Name: an in vivo blood-brain barrier permeability assay in mice using fluorescently labeled tracers
Uploaded: 2018-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
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著者は、この作業を支援する Leduq 財団によって資金を供給 Sphingonet コンソーシアムを認めたいと思います。この作品も「血管分化と改造」共同研究センターによって支えられた (CRC/Transregio23、プロジェクト C1) と 7。FP、COFUND、ゲーテ国際ポスドク プログラム移動で、291776 号の資金。我々 はさらに処理および遺伝子型解析マウスと彼女のテクニカル サポートのキャサリン ・ ソマーを認めます。

すべての動物は、処理中に痛みや不快感を最小限に抑え最大限大切に取り扱われました。この手順では、当院の動物医療のガイドラインに従って、(承認番号 FK/1044 Regierungspraesidium ダルムシュタット) のローカル委員会によって承認されています。
マウスにおける透過試金の生体内でのための作業手順の概略を図 1に示します。各手順の詳細は次のとおりです。
1. 動物取扱
<ol><li>
準備およびトレーサーと麻酔薬の投与
	<ol>
<li>透磁率測定前日の埋め込み、少なくとも組織のラベルの付いたチューブと金型を準備します。きれいな発煙のフードの下で働いて、80% エタノールで洗浄ツールを使用して、プロトコルの中で無菌状態を維持します。現在のプロトコルのための 3-6 ヶ月の成熟した大人の年齢層の男性または女性の野生型 (WT) またはアンジオポエチン 2 (Ang-2) 関数の利得 (GOF) の CD1 マウスを使用します。10を前述のようにマウスのジェノタイピングを実行します。 注: 80% アルコール滅菌器具にはなりませんが、試料の汚染を最小限に抑えられます。</li>
		<li>2 mM 株に滅菌 PBS ですべてのトレーサーを希釈し、-20 ° C で光から保護因数を格納</li>
		<li>(テトラメチル ローダミン) TMR などのトレーサーを選択し、(かに) 個別励起/蛍光スペクトルとの FITC は、蛍光顕微鏡による色素間の干渉を最小限に修正可能なリジン (TMR を使用してまたはFITC フィルターそれぞれ)、蛍光測定透水性測定用のプレート リーダー。 注: TMR デキストラン 3 kD FITC デキストラン 3 kD 研究に使用修正可能な両方のリジンおよびそれ故にされる可能性がありますもとアルデヒドの免疫組織化学的解析ポスト固定の地域差を調査するために。</li>
		<li>すべての動物を介護施設ガイドラインに従い細心の注意をもって処理します。1:1 の混合10,13各トレーサーの 100 μ L を使用して追加のトレーサーを組み合わせた場合、200 μ L まで増やすことができます 100 μ L トレーサー ソリューションで各マウス腹腔内を挿入します。トレーサー蛍光バック グラウンド減算の偽コントロールとしてではなく単独で PBS で少なくとも 1 匹の動物を注入します。</li>
		<li>トレーサー注入後 5 分麻酔のケタミン ・ キシラジン i.p 注入と動物 (100 mg と 5-10 mg 0.9% で本体重量 kg あたり生理食塩水重量、それぞれ 25 g マウスあたりカクテル 150 μ L)。 注: 獣医軟膏適用されませんでした目のプロシージャの間に動物の麻酔と灌流/犠牲間の期間は短かったと (10 分) が観察場所目の任意の乾燥はなかった。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
血のコレクションおよび心臓の血流
	<ol>
<li>心筋灌流 10 分局所麻酔薬投与後の動物を準備します。動物の麻酔外科平面に達したことを確認するために足けいれん反応がないことを確認してください。</li>
		<li>自分の背中に動物を置き、80% エタノールを腹部の皮膚に適用されます。小さなハサミを使用して、胸郭のすぐ下に小さな切開 (2 cm) で腹壁を開きます。横隔膜から肝臓を分離し、ゆっくりと横隔膜の胸腔内15の公開を切り取ります。</li>
		<li>両側に胸郭をカットし、左心室を公開するためにカットの胸骨を修正します。左心室の後部の蠕動灌流システムに接続されている 21 ゲージ蝶針を挿入します。</li>
		<li>右心房を穴をあけるとすぐに (10 s) 血清採血管に血液 (と最後カットオフ) 1 mL ピペット チップを使用して胸腔内に放出の 200-300 μ L を収集して氷の上保存します。 注: この灌流プロシージャは非生存です。</li>
