この作品は、伊イスティトゥートイタリア語ディTecnologiaによってサポートされていました。 著者らは、この原稿のスポンサーのためにミルテニーバイオテク社（ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）を承認したいと思い、博士パオロ·ペトルチアーニ人間軟膜を提供するための（免疫血液学および輸血サービス、病院ロッティポンテデーラ、ピサ、イタリアの部）と教授マッシモPasqualetti（生物学科 - 細胞のユニットと発生生物学、ピサ大学、ピサ、イタリア）マウスコロニーを収容するため。

倫理声明人間と動物のサンプルは、法92分の116、厚生労働省のイタリアのガイドラインに従って処理され、欧州共同体理事会指令86/609/EECを行った。 1。単球細胞培養<ol><li> 10％ヒト血清、50 U / mlペニシリンおよび50 mg / mlのストレプトマイシン、5％CO 2中37℃で0.05 mMのβ-メルカプトエタノールを補充したRPMI-1640培地を含むT-75フラスコ中で培養ヒトTHP-1細胞。 </li><li>スプリット培養コンフルエント（3〜5日毎）。 </li></ol> 2。バフィーコートからの末梢血単核球（PBMC）を単離<ol><li>単離プロトコールを開始する前に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pH7.2の溶液を調製し、2mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、緩衝液（1リンス95ミリリットルを5ミリリットルBSAストック溶液を添加し、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）、。 20希釈）。バッファを脱気し、（2-8寒いところに保管°C）。 重要 ：気泡が分離カラム（ステップ3.2を参照）をブロックすることがありますので、ガス抜きを怠るバッファが最適な結果よりも少ない可能性があります。 注：抗凝固剤クエン酸デキストロース式-A（ACD-A）またはクエン酸リン酸デキストロース（CPD）を代わりに使用することができる。逆に、他の種由来の他のアルブミンのタンパク質または血清は、BSAを置き換えることができます。 Ca 2 +またはMg 2 +を含有する緩衝液を使用しないでください。 </li><li> （20〜60歳の）健康なドナーから軟膜を取得します。 </li><li>密度勾配遠心分離のために50ミリリットルコニカルチューブを準備します。血液を処理するために必要な管の数を決定します（各チューブは、希釈した血液の35ミリリットルを処理することができます）、各空のチューブにフィコール·パックの15ミリリットルを追加します。 </li><li> PBS / BSA / EDTA溶液（1:4希釈）の24ミリリットルで血液を8ミリリットルを希釈します。 </li><li>慎重に（密度= 1.077グラム/ ml）を50ミリリットルコニカルチューブの各々におけるフィコール·パックの上に希釈液を重ね。混在させないでください血とフィコール·パック。 重要 ：、血とフィコール·パックの混入を避けるため45°の角度でチューブを握り、ゆっくりと血液混合物を層に。 </li><li> 4℃で30分間400×gで遠心分離単核細胞（MNCは）はフィコール·パックの浸透圧で高密度化への顆粒球および赤血球沈降物のに対し、プラズマフィコール·パックのインタフェースのままになります。 </li><li> 4℃で10分間、300×gでPBS / BSA / EDTA遠心分離を充填した新たな50mlチューブに間期細胞（末梢血単核細胞、PBMCを）を転送</li><li>血小板を除去するためにPBS / BSA / EDTAでペレットを2回洗浄します。 4℃で10分間200×gでスピン</li><li> 、10％ヒト血清および抗生物質を含む培養完全RPMI-1640での細胞や単球の精製に進みます。 </li></ol> 3。 PBMCからの初代単球の精製<ol><li>ハムを用いた磁気ビーズ分離によりPBMCから単球を分離するパン単球単離キット： <ol><li>可能な細胞塊を除去するために30μmのナイロンメッシュ（preseparationフィルタ、30ミクロン）を介して細胞を渡します。 </li><li>血球計数器を用いて細胞数を決定します。 </li><li>室温（RT）で10分間、300×gで遠心細胞懸濁​​液。完全に上清を吸引し。 </li><li> 10 7全細胞につき、PBS / EDTA / BSA緩衝液30μlに再懸濁細胞ペレット。 </li><li> 10 7全細胞あたりのブロッキング試薬10μLのFcRを追加します。 </li><li> 10 7全細胞あたりのビオチン抗体カクテルの10μlを加える。 </li><li>よく混ぜ、2〜8℃で5分間インキュベート</li><li> 10 7全細胞あたりの緩衝液30μlを追加します。 </li><li> 10 7全細胞あたりの抗ビオチンマイクロビーズ20を添加する。 </li><li>よく混ぜ、2〜8℃で10分間インキュベート</li><li> PBS / EDTA / BSA緩衝液500μl中に10 8細胞まで再懸濁する。 </li></ol></li><li> 磁気SEPARATION <ol><li>したがって、総細胞数に、適切なMACSカラムとMACSセパレータ（MACSカラムのデータシートを参照）を選択します。 </li><li> MACSセパレーターの磁場中で列を配置します。 </li><li> PBS / EDTA / BSA緩衝液の適切な量でリンスすることによって、列を準備します（MSカラム：500μL、LSカラム：3ミリリットル）。 注意 ：カラムには「流れ停止」であり、ドライ実行されません。 </li><li>カラムに細胞懸濁液を適用します。濃縮単核球画分を表す、非標識細胞を含むフロースルーを収集します。 </li><li> PBS / EDTA / BSA緩衝液（MSの500μLおよび洗浄あたり、LS用の3ミリリットル）をカラムに3回洗浄します。 </li><li>濃縮単球細胞を表す、通過する非標識細胞を収集し、フロースルーのセクション3.2.4からに追加する。 注：列のタンクが空になった場合にのみ、PBS / EDTA / BSA緩衝液の分量を追加することにより、カラムを洗浄する。 </li><li> （省略可能）から列を削除セパレータはと、適切な収集チューブの上に置きます。カラムにバッファーをピペット（：1ミリリットル; LSカラム：MSカラム5ml）中。すぐにしっかりと列にプランジャーを押すことにより、磁気標識nonmonocyte細胞を洗い流す。 </li><li>培養物を、10％ヒト血清および抗生物質を完全なRPMI-1640中の単球を精製した。 </li></ol></li></ol> 4。全血からの初代単球の精製<ol><li>製造者の指示に従って全血単球単離キットを用いて全血から単球を精製する。 </li></ol> 5。血白血球と精製単球でのナノ粒子内部移行<ol><li> 12ウェルプレートで単離されたPBMC又は精製されたCD14陽性単球のプレート5×10 5細胞/ ml（1ミリリットル/ウェル）。 </li><li> 100 nMに作業濃度への完全培地中の渦のFITC-SiO 2のナノ粒子原液と懸濁します。 </li><li>作業nanop10μlのを追加1nMのナノ粒子の最終濃度を達成するために処理された試料についての記事懸濁液（100 nM）を有する。各ウェルに、未処理の対照のための完全培地同じボリュームを追加します。 </li><li> 1時間の内在化を1.5mlポリプロピレンチューブに試料を採取し、RTで6,000×gで3分間遠心分離した後、それらを。 </li><li>室温で6000×gでバッファ3分ジャンル1mlでペレットを洗浄。 </li><li>ランニング緩衝液200μlにペレットを再懸濁します。セルは現在、フローサイトメトリーで読み取るための準備が整いました。 </li></ol> 6。次混合膠細胞培養物の単離（Bertero らを参照してください。7） 7。混合グリア融合性細胞培養を再プレート<ol><li>その後、ベルセンの10ミリリットルを加え、5〜7分間37℃でインキュベート、（W / Ca 2 +を / Mgの2 + O）10mlのPBSで一回、T-75フラスコを洗う。 </li><li> T-75の表面から細胞を剥離し、溶解させるために上下に数回、上清をピペット細胞集合体。 </li><li>を15mlポリプロピレンチューブに細胞懸濁液を移す。血球計で細胞を計数する細胞懸濁液の少量を集める。 </li><li>室温で300×gで5分間、細胞懸濁液を遠心分離する。 </li><li>上清を除去し、グリア完全培養液中に5×10 5細胞/ mlの最終濃度でペレットを再懸濁する。 </li><li>プレート0.5ミリリットル/ 24ウェルプレート中の細胞は、ナノ粒子の処理の前に2-4時間のために解決しましょう​​。 </li></ol> 8。ミクログリアにおけるナノ粒子内部移行<ol><li>各ウェルに（未処理コントロールの）完全なグリア培養液500μlのか（処理された試料の場合）完全なグリア培養液中の2Xローダミン-SiO 2のナノ粒子懸濁液を500μlを加える。 </li><li>選択された時点でnonrapid接着細胞の脱離を可能にし、2mlのポリプロピレンチューブにそれらを収集するために、細胞をピペット。 </li><li> 500μLを追加ベルセンの各ウェルに、残りの細胞画分を切り離し、前のステップの対応する非付着細胞を用いて、各サンプルを採取次いで、5分間37℃でプレートをインキュベートする。 </li><li>室温で300×gで3分間サンプルを遠心分離する。 </li><li>バッファの実行をAutoMACS100μlにペレットを再懸濁します。 </li></ol> 9。のCD11b-VioBlue抗体で染色<ol><li>ランニング緩衝液中の細胞懸濁液（1時11分比）100μlにVioBlue抗体抗CD11bヒト/マウス抗体を10μlを加え、4℃で10分間インキュベート</li><li>ランニング緩衝液の1ミリリットルを加え、細胞懸濁液を混ぜる。 </li><li>遠心分離機300 x gで3分間、各試料。 </li><li>上澄み液を捨て、ランニング緩衝液の100〜150μlにペレットを再懸濁します。 </li><li>サイトメーターにサンプルを読んで（最後の2つのステップの間、4℃でサンプルを格納）。 重要 ：サンプルを分析する前に、重複する信号の補償に進んでI異なる蛍光色素（蛍光標識ナノ粒子または抗体）の間で観察され、n個の発光スペクトル。 </li></ol> 10。報酬上のスペクトル流出<ol><li> 「機器設定」ボックス（すべての機器のソフトウェアプログラムに存在する）を開きます。 注：材質表に報告されたものとは異なる機器を使用している場合は、取得の詳細については、機器固有のマニュアルを参照してください。 </li><li> （計器で許可されている場合）、低流体速度（ナノ粒子なし）未処理のサンプルを取得する。取得中に、手動で電圧チャネルを調節することにより調整する前方および側方散乱（FSCおよびSSCそれぞれ、）。 注：最高のプロットの完全な細胞集団を可視化するためにSSCおよびFSC軸のスケールを変更します。関心のある各細胞タイプのためのテンプレートを設定する器具は、作成され保存され、将来の買収のために使用することができる。 </li><li>特定を開くソフトウェアでの「領域」タブをクリックします。希望する住民を中心に適切な大規模な領域（「ゲート」）を描画します。 注意：ナノ粒子の内部移行は、細胞のSSCのシフトを誘導する。ゲートがあまりにも密接に目的の細胞集団の周りに制限されている場合、取得されたデータは、おそらく検出される細胞の一部を見逃すであろう。 </li><li> 2未染色標本、ブランク試料として使用するための1およびPI染色（オプション）に対する補償のための1、補償される各蛍光チャンネルのための適切な蛍光色素を持つ単一の染色されたサンプルを使用しています。 注：実験のラベルで使用される各蛍光標識抗体に別の1.5ミリリットルのサンプルチューブを使用してください。 </li><li> 「機器設定」欄の「報酬」タブを開きます。増加または波及チャネル内の蛍光強度は蛍光色素のposためにほぼ同じになるまで収集中に補償係数を減少させるitiveおよび陰性集団。 </li><li>補償が調整した後、ナノ粒子で処理したサンプルを取得する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+nanomaterials+and+biological+systems:+Implications+to+personalized+nanomedicine.">Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 1363-1384 (2012).</li><li>Radad, K., Al-Shraim, M., Moldzio, R., Rausch, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+benefits+and+hazards+of+engineered+nanoparticles.">Recent advances in benefits and hazards of engineered nanoparticles.</a> Environ. Toxicol. Pharmacol. 34, 661-672 (2012).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+engineered+nanomaterials.">Immunological properties of engineered nanomaterials.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 469-478 (2007).</li><li>Shi, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+recruitment+during+infection+and+inflammation.">Monocyte recruitment during infection and inflammation.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 762-774 (2011).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li><li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+engineering+for+immunomodulation.">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462, 449-460 (2009).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+functionalisation+regulates+polyamidoamine+dendrimer+toxicity+on+blood-brain+barrier+cells+and+the+modulation+of+key+inflammatory+receptors+on+microglia.">Surface functionalisation regulates polyamidoamine dendrimer toxicity on blood-brain barrier cells and the modulation of key inflammatory receptors on microglia.</a> Nanotoxicology. 8, 158-168 (2013).</li><li>Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+engineered+nanoparticles+with+in+vitro+toxicity+assays.">Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays.</a> Arch. Toxicol. 86, 1123-1136 (2012).</li><li>Malvindi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiO2+nanoparticles+biocompatibility+and+their+potential+for+gene+delivery+and+silencing.">SiO2 nanoparticles biocompatibility and their potential for gene delivery and silencing.</a> Nanoscale. 4, 486-495 (2012).</li><li>Bardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiO2+NPs:+Promising+Candidates+for+Drug+and+Gene+Delivery.">SiO2 NPs: Promising Candidates for Drug and Gene Delivery.</a> Drug Deliv. Lett. 1, 9-12 (2011).</li><li>Bardi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+amino+functionalized+CdSe/ZnS+quantum-dot-Doped+SiO2+nanoparticles+with+primary+neural+cells+and+their+gene+carrying+performance.">The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles with primary neural cells and their gene carrying performance.</a> Biomaterials. 31, 6555-6566 (2010).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+andgreen+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion andgreen fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li></ol>

