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 1 מצלחות דילול לתוך בארות יבשות של צלחות 96 היטב תרבית רקמה לבנה, מסומן בבר. סט ראשון זה של צלחות בתו (D1) ישמש כדי להעריך את הרעילות של תרכובות בריכוז סופי של 20 מיקרומטר. צלחות בתו חנות ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרכובות שוב 1:10 ידי pipetting 4 μl מצלחות דילול ל36 μl של DMSO וערבוב. μl פיפטה 1 לתוך בארות יבשות של חלק תחתון לבן, שטוח, תרבית רקמה המסומנת בשורת צלחות 96 בארות. סט שני זה של צלחות בתו (D2) ישמש כדי להעריך את העיכוב של replicatio MVn על ידי תרכובות בריכוז סופי של 2 מיקרומטר. צלחות בתו חנות ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li></ol> 2. הכנת תא תרבויות לקביעת רעילות מתחם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי HEK-293T ב 37 ° C ו 5% CO 2 במדיום של הנשר (DMEM) שונה Dulbecco עם L-גלוטמין התייצב ותוספת 10% בסרום עוברי עגל (FCS), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) ופניצילין (100 IU / ml). תאי passaged ידי trypsinization כל 4-5 ימים, ובדילול מלא 01:10 לתוך בקבוק טרי. תאים צריכים להיות בשלב יומן לניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של הניסוי, לשחזר תאים על ידי trypsinization ולבצע ספירת תאים. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה, וresuspend אותם ב3 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום התרבות. קח בחשבון ש12.5 מיליליטר של השעיה תא נדרשים לכל צלחת הקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים לשוקת, ולוותר על השעיה תא 100 μl בצלחות D1 מכילים compo הכימי ממוסמרunds. תא השעיה בתוך השוקת נסערת באופן קבוע, כדי למנוע שקיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספייק שליטת בארות A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 וG12 עם μl 1 של DMSO. בארות מקבילים תשמש כנקודת התייחסות לתאי חיים (לא רעיל). ספייק B1 בארות שליטה, D1, F1, H1, B12, D12, F12 וH12 עם 1 μl של DMSO ו2.5 μl של פתרון IGEPAL 0.5% כדי להרוג תאים. בארות מקבילים תשמש כנקודת התייחסות לתאים מתים (רעילות גבוהה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 24 שעות על 37 ° C ו 5% CO 2. </li></ol> 3. הכנת תרביות תאים נגועות על ידי rMV2/Luc <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצמוח ולהתאושש תאים כמתואר ב2.1 ו2.2. שוב, תאי resuspend ב3 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום התרבות. קח בחשבון ש12.5 מיליליטר של השעיה תא נדרשים לכל צלחת הקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: מדיום תרבות תוסף עם uridine ב20 מיקרוגרם / מיליליטר. הערה: כאשר הקרנת ספריות כימיות לreplicatio ויראליn מעכבים, נראה כי תרכובות מיקוד שלבים מוקדמים של מסלול ביוסינתזה פירימידין לעתים קרובות מבודדים 13,16,27,28. התוספת של uridine למדיום התרבות משמשת לסינון מולקולות אנטי כזה. ואכן, זה ביעילות משחזר את השכפול נגיפי, כאשר אנזימים במעלה הזרם של מסלול ביוסינתזה פירימידין חסומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציל 1:10 של השעיה תא לבארות שליטה עם תאים שאינם נגועים, ולהמשיך לזיהום עם נפח שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את הנפח המתאים של פתרון מניות rMV2/Luc. פתרונות מניות MV הם בדרך כלל ב10 6 -10 8 חלקיקים זיהומיות לכל מיליליטר. תרבות חייבת להיות נגועה ב0.1 חלקיקים זיהומיות של rMV2/Luc לתאי מטרה, אשר תואמים את 0.1 ריבוי של זיהום (משרד הפנים). הערה: rMV2/Luc נגזר מחיסון MV (זן שוורץ) והוא מניפולציה בסביבת BSL2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את