		<li>血液を収集すると、すぐに灌流システム (10-12 rpm, 5 mL/分) に切り替えるし、暖かい (RT) 1x PBS で 3 分のための動物を灌流 (Ca の無料2 +/Mg2 +イオン)。 注: PBS 含んでいる Ca2 +/Mg2 +イオンはより良い心臓の活動の灌流中に利用できます。灌流に使用される PBS の合計量は 15 〜 20 mL の範囲内です。</li>
		<li>肝臓の色に注意して灌流品質を評価する腎臓灌流後ホワイト/ペールに表示されます。 注: 腎臓や肝灌流必ずしも大動脈から脳が特に心房穿刺中に手順 3 で準備中に破裂を得る動脈 (頸動脈・椎骨) 到達として脳血流。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ティッシュの処理
<ol><li>オルガン コレクションとストレージ
	<ol>
<li>灌流末、頚部転位と収穫脳と腎臓によって動物の死を確認します。脳血流を脳 (髄膜の血管で目に見える血) の色によって灌流の品質が良い場合、透磁率の解析から動物を除外するを確認します。メス (図 1) を使用して 2 hemibrains に脳を分けます。</li>
		<li>メスの 1 つ hemibrain の嗅葉と小脳の無料で解剖し、大脳半球を 2 mL チューブに転送します。小脳の透水性評価に必要な場合、その他のチューブでヘミ小脳を格納します。</li>
		<li>1 つの腎臓を別の 2 mL チューブに転送します。ドライアイスにサンプルをすぐに保存します。</li>
		<li>組織-tek 社最適切削温度 (O.C.T) ドライアイスの化合物で残りの腎臓とヘミ脳 (小脳と嗅葉から成る) をネイティブで埋め込みます。</li>
		<li>最終的には、遠心分離機の 10、000 g、4 ° C で 10 分間で血清採血管で氷の上保存血液サンプル血清培養上清を 1.5 mL チューブに転送し、ドライアイス コンテナーに配置します。</li>
		<li>さらに処理まで-80 ° C の冷凍庫にドライアイスで収集されたすべてのサンプルを転送します。 注:、凍結融解後の均質化効率の増加として均質化の手順に進む前にサンプルを凍結することが重要です。</li>
	</ol></li>
	<li>均質化および遠心分離
	<ol>
<li>氷-80 ° C でダウン凍結ヘミ大脳と腎臓のサンプルを解凍し、臓器を含むチューブの重量を量る。これらの重みから組織重量を得るためのいくつかの空管 (約 20) の平均値を減算します。追加 300 μ L、200 μ L 冷 1 の腎臓とヘミ-大脳をそれぞれ含むチューブ X PBS。 注: (ヘミ小脳、100 mg 以下) のような組織の量を減らすため個々 のチューブを計量することをお勧めします。</li>
		<li>約 15 ストロークを実行することによって電気のオーバーヘッド攪拌 (1, 000 rpm) に接続されているポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) 杵と元エッペン チューブ内の各サンプルを均質化 (1 ストロークを 1 と 1 を =)。サンプルの間に PBS で杵を洗い、次のサンプルに進む前に乾燥拭いてください。 注: 螢光を潜在的な干渉により均質化時に洗剤の使用を避けた。ただし、組織を徹底的に均質化、1 つのラウンドの凍結融解後、どちらがより効率的に細胞内のトレーサーがこのプロトコルで検出されたも。</li>
		<li>光と卓上遠心分離機で 4 ° C、20 分 15,000 g で最後にすべて一緒に遠心から保護されている氷の上の均質化のサンプルを格納します。即時蛍光または後で解析する-80 ° C で氷の上清を新しい 1.5 mL チューブに転送します。</li>
	</ol></li>
	<li>蛍光測定と定量化
	<ol>
<li>前の手順の最後に固定されている場合は、氷の上箔と光から守り-80 ° C で保存組織培養上清、血清サンプルを解凍します。</li>
		<li>黒 384 ウェル プレートに希釈血清 (30 μ L 1 × PBS + 20 μ L の血清) または組織培養上清 (として) の 50 μ L をピペットします。適切な背景差分を確保するため血清および組織培養上清の偽動物から少なくとも 1 つのサンプルは、この組織ホモジネートの背景は通常希釈剤として使用される PBS のそれより高い。 メモ: 3 偽動物の平均は偽蛍光値 (データは示されていない) に非常に小さな変動が観察されたが、自発に使用できます。また脳サンプルなど低蛍光サンプルの信号対雑音比を高めることができる PBS で希釈して使用される血清の量を減らせます。40 μ L の PBS で希釈し最大 10 μ L の血清を調べた。泡が井戸に存在しないことを確認します。</li>
		<li>384 ウェル ブラック プレートをプレート リーダーに挿入し、蛍光測定を選択する新しいスクリプトを開きます。</li>