著者らは、ミルテニーバイオテク社は、この原稿の提出を後援したことを宣言します。 HiQの·ナノ·カンパニー（ <a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">http://www.hiq-nano.com/index.htmlは</a> ）IITから生じナノテクノロジースピンオフ企業です。

実験プロトコルは、考慮すべき非常に重要な点を提示する。より高い温度およびライトがマイナスの染色歩留まりに影響を与える可能性があるので、それは、すべての染色工程中に4℃（氷上）で、おそらく暗闇の中で働くことは本当に重要です。ナノ粒子は、より良い使用直前に再懸濁されるように超音波処理することができた。 フローサイトメトリー分析の正しい流れが異なるチャネルで正しいキャリブレーションが必要です。機器のキャリブレーションは、すべての実験セッションの前に行われるべきである。計測機器に関する技術上の問題のほかにも、抗体標識に問題がある場合もあります。これは、適切な濃度での抗体を使用することが必須です。濃度が高すぎるまたは低すぎる場合には、不満シグナル強度は結果であり得る。 この手法の問題の欠点単分散サンプルでの作業の必要性、ローカライズすることができないこと信号（ すなわち 、異なる細胞区画）が発生する場所。組み合わせて使用​​される蛍光色素の選択においていくつかの限界もある。励起および発光バンドの波長が十分にそれらの適切な測定を可能にするために分離しなければならない。使用する抗体のスペクトルが重なる場合は、正しい補正が必要となります。 フローサイトメトリーは、存在又はナノ粒子の非存在下での細胞分析のための強力な方法である。この技術は、細胞のマルチパラメトリック研究を可能にし、イベントの高い数を調査、分析の迅速性（1,000以上のセル/秒）、再現性と統計的測定値。試料は、細胞生存率を失うことなく処理することができる。 蛍光標識されたナノ粒子を用いることにより、細胞膜上に露出した特異的なマーカーによって同定される細胞亜集団において、その内在化を修飾し、定量化することが可能である。セルパラメータは、Sの存在下で変更することができます<html> pecificナノ粒子。研究の目的に応じて、これらの変動は、比例的に増加し、ナノ粒子内在化速度と共に増加するような細胞の側方散乱のような特定の現象を同定するために使用することができる。 細胞表面のナノ粒子誘発性修飾もまた技術の限界を表すことができる。このため、細胞膜受容体の代謝回転は、常に考慮して注意する必要があり、おそらく正確に目的の細胞集団を特徴付けるために事前に知られている。ナノ粒子、オーバーロードのサンプル中の膜浸透の極端な障害は、細胞死につながることができます。 ナノ材料用量依存性の毒性を経験的に各細胞集団について試験されるべきである。明確に定義された死細胞は、蛍光定量化から除外されなければならない。例えば、アネキシンV / PI染色は、通常、壊死およびアポトーシス細胞の両方を検出するために使用されるいくつかの方法の一つである。 &quot;&gt; GFP発現初代細胞は、特定の細胞亜集団を選択して、前標識することなく、データを収集するための強力なツールです。補完的な蛍光ナノ粒子との組み合わせは、細胞 - ナノ粒子の相互作用の非常に高速かつ正確な定量が可能になります。薬物または遺伝子送達があると考えられている選択した組織への特定の薬物負荷を放出することができるナノ粒子を適用することにより、将来的に向上させること。 医薬品の送達担体および/ ​​または免疫モジュレーターのような特定のナノ粒子の雇用は、細胞-ナノ粒子相互作用を研究するために生物学的環境（ すなわち、フローサイトメトリーを介して）の知識を必要とする。