הווירוס להשעיה תא ומערבבים בעדינות. העבר את התאים נגועים לשוקת, ולוותר 100μl של השעיה תא נגועה בעמודות 2-11 של צלחות D2 המכילות תרכובות כימיות ממוסמר. תא השעיה בתוך השוקת היא מעורבת באופן קבוע בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעמודות 1 ו 12, לוותר של תאים שאינם נגועים 100 μl גם על שניים. תאים נגועים הם ויתרו בבארות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 24 שעות על 37 ° C ו 5% CO 2. </li></ol> 4. מודד את פעילות בלוציפראז וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלחות D1 מהחממה, ולקבוע כדאיות סלולריות על ידי הוספת 50 μl של מגיב כדאיות מבוסס לוציפראז ישירות לבארות תרבות. לערבב דגירה עבור 10 דקות בטמפרטורת חדר. קראו צלחות עם luminometer. זמן אינטגרציה מוגדר היטב לכל 100 אלפיות שניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלחות D2 מהחממה, ולקבוע את פעילות על ידי הוספת לוציפראז 50 μl של מצע לוציפראז ישירות לבארות תרבות. דגירה במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר, ולקרוא צלחות עם luminometer כdescriמיטה לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב גורם Z&#39;לכל צלחת D1 של assay הרעילות כדי להצדיק את האיכות של המסך 29. Z &#39;= 1-3 (σ + + σ-) / (μ + * - μ-), שבו μ + ו σ + מתאימות לאמצעי הארה וסטיות תקן לתאי HEK-293T עם DMSO לבד (לא רעיל), וμ-וσ-הוא אמצעי להארה וסטיות תקן לבארות התרבות טופלו IGEPAL כדי להרוג תאים. Z &quot;צפוי להיות מעל 0.5, או הצלחת המקבילה נמחקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סף רעילות בμ + / 2. בטל תרכובות עם ערכי הארה להלן (איור 3 א) ניתוק זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב גורם Z&#39;לכל צלחת D2 של assay אנטי. הנה, μ + ו σ + מתאימות לאמצעי הארה וסטיות תקן לתאים נגועים בתרבית עם DMSO לבד, וμ-וσ-הם אמצעי להארה וסטיות תקן לתאים שאינם נגועים. שוב, צלחות עם Z &amp; #39; ערכים מתחת 0.5 מבוטלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את העיכוב בשכפול נגיף כמו בצע: אחוז העיכוב = (μ + - פעילות לוציפראז לX מתחם) / (μ + - μ-) * 100. הגדרת סף עיכוב ב75%, ובחר תרכובות ששני להפחית ערכי הארה מתחת חתך זה (איור 3 ב) ואינן רעילים על פי קריטריונים שתוארו ב4.4. </li></ol> 5. מסך משני לרעיל וספקטרום הרחב אנטי פעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו 01:02 דילולים סידוריים עבור כל נפגעו מתחם בDMSO, החל מ500 מיקרומטר עד 4 מיקרומטר (8 דילולים). מלא צלחות הלבנות, המסומן בשורת רקמת תרבות עם 50 μl של מדיום התרבות. הוסף 1 μl של דילול כל מתחם בבארות תרבות. חזור פעמיים יש 3 צלחות תרבות עם דילולים סדרתי כפולים עבור כל מתחם להיט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 37.5 מיליליטר של השעיה תא HEK-293T ב6 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום התרבות כפי שתוארו לעיל (ב2.1 ו22). לוותר 2x 12.5 מיליליטר בצינורות בז ולהדביק תאים עם או rMV2/Luc במשרד הפנים = 0.1 או CHIKV רקומביננטי להביע לוציפראז Renilla (CHIKV / רן) במשרד הפנים = 0.2. מערבבים על ידי היפוך. הערה: CHIKV / רן נגזר מזן פראי סוג של CHIKV ולכן צריך לטפל בסביבת BSL3. ניתן להעביר צלחות מBSL3 לBSL1 פעם מצע Renilla נוספה בארות תרבות (ראה להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 50 μl של תאים נגועים ב-רן נגוע, rMV2/Luc-infected, או CHIKV / בתרבות צלחות המכילות דילולים סדרתי של תרכובות להיט. דגירה 24 שעות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של מצע גחלילית בלוציפראז לקבוע פעילות גחלילית לוציפראז בבארות rMV2/Luc-infected. הוסף 50 μl של מצע לוציפראז Renilla לקבוע פעילות לוציפראז Renilla בCHIKV בארות / נגועים ברן. לבסוף, להוסיף 50 μl של מגיב assay הכדאיות מבוסס לוציפראז לתאים נגוע כדי לקבוע כדאיות סלולרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתונים עלילה (Figure 4) ולקבוע ריכוזי מתחם פגעו המעכבים MV ושכפול CHIKV ידי 50%. להתעלם מתחם מראה כמה רעילות בassay זה. </li></ol>