		<li>ゲインを最適に設定し、それぞれ TMR や FITC dyee の 550/580 または 490/520 の励起/蛍光 (nm) の値に使用生蛍光ユニット (RFUs) を取得する測定を開始します。</li>
		<li>プレート リーダーから未加工の蛍光ユニット (RFUs) を使用して、対応する偽値を差し引いた透磁率指数 (PI) を計算します。<ol>
<li>
* 透水性インデックス(mL/g)= (組織 RFUs/g 組織重量)/(血清血清 RFUs/mL)
</li>
		</ol>
</li>
		<li>例の計算脳透磁率指数 (PI) 動物 GOF1 (表 1):<ol>
<li>GOF1 脳 RFUs - 偽脳 RFUs 154 22.5 を = = 131.5</li>
			<li>GOF1 血清 RFUs - 偽血清 RFUs 38305 27 を = = 38278</li>
			<li>脳の重量 (g) = 0.195</li>
			<li>血清量 (ml) = 0.02</li>
			<li>脳の透過性インデックス (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352 注: 透磁率指数の計算は、絶対と同等の実験と組織型との間にある値を得られます。これらはしかし 2 グループ12間の比較の容易さのための比率として表示できます。1 まだ維持間の動物変化対照群をコントロール グループ平均を運転、制御グループの平均 PI と両方のグループで各動物の PI を割ることによってこれを実現できます。この変換は、1 に設定されて、コントロール グループを基準にして実験的グループ (またはグループ) の値を提供します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>トレーサーの蛍光可視化
	<ol>
<li>クライオスタットのセクションは-20 ° C に設定し、室温で置かれたスライドをセクションを転送 10 μ m に組織-tek 社化合物 (O.C.T) (ステップ 2.1) でネイティブに埋め込まれた腎臓/ヘミ-脳ブロックをカットします。セクション乾燥 (約 30 分)、一度転送は使用するまで-80 ° C のフリーザーにスライドします。</li>
		<li>染色の日に 10 分、37 ° C でスライドを解凍し、PBS でクイック洗濯後室温で 10 分間 4 %paraformaladehyde (PFA) のセクションを修正します。</li>
		<li>室温で 1 時間 0.5% トリトン X-100 pH 7.5 1 %bsa を含む滅菌 PBS の透過/ブロック バッファーのセクションを孵化させなさい。</li>
		<li>CD31 一次抗体と室温で 1.5 h のスライドを孵化させなさい (0.5 mg/ml、クローン メック 13.3)、トリトン X-100 (pH 7.2) PBS の 3 つの 5 分洗浄後滅菌 PBS、0.5% BSA 0.25% を含むバッファーの 1: 100 で希釈しました。</li>
		<li>蛍光標識抗体希釈 1: 500 (2 mg/mL) の種特異的に室温で 1 時間上のバッファーの二次抗体の孵化を実行します。CD31、1: 500 の希釈でヤギ抗ラット 568 アレクサやアレクサ 488 を使用できます。DAPI を含める (300 μ M) 二次抗体で、核を染色する (1:1、ストックから 000 希釈) をミックスします。</li>
		<li>アクア polymount とステンド グラスのセクションをマウントし、暗闇の中で常温で重合のために一晩置いておきます。</li>
		<li>スペクトル イメージング共焦点レーザー スキャン顕微鏡システムを使用して画像を取得します。NIS 要素ソフトウェア (バージョン 4.3) によってイメージを分析します。モンタージュの数字の生成のため、Photoshop などのソフトウェアを使用できます。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Abbott, N. J., R&#246;nnb&#228;ck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Dysfunction+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier.</a> Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).</li><li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. 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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