工業ナノ材料は、最近の生物医学1への潜在的なアプリケーションのための生命科学者の関心を鼓舞している。無機および有機材料の多種多様な異なる形状、物理的および化学的特徴を有するナノ構造体を製造するために使用することができる。これらの構造の中では、球状の人工ナノ粒子は、診断および翻訳の薬2のための大きな可能性を示した。それらのコアと表面設計が可能アプリケーションによって駆動され、それは、ナノ粒子の接触および相互作用を、以下の標的細胞応答の深遠な研究を意味する。意図的にヒト対象に投与されると考えられているナノ粒子は、免疫細胞のいくつかのタイプと直接接触するであろう。身体の整合性を維持するために彼らの責任は彼らナノメディシン3中の調査の重要な話題になります。 先天性免疫系の細胞性部分は、主に食作用によって表されるcytes。これらの中でも、中枢神経系常駐ミクログリアを含む、単球/マクロファージ系統由来の細胞は、免疫防御4,5において重要な役割を果たす。彼らは外国の団体と遭遇した後、数時間以内に防御反応を誘発することができます。さらに、単球細胞は、サイトカインの放出を介して適応免疫応答を調整し、指示する。すべてのこれらのイベントでも、主に免疫系6によって「非自己」と認識されている設計の材料の存在下で起こる。 歴史的に、細胞免​​疫学分析のために用いられる方法の中で、最も強力なツールのうちの1つを表すフローサイトメトリー。さらに、特定の免疫亜集団の同定または精製のための技術の利用可能性（多くの場合、除外または1つの膜タンパク質の存在を利用する）は、その特定の一次CE上の特定のナノ粒子の効果の正確な調査を可能にするLLタイプ7。しかし、細胞は、ナノ粒子への暴露後に生理学的および形態学的変化を提示することができる。同様に、ナノ粒子が得られる結果に影響を及ぼす8、定義された波長で、光の吸収または発光のような特定の光学的パラメータを妨げることができる。だから、使用および新規材料の研究に古典の免疫学的アッセイの最終的な適応の限界が考慮されるべきである。 この作業は、フローサイトメトリーによる一次免疫細胞とナノ粒子の相互作用の検出に関する。この問題に対処するために、50nmのFITC-SiO 2のナノ粒子は、方法を説明するためのモデルとしてナノ材料を用いた。シリカ粒子は、ナノメトリックスケールで非常に正確な方法で製造することができる。例えば、電荷または疎水性などのサイズ、形状、および表面特性は、それらの生体適合性微細9を増加させるために調整することができる。のSiO 2ナノ粒子の多くの特徴は、それらをとして使用することを可能にする薬物送達のためのモデルは、粒子10。また、蛍光色素または量子ドットは、捕捉され又は画像化目的のために有用な11ナノツールを提供するこれらの粒子に結合させることができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14170-088</td>
			<td style="width:256px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 (ATCC Modified)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum (lot n&#176; 1131917)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin 2.5%</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Pooled Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>34005100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Versene</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td>15040-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse I</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b-VioBlue human &#38; mouse</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACS BSA Stock Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Rinsing Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Running buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Running Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Human Pan monocyte isolation kit&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood Column Kit</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood CD14 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">LS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MidiMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Red Blood Cell Lysis Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Pre-Separation Filters 30 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Analyzer flow cytometer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Calibration Beads</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">GEH17544202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:272px;">FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:272px;">Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">12-well plate Falcon</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of fluorescent nanoparticle interactions with primary immune cell subpopulations by flow cytometry