<ol>
	<li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+drugs+in+current+clinical+use.">Antiviral drugs in current clinical use.</a> J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).</li><li>Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervention+strategies+for+emerging+viruses:+use+of+antivirals.">Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals.</a> Curr Opin Virol. , (2013).</li><li>Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+to+inhibit+the+replication+of+RNA+viruses.">Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses.</a> Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).</li><li>Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predominant+mechanism+by+which+ribavirin+exerts+its+antiviral+activity+in+vitro+against+flaviviruses+and+paramyxoviruses+is+mediated+by+inhibition+of+IMP+dehydrogenase.">The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase.</a> J Virol. 79, 1943-1947 (2005).</li><li>Wang, B. X., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+viruses+and+interferons.">The yin and yang of viruses and interferons.</a> Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).</li><li>Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+advances+in+the+treatment+and+prevention+of+respiratory+syncytial+virus.">Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus.</a> Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).</li><li>Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+and+the+host+response+to+viral+infection.">Systems biology and the host response to viral infection.</a> Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).</li><li>Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Approaches+towards+the+Development+of+Host-Directed+Antiviral+Therapeutics.">Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics.</a> Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).</li><li>Connolly, D. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+Toll-like+receptor+targeted+therapeutics.">New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2012).</li><li>Thakur, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+activators+of+RNase+L+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).</li><li>Shoji-Kawata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+therapeutic+autophagy-inducing+peptide.">Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide.</a> Nature. 494, 201-206 (2013).</li><li>Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+analyst's+couch:+TLR-targeted+therapeutics.">From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).</li><li>Bonavia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+broad-spectrum+antiviral+compounds+and+assessment+of+the+druggability+of+their+target+for+efficacy+against+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).