血液脳関門の機能障害は、プライマリとセカンダリの脳腫瘍や脳卒中を含む神経疾患の数に関連付けられます。BBB 破壊はしばしば命にかかわる中枢神経浮腫を関連付けです。開始の分子機構の解明や BBB の閉鎖したがって神経疾患一般の治療的意義の調査の研究者。ただし、調査方法は蛍光画像17,18の面倒で主観的な定量化に依存する技術的な問題...

血液脳関門 (BBB) は、基底膜の鞘は、密接に関連するペリサイト (Pc)、および自分の終わり足の1 で基底膜を包むアストロ サイト (ACs) でサポートされている微小血管内皮細胞 (Ec) で構成されています ,2。ECs は、いくつかの細胞の種類をサポートし、主に ACs と Pc、バリア機能を調節すると対話も神経細胞とミクログリア、すべての一緒にユニットを形成、神経血管 (NVU)。NVU は、血液媒介性毒素や脳を入力してから病原体の輸送を制限する BBB の機能にとって重要です。この関数は、ECs ともトランスポーター p 糖タンパク質 (P ・ gp) その流出内皮を入力分子に戻すなどの操作のために存在するクローディン 5, オクルーディン, 精巣毛細血管-1, などタイト結合分子の結果1,ルーメン32,船。ただし、BBB は EC 膜1,2,3で表現される特定のトランスポーターで栄養 (ブドウ糖、鉄、アミノ酸) など重要な分子の輸送のためできます。EC 層は内腔 (血側) と特定とベクトル輸送機能報4,5 ように abluminal (脳向け膜) の間様々 なトランスポーターの分布に関して高偏極します。.BBB は中枢神経系の環境をしっかりと規制に関して保護、機能 BBB とパーキンソン病などの疾患に CNS ドラッグデリバリーのための大きな課題です。BBB 機能障害神経疾患でもバリア機能障害はアルツハイマー病 (AD) のように、例えば特定のトランスポーター ターゲットへの損傷を含めることができます、特に脳薬物送達が増加することを想定できません。広告で LRP1、怒り、P gp などいくつかのアミロイド β のトランスポーターが調節不全として知られている、無駄な6,7、8をかもしれないそれ故にこれらの運送者を対象とします。BBB は、ストローク、広告、髄膜炎、多発性硬化症と脳腫瘍9,10,11などのいくつかの神経疾患の障害です。治療戦略の重要な部分は、バリア機能を回復させる、従ってその評価は重要です。
この仕事については客観的かつ我々 正しく適用されているマウスのいくつかの行に両方実験的な遺伝子疾患モデル10,12,13 齧歯動物で透水性の試金のための量的なプロトコル ,14。メソッドは、血管コンパートメントからトレーサーを削除するマウスの灌流が続く蛍光トレーサーの単純な腹腔内注射に基づいています。脳や他の臓器が収集した記事の灌流および透水性の客観的評価と蛍光プレート リーダーで組織ホモジネートの測定に基づく絶対透磁率インデックス。組織ホモジネートまたは任意のトレースを受け取りません偽動物からの血清を使用して背景のすべての未加工の蛍光値が修正されます。十分な正規化は、血清量、血清蛍光組織、従って絶対と同等の実験と組織型との間にある透過性インデックスを降伏の重量に含まれます。グループ間の比較を容易にするため絶対浸透率のインデックス値容易に変換できる比率と我々 は以前に12を実行していた。同時に、ストアド ヘミ脳や腎臓に利用できる可視化トレーサー蛍光顕微鏡10。古典的な蛍光顕微鏡とはいえ面倒な切片と半定量分析のためのイメージの主観的な選択のために透磁率の地域差を取得する価値があります。プロトコルの詳細な手順が表示されます、適切な場所にノートが追加されます。これは、他の小動物にスケーリングすることができますマウスの体内透過性アッセイを正常に実行するために必要な情報を提供します。アッセイは、トレーサーの多くの種類に適用できる特異的な蛍光スペクトルとトレーサーの組み合わせによって透過性評価に基づいた料金とサイズを可能にします。