人工ナノ粒子は、治療および診断目的のために非常に有望な特性に恵まれている。この作品は、免疫細胞とナノ粒子の相互作用を研究するためのフローサイトメトリーによる分析の高速で信頼性の高い方法を説明している。一次免疫細胞が容易に、抗体媒介性の磁気単離によって、ヒトまたはマウス組織から精製することができる。最初のインスタンスにおいて、フローサイトメーターで実行して異なる細胞集団は、内部の複雑さをセルに関連するセルサイズに比例する前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）によって識別することができる。さらに、特定の細胞表面受容体に対する蛍光標識抗体は、同じサンプル内のいくつかの亜集団の同定を可能にする。細胞は、それらの生理学的および形態学的状態を変化させる外部刺激によって後押しされたとき、多くの場合、これらすべての機能が異なります。ここで、50nmのFITC-SiO 2のナノ粒子は、目を識別するためのモデルとして使用されているヒトの血液の免疫細胞内のナノ構造材料の電子の内在化。ナノ粒子とのインキュベーション後の細胞蛍光及び側方散乱光の増加は、私たちは、ナノ粒子 - 細胞相互作用の時間および濃度依存性を定義できる。さらに、そのようなプロトコルは、具体的には、単球/マクロファージ系統に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する変異マウスから単離された中枢神経系の常在免疫細胞を、初代ミクログリアによるローダミンのSiO 2ナノ粒子の相互作用を調査するために拡張することができる。最後に、細胞へのナノ粒子の内部移行に関連するデータフローサイトメトリー、共焦点顕微鏡によって確認されている。