</li><li>Rider, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+therapeutics.">Broad-spectrum antiviral therapeutics.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Krumm, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+host-directed+small-molecule+inhibitors+of+myxovirus+RNA-dependent+RNA-polymerases.">Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).</li><li>Harvey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK983:+a+novel+compound+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity.</a> Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).</li><li>Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+high-throughput+screening+to+quantify+antiviral+activity+against+viruses+that+induce+limited+CPE.">A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE.</a> J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Panchal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+high-content+imaging+assays+for+lethal+viral+pathogens.">Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens.</a> J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).</li><li>Pohjala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+alphavirus+entry+and+replication+identified+with+a+stable+Chikungunya+replicon+cell+line+and+virus-based+assays.">Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening.">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).</li><li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology.">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem Biol. 17, 646-657 (2010).</li><li>Komarova, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+virus-host+interactions+in+an+infectious+context+using+recombinant+viruses.">Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses.</a> Mol Cell Proteomics. , (2011).</li><li>Henrik Gad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E2-E166K+substitution+restores+Chikungunya+virus+growth+in+OAS3+expressing+cells+by+acting+on+viral+entry.">The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry.</a> Virology. 434, 27-37 (2012).</li><li>Wang, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dengue+virus+through+suppression+of+host+pyrimidine+biosynthesis.">Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis.</a> J Virol. 85, 6548-6556 (2011).</li><li>Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D282,+a+non-nucleoside+inhibitor+of+influenza+virus+infection+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Qing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dengue+virus+resistance+to+brequinar+in+cell+culture.">Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).</li><li>Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+dihydroorotate+dehydrogenases+and+their+inhibitors+and+uses.">On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses.</a> J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).</li><li>Yoon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening-based+identification+of+paramyxovirus+inhibitors.">High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors.</a> J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).</li><li>Mar&#233;chal, E., Roy, S., Lafanech&#232;re, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , (2011).</li><li>Gentzsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+complete+life+cycle+screen+for+identification+of+small+molecules+with+pro-+or+antiviral+activity.">Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity.</a> Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).</li><li>Caignard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V+protein+of+Tioman+virus+is+incapable+of+blocking+type+I+interferon+signaling+in+human+cells.">The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

