我々は動物の手術で彼らの助けのためにレベッカ西、MS、およびカリフォルニア大学アーバイン校でのクリストファー＆ダナリーブ財団の動物中核施設の技術者に感謝。我々はまた、技術支援、原稿とビデオ撮影の準備とアニメーションのためガブリエラフネス、ウシャNekantiとDenisseモレノに感謝。この研究は、NINDS（AJAへRO1 NS43428 - 01）、アメリカの麻痺プロジェクト（HXNにPPA - 32574）、および再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM）幹細胞のトレーニング賞HXNにT1 - 00008によってサポートされていました。 KDBは、カリフォルニア大学アーバイン校（T32 NS007444）における分子細胞神経科学におけるトレーニングプログラムによってサポートされていました。

1。脊髄組織の解離<ol><li>脊髄セグメント以前に1で説明した以外の負傷または挫傷脊髄の負傷のT8 - T10（T9で負傷）Sprague Dawleyラットは、室温で解剖し、HBSSで細かいハサミで機械的に解離された。組織解離に先立ち、全脊髄の列は、コードセグメントT8 - T10の抽出の前に5分間ドライアイス上で維持した。 </li><li> 37℃で遠心分離によって取得された（1分間、1000rpmで、室温）と2.5 mgのトリプシンおよび20分間5ミリリットルDME（ダルベッコ変法イーグル培地）に5 mgのコラゲナーゼで酵素的に解離された組織のビット°粉砕の前にC（〜10倍室温で）ガラスパスツールピペット（9インチ）付き。 </li><li> DME + 10％ウシ胎児血清10mlの酵素活性を阻害するために細胞に添加し、40μmのセルストレーナーに通して濾過した。クイックスピンした後、細胞ペレットをHBSS 6mlに再懸濁し、OptiPrep勾配のソリューション以下に説明の上で合成。 </li></ol> 2。 OptiPrep勾配ソリューションを作成する<ol><li>希釈OptiPrepはMOPSバッファー（0.15 M NaCl、10mMのMOPS、pH7.4）でOptiPrep 1:1に希釈することにより構築した。 </li><li>四OptiPrep勾配のソリューションは、混合350、250、200、または1ミリリットル（表1）の最終容量にHBSSで150μlの希釈OptiPrepによってなされた。 </li><li> 4つのソリューションは、ゆっくりと慎重に、少なくとも下部に希釈し、上部（図1A）で最も希釈した15 mlコニカルチューブ内のレイヤーに配置した。 </li></ol> 3。細胞から脂質/ミエリン破片の分離<ol><li> HBSSで解離脊髄細胞6mlを注意深くOptiPrep勾配のソリューションの上に重層した。 </li><li>管を含む細胞と勾配のソリューションは、脂質との別個の層に細胞溶液を分離し、スイングバケットローター（A - 4 - 62）とエッペンドルフ遠心分離機5810Rを使用して（15分、1900 rpmまたは726 RCF、20℃）遠心したペレット中の炎症細胞、グリア、および赤血球と神経細胞の3層、続いて/ミエリンは破片（チューブの上部7 ml）を、。単球、マクロファージ、PMNの顆粒球、リンパ球を含むほとんどの炎症性細胞は、ペレットで発見されたものの、一部の大型活性化マクロファージは、ペレット上の層で見つけることができる。 </li><li>脂質/ミエリン破片の層（上位7 ml）を注意深く吸引して除去した。次いで、細胞を洗浄し、2.5mlのHBSSに再懸濁し、下記の免疫標識に使用した。 </li></ol> 4。フローサイトメトリーのために特定の免疫細胞の免疫標識<ol><li>脊髄の調製物から採取した細胞（500μl）をペレット化し、赤血球を溶解するために5分間0.85％塩化アンモニウム（蒸留水で希釈）に再懸濁した。 </li><li>細胞を500μlのHBSSで洗浄し、室温で正常ウサギやマウスの血清で30分間ブロッキングした。 </li><li>またはで希釈したアイソタイプIgG溶液セルが1抗体との時間（;マウス抗ラットED1アレクサ488、Serotecまたはマウス抗ラットCD3をアレクサ488ウサギ抗- PMN FITC、正確な化学と科学）のために洗浄し、室温でインキュベートしたHBSSは（1:100希釈ですべて）、前述1に記載。 </li><li>細胞は、最終ステップの後に300μlのHBSSに再懸濁し、上記とし、各ステップの後に二回洗浄した。 </li></ol> 5。フローサイトメトリーによる細胞定量的評価<ol><li>サンプルは、セルクエストソフトウェアを使用してFACSキャリバー（ベクトン- Dickinson社）フローサイトメーターで分析した。