フローサイトメトリーは、種々の細胞を同定し、特徴づけるための有用なツールであり、それは、単球、顆粒球、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、樹状細胞（DC）などの特定の免疫細胞を同定するために選択された技術であり、白血球の他の亜集団。 より良好なナノ粒子に応答して白血球の挙動を特徴付けるための努力において、我々は、一次白血球に内在化アッセイを行った健康なドナー（ 図1および2）およびヒト単球細胞株（THP-1細胞を、 図3）の血液から単離され。 図1Aに報告されているように、三つの主要な血液白血球亜集団が明確にPBMCを分離した後に、前方および側方散乱によって同定した。また、FITC-SiO 2の処理後に、リンパ球（灰色）、単球（青色）及び顆粒球（赤色）が異なるnを有する緑色蛍光強度（ 図1B）に示すようにanoparticle内在率。記載されているプロトコルは、PBMCからの原発のCD14陽性単球の精製を可能にする。 図2（a）は 、FITC-SiO 2の存在下でのCD14 +単球のドットプロット、フローサイトメトリーを報告します。 図2Bは、同じ細胞で定量FITC-SiO 2の内在化を示しており、で表現対数スケールのヒストグラム。 同様の内在化実験をFITC-SiO 2のナノ粒子の増加する濃度で処理したTHP-1単球上で実施した。未処理細胞を陰性対照として使用した。 図3（a）は、THP-1細胞株において変化しない前方散乱と側方散乱の用量依存的増加を示している。 図3Bにおいて、一緒に試験した各FITC-SiO 2のナノ粒子濃度のSSCおよびFSCのヒストグラムと、平均蛍光強度（MFI）の定量化が提示される。このデータは、FITC-SiO 2のナノ粒子での処置は、細胞内粒状の増強（側面散乱）および蛍光（緑色チャンネル）によって強調された単球の用量依存性の内在化を誘導することを示唆している。 免疫細胞およびナノ粒子間の相互作用のタイプへのさらなる洞察を得るために、次混合グリア細胞培養物を単離し、ミクログリアは、中枢神経系の常在免疫細胞を精製した。緑色蛍光ミクログリアを発現するトランスジェニックマウスモデルの使用は、異なる神経炎症機序の可視化を可能にする。本研究で使用したトランスジェニックマウスB6.129P- カインtm1Litt / Jはカインプロモーター12の制御下に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する。 体外 （DIV） での 7日後、蛍光顕微鏡は、アストロサイトが多数（GFP陰性の接着細胞と混合し、一次グリア文化を示していますS）といくつかの緑の細胞（GFP陽性、 図5A）。 GFP - - （星状細胞および他のグリア細胞）、ミクログリアのCD11b + GFP +細胞の第2の異なる群と、第1のCD11b：このマウスモデルでは、三グリア細胞の亜集団は、単一のCD11b抗体染色とフローサイトメトリーによって区別することができる第三のCD11b + GFP -亜集団（ 図4A）。これら2後者の亜集団は、フローサイトメトリー分析（ 図4B）で示されるように、両方（CX3CR1プロモーターの転写によるパトロール未熟ミクログリアを表す）、GFP +集団による若干の効率を高めたナノ粒子を内部化することができます。 図5Bに示すように、発生した内部移行は、さらに、ローダミンのSiO 2ナノ粒子の同じ最終濃度を用いて共焦点顕微鏡により確認することができる。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" /> 図1。孤立した血液白血球中のFITC-SiO 2のナノ粒子の内在化。A）側散乱（SSC） 対代表前方散乱（FSC）フローサイトメトリーフィコール·パック単離された血液の白血球のプロットをドットに流れる。三大血白血球のB）の緑色蛍光オーバーレイヒストグラムプロット1時間1 nMのFITC-SiO 2のナノ粒子（45 MV）の存在下での細胞亜集団は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" /> <stronG&gt;図2。 CD14 +精製単球中のFITC-SiO 2のナノ粒子の内在化。A）側に対して代表前方散乱（FSC）散乱（SSC）フローサイトメトリー精製し、CD14陽性単球のプロットをドットに流れる。の存在下で、精製された単球亜集団のB）と緑色蛍光ヒストグラムプロット1時間1nMのFITC-SiO 2のナノ粒子（45 MV）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" /> 図3。サイドscatterin に対する THP-1細胞上のFITC-SiO 2のナノ粒子内在化の効果は、A）代表前方散乱（FSC）Gは（SSC）の順方向（FSC）と緑の散乱、側散乱の濃度。B）濃度依存変動（SSC）を増やすFITC-SiO 2のナノ粒子の1時間の曝露後に、THP-1単球細胞株のドットプロットフローサイトメトリー1時間FITC-SiO 2のナノ粒子（45 MV）の存在下での蛍光。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" /> 図4。 B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / Jマウスから単離された初代ミクログリアにローダミン-SiO 2のナノ粒子の内在化。A）緑色蛍光タンパク質（GFP）のCD11b-VioBlue抗体の流れに対する PRのドットプロットサイトメトリーB6.129P-CX3CR1 tm1Litt / Jマウスから単離しimary混合グリア。のCD11b + GFP +とのCD11b + GFP -集団はそれぞれ、右上と右下の象限に示されている30のための1 nMのローダミン-SiO 2のナノ粒子（45 MV）の存在下でのミクログリア集団のB）の赤色蛍光オーバーレイヒストグラムプロット。コントロール（灰色のヒストグラム） 対分（赤ヒストグラム）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" /> 図5。 GFP +ミクログリアの可視化（A）、7 DIVと（B）での蛍光顕微鏡共焦点顕微鏡GFP +ミクログリアにおけるローダミン-SiO 2のナノ粒子の内在化（赤矢印）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる免疫細胞の亜集団と定義されたナノ粒子の相互作用の解析。

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

detection-fluorescent-nanoparticle-interactions-with-primary-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.4K ビュー.  Istituto Italiano di Tecnologia. フローサイトメトリーによる免疫細胞の亜集団と定義されたナノ粒子の相互作用の解析。 

ビデオ: Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

免疫・感染学

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

フローサイトメトリーによって負傷した脊髄組織における免疫細胞の定量的評価：セルの精製方法のための新しい使用法

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

フローサイトメトリーによる肺および肺リンパ節の分析とマウスの非外科的気管内注入

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

の相互作用を研究<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;フローサイトメトリーとタイムラプス顕微鏡による好中球と

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

の検出<em&gt;トリパノソーマ</em磁気活性化細胞選別し、フローサイトメトリーによって&gt;バリアント表面糖タンパク質の切り替え

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

7 免疫細胞サブセット 2 螢光色素の差別フローサイトメトリー

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...