צינור ההקרנה המתואר כאן שואף בבחירת תרכובות עם פרופיל מתאים כמו מעכבי ספקטרום רחב של וירוסי RNA. כאשר ספרייה של 10,000 תרכובות הוקרן עם פרוטוקול זה וקריטריונים לסינון האמורים יושמו, כלומר עיכוב של שכפול MV מעולה ל75%, 40 תרכובות (0.4%) הבקיע חיובי. חוץ מזה, כמחצית מהם הראתה ...

וירוסי RNA אחראים למגוון רחב של זיהומי אדם, ויש לה השפעה עצומה על אוכלוסייה ברחבי העולם, הוא במונחים של בריאות ציבור ומחיר חסכוני. חיסונים יעילים פותחו נגד מספר וירוסי RNA האנושי, ונמצאים בשימוש נרחב כטיפול מניעתי. עם זאת, עדיין קיים מחסור קריטי של תרופות טיפוליות נגד נגיף RNA. ואכן, חיסונים יעילים אינם זמינים מפני פתוגנים אנושיים גדולים כגון וירוס דנגה, וירוס הצהבת מסוג C או וירוס סינסיציאלי נשימה אנושי (hRSV). חוץ מזה, וירוסי RNA אחראים למרבית מחלות מתפתחות, שגדלו בתדירות בגלל חילופים הגלובליים והשפעת אדם על מערכות אקולוגיות. נגד האיום הזה שמייצגים וירוסי RNA, הארסנל הטיפולי שלנו הוא מאוד מוגבל ולא יעיל יחסית 1-3. טיפולים קיימים למעשה מבוססים על סוג רקומביננטי אני האינטרפרונים (IFN-α / β) כדי לעורר חסינות מולדת,או הממשל של ribavirin. למרות שאופן פעולה של אנלוגי ribonucleoside זה שנוי במחלוקת וכנראה מסתמך על מנגנונים שונים, העיכוב של IMPDH הסלולרית (דהידרוגנז monophosphate inosine), אשר מכלה את בריכות GTP תאיים, הוא באופן ברור חיוני 4. Ribavirin, בשילוב עם IFN-α pegylated, הוא הטיפול העיקרי נגד וירוס הצהבת מסוג C. עם זאת, טיפולי IFN-α / β ו ribavirin הם יעילות נמוכה יחסית בvivo מול מרבית וירוסי RNA כפי שהם IFN-α / β ביעילות הבוטה איתות דרך ביטוי של ארסיות גורמים 5 ולעתים קרובות לברוח ribavirin 3. זה הוסיף לעובדה שטיפול ribavirin הוא העלאת בעיות רעילות חשובות, למרות שזה אושר לאחרונה נגד המחלה hRSV חמורה עם הטבות שנויות במחלוקת 6. לאחרונה, כמה טיפולים ספציפי וירוס כבר משווקים, בפרט כנגד נגיף שפעת עם o הפיתוחמעכבי neuraminidase ו 3. עם זאת, המגוון הגדול והופעתה הקבועה של וירוסי RNA מונע את פיתוח טיפולים ספציפיים נגד כל אחד מהם בעתיד קרוב יחסית. בסך הכל, זה מדגיש את הצורך באסטרטגיות יעילה כדי לזהות ולפתח מולקולות אנטי חזקות בעתיד הקרוב. זה טריוויאלי לומר כי מעכב ספקטרום רחב פעיל נגד פנל גדול של וירוסי RNA הייתי לפתור את הבעיה הזו. למרות שמולקולה כזו היא עדיין החלום של ירולוג, ההבנה טובה יותר שלנו מנגנוני הגנה תאיים ומערכת חיסון מולדת מראה כי כמה אפשרויות קיימות 7,8. מספר מעבדות אקדמיות ותעשייתיות עכשיו מחפשות מולקולות המעוררות היבטים ספציפיים של מנגנוני הגנה תאית או מסלולים מטבוליים כדי להקהות שכפול נגיפי. למרות תרכובות כגון כנראה להראות תופעות לוואי משמעותיים, טיפולים נגד זיהומים נגיפיים אקוטיים יהיו לנהלed לזמן קצר יחסית, מה שהופך אותם מקובלים למרות כמה רעילות פוטנציאלית בטווח הארוך. אסטרטגיות שונות פותחו כדי לזהות מולקולות אנטי ספקטרום רחב כזה. תוכניות מחקר כמה לכוון במציאת מולקולות שיעד מסלולי הגנה או חילוף חומרים ספציפיים. זה כולל, למשל, קולטנים הכרת הפתוגן לעורר ביטוי גנים אנטי 9 ולהפעיל גורמים אנטי כגון 10 RNaseL, מכונות autophagy לקדם השפלה