<table><tbody><tr><td>Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3308</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3306</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (Ketavet)</td><td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (Rompun)</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% Saline</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldhehyde solution</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td>prepare a 4% solution</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, fraction V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>goat anti rat alexa 568</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11077</td><td></td></tr><tr><td>goat anti rat alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Aqua polymount</td><td>Polyscience Inc</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>21-gauge butterfly needle</td><td>BD</td><td>387455</td><td></td></tr><tr><td>serum collection tube</td><td>Sarstedt</td><td>41.1500.005</td><td></td></tr><tr><td>2mL eppendorf tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech precision wipes tissue wipers</td><td>Kimberley-Clark Professional</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>384-well black plate</td><td>Greiner</td><td>781086</td><td></td></tr><tr><td>slides superfrost plus</td><td>Thermoscientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PTFE pestle</td><td>Wheaton</td><td>358029</td><td></td></tr><tr><td>electric overhead stirrer</td><td>VWR</td><td>VWR VOS 14</td><td></td></tr><tr><td>plate reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 550</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>peristaltic perfusion system</td><td>BVK Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vivo blood-brain barrier permeability assay in mice using fluorescently labeled tracers

血液脳関門 (BBB) は、毒素や病原体循環から脳微小環境を保護し、脳の恒常性を維持する特殊なバリアです。バリアの主な場所はタイトジャンクショ細胞間と細胞膜に発現排出トランスポーター起因するバリア機能が脳の毛細血管の内皮細胞です。この関数は、ペリサイトおよび単位 (NVU) を形成しているアストロ サイトによって規制されています。脳卒中、アルツハイマー病 (AD) などいくつかの神経疾患脳腫瘍は BBB 機能障害に関連付けられます。BBB 透過性の評価は神経疾患の重症度と治療戦略を採用の成功の評価に重要なため。
いくつかのマウスに正常に適用されている堅牢な透磁率測定モデル遺伝的および実験両方まだここで単純なを提示します。メソッドは、定量性は一般的に適用される顕微鏡によるトレーサー蛍光分析と比較して客観的にです。このメソッドは、マウスはマウスを麻酔続いて水性の不活性蛍光トレーサーのミックスと腹腔内注入されます。動物の心臓の血流は、脳、腎臓や他の臓器を収穫する前に実行されます。臓器の均質化し、遠心上清からの蛍光測定が続きます。直前に灌流心臓穿刺から採血血管コンパートメントに正規化の目的提供しています。組織蛍光が量的に入手するぬれた重量および血清蛍光に正規化されたトレーサー透磁率インデックス。追加の確認のため蛍光可視化用トレーサー対側の半脳免疫組織化学のために保存を利用できます。

我々 は最近、アンジオポエチン 2 (Ang-2) 関数の利得 (GOF) マウスではある健康の条件10の高いコントロール マウスより脳血管透過性を示しています。脳卒中誘発マウス、GOF マウスが大きな梗塞サイズは、コントロールの同腹子より大きな透磁率を持っていたことを示していますがだった。これらの結果は、BBB で透磁率にアン 2 の重要な役割を表示し?...

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An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

血液脳関門の機能障害の動物モデルに適用可能な灌流が続く蛍光トレーサーの腹腔内注入によるマウス脳血管透過性アッセイをご紹介します。1 逸見脳は、透水性の定量的評価と可視化トレーサー/染色の他に使用されます。10 匹のマウスに 5-6 時間を要します。

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

an-vivo-blood-brain-barrier-permeability-assay-mice-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

24.4K ビュー.  Goethe University Hospital. 血液脳関門の機能障害の動物モデルに適用可能な灌流が続く蛍光トレーサーの腹腔内注入によるマウス脳血管透過性アッセイをご紹介します。1 逸見脳は、透水性の定量的評価と可視化トレーサー/染色の他に使用されます。10 匹のマウスに 5-6 時間を要します。