וירוס 11, סינתזת נוקלאוזידים מסלולי 12,13, או מפלים אפופטוטיים כדי לזרז מוות של תאים נגועים בנגיף 14. קבוצות אחרות פיתחו מסכי פנוטיפי שאינם היעד מבוסס 13,15-17. במקרה זה, מולקולות אנטי פשוט זוהו על ידי היכולת שלהם לחסום את השכפול נגיפי במערכת סלולרית נתון. ההנחה הכללית היא שמתחם עיכוב 2-3 וירוסי RNA שאינם קשורים הייתי לו פרופיל מתאים לרחב spectrum מולקולה אנטי. אופן פעולה של תרכובות להיט שנבחרו עם גישה כזו אמפירית נקבע רק בפעם שנייה וסופו של דבר, עלול להוביל לזיהוי של יעדים סלולריים חדשניים לתרופות אנטי. מעניין לציין, כי ניתוח רטרוספקטיבי של תרופות חדשות שאושרו על ידי הרשות האמריקנית למזון והתרופות אמריקניות בין 1999 ו 2008 הראה כי באופן כללי, הקרנות פנוטיפי כאלה נוטים לבצע טובים יותר מאשר גישות המבוסס על יעד כדי לגלות תרופות מולקולה הקטנה הראשון ב-class 18 . שכפול נגיפי במבחנים מבוססי תאי תפוקה גבוהה נקבע בדרך כלל מהשפעות cytopathic וירוס. תאים נגועים ותרבותי ב96 - או צלחות 384 גם בנוכחות של תרכובות שנבדקו. לאחר כמה ימים, שכבות הסלולריות קבועות ומוכתם בצבעים כגון סגול קריסטל. לבסוף, הספיגה נקבעה עם קורא צלחת ותרכובות עיכוב שכפול נגיפי מזוהים על ידי היכולת שלהם לשמר את השכבות סלולריות לכאן ולכאןהשפעת cytopathic מושרה וירוס מ &#39;. לחלופין, השפעות cytopathic באופן ויראלי בתיווכם הוערכו באמצעות מבחני כדאיות סטנדרטיים כגון הפחתת MTS. מבחני כאלה הם צייתנים וחסכוניים מאוד, אך סובלים משלוש מגבלות עיקריות. ראשית, הם דורשים שילוב תאי וירוס שבו שכפול נגיפי הוא cytopathic רק כמה ימים, אבל זה לא תמיד אפשרי, ובכך קורא לאלטרנטיבה גישות 19. שנית, הם גרועים כמותיים משום שהם מבוססים על אמצעי עקיף של שכפול נגיפי. ולבסוף, ניתן הבקיע תרכובות רעילות כלהיטים חיוביים, ולכן יש לבטל עם מסך דלפק מדידת כדאיות סלולרית. כדי להתגבר על חלק ממכשולים אלה, וירוסים או replicons רקומביננטי כבר מהונדסים על ידי גנטיקה הפוכה לבטא חלבוני כתב, כגון EGFP או לוציפראז, מיחידת שעתוק נוספת או במסגרת עם גנים חלבון נגיפיים (כמה דוגמאות הן 20-23). כאשר וירוסים אלה לשכפל, יחסי ציבור כתבoteins מיוצר יחד עם חלבונים נגיפיים עצמם. זה מספק assay מאוד כמותית למדוד שכפול נגיפי ולהעריך את הפעילות המעכבת של מולקולות מועמד. זה נכון במיוחד לוירוסי רקומביננטי להביע לוציפראז (או אנזימים אחרים מסוגלים פליטת אור) שכן מערכת הכתב הזה מציגה טווח דינמי רחב עם רגישות גבוהה וכמעט ללא רקע. יתר על כן, אין מקור אור העירור, ובכך למנוע הפרעה לקרינת מתחם 24. הנה, אנחנו פירוט פרוטוקול תפוקה גבוהה מסך ספריות כימיות למעכבי ספקטרום רחב של וירוסי RNA. תרכובות נבדקו תחילה על תאים אנושיים נגועים בוירוס חצבת רקומביננטי (MV) להביע גחלילית לוציפראז 25 (rMV2/Luc, איור 1, מסך ראשי). MV שייך לMononegavirales סדר, והוא נחשב לעתים קרובות כחבר טיפוסי של נגיף RNA שלילי גדילes. ככזה, הגנום MV משמש כתבנית על ידי פולימראז הנגיפי לסנתז מולקולות mRNA קידוד לחלבונים נגיפיים. בזן MV רקומביננטי הנקרא rMV2/Luc, ביטוי לוציפראז בא לידי ביטוי מיחידת שעתוק נוסף מוכנסת בין P וגני M (איור 2 א). במקביל, תרכובות נבדקו לרעילות שלהם על תאים אנושיים באמצעות מגיב מבוסס לוציפראז מסחרי שמעריך, על ידי כימות ATP, מספר התאים הפעילים מטבולית בתרבות (איור 1, מסך ראשי). ספריות כימיות כולו יכולות להיות מוקרנת בקלות עם שני מבחני הללו על מנת לבחור תרכובות שאינן רעילים וביעילות לחסום שכפול MV. ואז, להיטים נבדקים מחדש לעיכוב מנת תגובה של שכפול MV, חוסר הרעילות, כמו גם ליכולת שלהם לפגוע בשכפול נגיף Chikungunya (CHIKV) (איור 1, מסך משני). CHIKV הוא חבר של משפחה של Togaviridae והגנום שלו הוא apמולקולת RNA חד גדיל ositive. ככזה, זה לגמרי לא קשורים לחצבת ותרכובות מעכבות גם MV וCHIKV סיכוי גדול לעכב פנל גדול של וירוסי RNA. חלבוני nonstructural CHIKV מתורגמים ישירות מהגנום הנגיפי, ואילו חלבונים מבניים מקודדים על ידי שעתוק ותרגום של מולקולת mRNA subgenomic. assay השכפול שלנו במבחנה לCHIKV מבוסס על זן רקומביננטי הנקרא CHIKV / רן, המבטא אנזים לוציפראז Renilla כחלק ביקע של polyprotein nonstructural באמצעות החדרת גן הכתב בין nsP3 ורצפי nsP4 26 (איור 2). המדד לפעילות לוציפראז Renilla מאפשר הניטור של שכפול נגיפי בשלב המוקדם של מחזור החיים CHIKV. פרוטוקול תפוקה גבוהה זה שימש כדי לזהות במהירות תרכובות עם פרופיל מתאים לantivirals ספקטרום רחב בספרייה מסחרית של 10,000 Molecules מועשר לגיוון כימי. תרכובות בעצם עקבו אחרי השלטון של חמש של יפינסקי, עם משקולות מולקולריות הנעות 250-600 daltons, והיכנסו ערכי D מתחת ל -5. רוב המולקולות אלה היו גופים כימיים חדשים אינו זמינים בספריות מסחריות אחרות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

וירוסי RNA אחראים למחלות עיקריות אדם כגון שפעת, ברונכיטיס, דנגה, הפטיטיס C או חצבת. הם גם מייצגים איום מתעורר בגלל חילופים מוגברים ברחבי העולם ואוכלוסיות אנושיות החודרים מערכות אקולוגיות טבעיות יותר ויותר. דוגמא טובה למצב כזה מתעורר היא מגיפות וירוסים chikungunya של 2005-2006 באוקיינוס ​​ההודי. התקדמות של אחרונות בהבנה של מסלולים הסלולר שליטה שכפול נגיפי שלנו מראה כי תרכובות מיקוד פונקציות תא מארחות, ולא את הנגיף עצמו, יכולים לעכב פנל גדול של וירוסי RNA. תרכובות אנטי כמה ספקטרום רחב זוהו עם מבחני מוכוון יעד מארח. עם זאת, מדידת העיכוב בשכפול נגיף בתרביות תאים באמצעות הפחתת השפעות cytopathic כקריאת נתונים עדיין מייצגת אסטרטגית הקרנה בעל חשיבות עליונה. מסכי פונקציונליים כגון שופרו באופן משמעותי על ידי הפיתוח של וירוסי רקומביננטי להביע כתב אנזימי capable של פליטת אור כגון לוציפראז. בדו&quot;ח הנוכחי, אנחנו פירוט צינור הקרנת תפוקה גבוהה, המשלב חצבת רקומביננטי ווירוסים chikungunya עם מבחני כדאיות סלולרית, כדי לזהות תרכובות עם פרופיל אנטי ספקטרום רחב.

צינור הקרנה זו נסמך ראשון על הבחירה של תרכובות המעכבות שכפול MV ולא מראה שום רעילות סלולרית משמעותית (איור 1, מסך ראשי). זה לוקח את יתרון של מבחני מבוססי לוציפראז כדי לקבוע רעילות סלולרית והעיכוב בשכפול נגיף. כל רכישת צעדי pipetting והנתונים יכולה להתבצע בהגדרת תפו...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

במבחני חוץ גופית כדי למדוד שכפול נגיף כבר השתפר מאוד על ידי הפיתוח של וירוסי RNA רקומביננטי להביע לוציפראז או אנזימים אחרים מסוגלים פליטת אור. כאן אנו פירוט צינור הקרנת תפוקה גבוהה המשלב זני רקומביננטי כגון חצבת והווירוסים chikungunya לבודד antivirals ספקטרום רחב מספריות כימיות.

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

high-throughput-screening-for-broad-spectrum-chemical-inhibitors-rna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K Views.  Institut Pasteur, CNRS UMR3569.  במבחני חוץ גופית כדי למדוד שכפול נגיף כבר השתפר מאוד על ידי הפיתוח של וירוסי RNA רקומביננטי להביע לוציפראז או אנזימים אחרים מסוגלים פליטת אור. כאן אנו פירוט צינור הקרנת תפוקה גבוהה המשלב זני רקומביננטי כגון חצבת והווירוסים chikungunya לבודד...

Video: High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים<em&gt; Brucella</em&gt; זיהום של תאים הלה

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כימיות כדי להבהיר את השפעתם על התמדה חיידקית

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...