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Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of brain tumors, the molecular selectivity of BBB also shields the neoplastic cells by blocking the delivery of peripherally administered chemotherapies. The development of novel drugs (including nanoparticles) targeting malignant brain tumors ideally requires the use of preclinical animal models to study the drug&#8217;s transcytosis and antitumor efficacy. In order to comply with the 3R principle (refine, reduce, and replace) to reduce the number of laboratory animals in experimental setup and perform the high-throughput screening of a large library of antitumor agents, we developed a reproducible in vitro human and murine mimic of the blood-brain tumor-barrier (BBTB) using three-layered cultures of endothelial cells, astrocytes, and patient-derived glioblastoma spheres. For higher scalability and reproducibility, commercial cell lines or immortalized cells have been used in tailored conditions to allow the formation of a barrier resembling the actual BBB. Here we describe a protocol to obtain a BBTB mimic by culturing endothelial cells in contact with astrocytes at specific cell densities on inserts. This BBTB mimic can be used, for instance, for the quantification and confocal imaging of the nanoparticle passage through the endothelial and astrocytic barriers, in addition to the evaluation of the tumor cell targeting within the same assay. Moreover, we show that the obtained data can be used to predict the behavior of nanoparticles in preclinical animal models. In a broader perspective, this in vitro model could be adapted to other neurodegenerative diseases for the determination of the passage of new therapeutic molecules through the BBB and/or be supplemented with brain organoids to directly evaluate the efficacy of drugs.

Drug targeting to central nervous system tumors is a major challenge. Here we describe a protocol to produce an in vitro mimic of the blood-brain tumor-barrier using murine and/or human cells and discuss their relevance for the predictability of central nervous system tumor targeting in vivo.

皿に血液脳腫瘍-障壁を使用して生体ペイロード配信で予測

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

がん研究

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

アン<em生体内で&gt;</em血管透過性をテストする&gt;アッセイ

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

医学

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

設定アップ<em&gt;体外</emラット血液脳関門の&gt;モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

神経変性疾患のマウスモデルで FITC 標識アルブミンの点滴静注による血液脳関門透過性の評価

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

神経科学

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with embedded pericytes, and the glia limitans composed by the parenchymal basement membrane and astrocytic end-feed embracing the abluminal aspect of central nervous system (CNS) microvessels. In addition to maintaining CNS homeostasis the NVU controls immune cell trafficking into the CNS. During immunosurveillance of the CNS low numbers of activated lymphocytes can cross the endothelial barrier without causing BBB dysfunction or clinical disease. In contrast, during neuroinflammation such as in multiple sclerosis or its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) a large number of immune cells can cross the BBB and subsequently the glia limitans eventually reaching the CNS parenchyma leading to clinical disease. 
Immune cell migration into the CNS parenchyma is thus a two-step process that involves a sequential migration across the endothelial and glial barrier of the NVU employing distinct molecular mechanisms. If following their passage across the endothelial barrier, T cells encounter their cognate antigen on perivascular antigen-presenting cells their local reactivation will initiate subsequent mechanisms leading to the focal activation of gelatinases, which will enable the T cells to cross the glial barrier and enter the CNS parenchyma. Thus, assessing both, BBB permeability and MMP activity in spatial correlation to immune cell accumulation in the CNS during EAE allows to specify loss of integrity of the endothelial and glial barriers of the NVU. 
We here show how to induce EAE in C57BL/6 mice by active immunization and how to subsequently analyze BBB permeability in vivo using a combination of exogenous fluorescent tracers. We further show, how to visualize and localize gelatinase activity in EAE brains by in situ zymogaphy coupled to immunofluorescent stainings of BBB basement membranes and CD45+ invading immune cells.

Here, we present protocols to investigate impairment of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. We specifically address how to determine blood-brain barrier permeability and gelatinase activity involved in leukocyte migration across the glia limitans.&#160;

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

免疫・感染学

<meta charset="utf8"></head><body>蛍光色素を用いたマウスの血液脳関門破壊の可視化

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is a complex process influenced by several factors, such as the concentration of dyes in the blood, permeability of brain vessels, duration of dye extravasation, and reduction in dye concentration in the tissue due to degradation and diffusion. In a mild traumatic brain injury model, exposure to blast-induced shock waves (BSWs) triggers BBB breakdown within a limited time window. To determine the precise sequence of BBB breakdown, Evans blue, and fluorescein isothiocyanate-dextran were injected intravascularly and intracardially into mice at various time points relative to BSW exposure. The distribution of dye fluorescence in brain slices was then recorded. Differences in the distribution and intensity between the two dyes revealed the spatiotemporal sequence of BBB breakdown. Immunostaining of the brain slices showed that astrocytic and microglial responses correlated with the sites of BBB breakdown. This protocol has broad potential for application in studies involving different BBB breakdown models.

<meta charset="utf8"></head><body>軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

A method was developed to visualize dye extravasation due to blood-brain barrier (BBB) breakdown by administering two fluorescent dyes to mice at different time points. The use of glycerol as a cryoprotectant facilitated immunohistochemistry on the same sample.

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the endothelial barrier dysfunction is related to many salivary gland secretory disorders. The present protocol describes an in vivo paracellular permeability detection method to evaluate the function of endothelial tight junctions (TJs) in mouse submandibular glands (SMG). First, fluorescence-labeled dextrans with different molecular weights (4 kDa, 40 kDa, or 70 kDa) were injected into the angular veins of mice. Afterward, the unilateral SMG was dissected and fixed in the customized holder under a two-photon laser-scanning microscope, and then images were captured for blood vessels, acini, and ducts. Utilizing this method, the real-time dynamic leakage of the different-sized tracers from blood vessels into the basal sides of the acini and even across the acinar epithelia into the ducts was monitored to evaluate the alteration of the endothelial barrier function under physiological or pathophysiological conditions.

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In the present protocol, the endothelial barrier function of the submandibular gland (SMG) was evaluated by injecting different molecular weighted fluorescent tracers into the angular veins of test animal models in vivo under a two-photon laser-scanning microscope.

インビボ マウス顎下腺における血管透過性検出

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...

生物学

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of plasma inflammatory markers and bacterial translocation to the spleen and lymph nodes, the gold standard directly quantifies the ability of selected molecules to traverse the gut mucosal layer toward systemic circulation. This article uses a non-invasive, cost-effective, and low-burden technique to quantify and follow in real time the intestinal permeability in mice using fluorescein-isothiocyanate-labeled dextran (FITC-dextran). Prior to oral supplementation with FITC-dextran, the mice are fasted. They are then gavaged with FITC-dextran diluted in phosphate-buffered saline (PBS). One hour after the gavage, the mice are subjected to general anesthesia using isoflurane, and the in vivo fluorescence is visualized in an imaging chamber. This technique aims to assess residual fluorescence in the abdominal cavity and the hepatic uptake, which is suggestive of portal migration of the fluorescent probe. Blood and stool samples are collected 4 h after oral gavage, and the mice are sacrificed. Plasma and fecal samples diluted in PBS are then plated, and the fluorescence is recorded. The concentration of FITC-dextran is then calculated using a standard curve. In previous research, in vivo imaging has shown that fluorescence rapidly spreads to the liver in mice with a weaker gut barrier induced by a low-fiber diet, while in mice supplemented with fiber to strengthen the gut barrier, the fluorescent signal is retained mostly in the gastrointestinal tract. In addition, in this study, control mice had elevated plasma fluorescence and reduced fluorescence in the stool, while inversely, inulin-supplemented mice had higher levels of fluorescence signals in the gut and low levels in the plasma. In summary, this protocol provides qualitative and quantitative measurements of intestinal permeability as a marker for gut health.

In the present study, fluorescein-isothiocyanate-labeled (FITC) dextran is administered to mice via oral gavage to evaluate intestinal permeability both in vivo and in plasma and fecal samples. As gut barrier function is affected in many disease processes, this direct and quantitative assay can be used in diverse research areas.

フルオレセインイソチオシアネート標識デキストランを用いたマウスの腸バリア完全性の評価

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

要約

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皿に血液脳腫瘍-障壁を使用して生体ペイロード配信で予測

アン

設定アップ

神経変性疾患のマウスモデルで FITC 標識アルブミンの点滴静注による血液脳関門透過性の評価

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

インビボマウス顎下腺における血管透過性検出

フルオレセインイソチオシアネート標識デキストランを用いたマウスの腸バリア完全性の評価

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

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アン

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神経変性疾患のマウスモデルで FITC 標識アルブミンの点滴静注による血液脳関門透過性の評価

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

インビボ マウス顎下腺における血管透過性検出

フルオレセインイソチオシアネート標識デキストランを用いたマウスの腸バリア完全性の評価

インビボマウス顎下腺における血管透過性検出