サンプルあたり5,000個のイベントは、すべてのサンプルのために読んでいた、とデータ解析は、サミット（DakoCytomation）で完成しました。 </li><li>フローサイトメトリーゲートは、以前は次の1に記載のように時間のポイント間での正規化のためのベースライン値を設定するには、無傷の対照動物からコントロールIgGアイソタイプ標識細胞や脊髄細胞を用いて設定されていました。積極的に標識された細胞の平均値は、サンプル全体のパーセント（± SEM）として表した。 </li></ol> 6。代表的な結果： ミエリン破片を除去し、フローサイトメトリーによる免疫細胞の検出を向上させるためにOptiPrep勾配の能力は、1解像度（図1B）、SCI 1月3日後のPMN浸潤の以前に報告されたピーク時に脊髄PMNはを定量化することによって評価した。また、同じ解剖脊髄は、ミエリン破片のOptiPrep除去することなく酵素的に解離し、同様にフローサイトメトリーによるPMN浸潤を並列に評価した。我々は以前に1を報告しているように、単独で酵素的解離に比べOptiPrep勾配精製法で分離した試料中のイベントの位置にずれがあった、無傷のミエリンの残骸のサンプルで検出されたPMNの割合を示すことはほんの一部（0.5％）であったOptiPrep purifで検出されたPMNの割合（5.1％）のIEDのサンプル（図1B）。これらのデータは、損傷した脊髄組織における免疫細胞の検出の感度を高める組織調製物中のミエリン破片がフローサイトメトリーの測定値をあいまいにし、ミエリンの破片のその除去を実証できることを示唆している。 損傷した脊髄の細胞検出のためのOptiPrep勾配系の感度を確立した後、我々は2時間から180 dpiに至るまでの期間にわたって細胞浸潤の変化を特徴とし、PMNは、マクロファージを含むSCI後の細胞の炎症の新たな多面的な応答を設立/ミクログリアとT -細胞。として1から3までの研究によって確認された、PMNは、最初の2時間後に傷害でコードを入力し、1解像度（図2＆4）でピークに達した。一方、マクロファージ/ミクログリア1,4,5は 、3解像度まで、脊髄損傷の検出、および7解像度（図3＆4）で最初にピークを迎えていませんでした。驚いたことに、我々はマクロファージ/ミクログリア第二時間60 dpiのピークと180解像度（図3＆4）を介して上昇残ったことを初めて示す。マクロファージ/ミクログリアと同様に、T細胞の浸潤は7解像度5-7ピークに達すると予測された、T -細胞の上昇数が検出されたもののしかし、フローサイトメトリーは、最初の7解像度のT細胞数の変化を検出しなかった9時解像度（1.6％）（図4）。 T細胞数が10解像度が減少した一方で、永続的なT細胞応答は細胞の4.4％がCD3（図4）のために標識した時点で180解像度、で観察した。 一緒に、これらのデータは、SCI後の細胞性炎症（図4）の時間依存性の多面的な応答を示し、細胞の炎症の初期段階は、解像度がED1のピークが続くPMNは1の初期のピークから成っていた+マクロファージ/ミクログリア7解像度及びT細胞9解像度、後での段階は、60 dpiでマクロファージ/ミクログリアの注目に値する番目のピークと、14 dpiと180解像度を通じて持続した後に上昇し、3つの細胞集団で構成されている。このtimecourseの研究およびフローサイトメトリーによって生成された定量的データは、免疫標識脊髄のセクション1の定量的な立体学から収集したデータに匹敵する結果を示し、以前に検証されています。 <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table1.jpg" alt="表1"/> 表1。ミエリンの破片を除去するためのOptiPrep勾配の準備。四OptiPrep勾配のソリューションをHBSSおよび希薄化後OptiPrep（OptiPrepとMOPSの1:1希釈）を使用して行われる。 <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。OptiPrep勾配の密度別のほとんどのミエリン/脊髄損傷の組織/細胞からの破片やフローサイトメトリーによる免疫細胞の評価を改善。 （A）ミエリン/残骸は、ミエリン/残骸層の吸引に続いOptiPrepの勾配を通じて解離脊髄組織の遠心分離後の細胞（ニューロン、グリアおよび免疫細胞）から分離した。脊髄損傷における（B）PMN番号、瓦礫撤去後のPMNが検出における感度の向上（スチューデントのt -検定、p = 0.0001）を示す。 nはグループごとに= 5、平均± SEM、すべてのフローサイトメトリーゲートは、無傷の動物からの標識された細胞を用いて設定されていました。サンプルあたり5,000個のイベントは、すべてのサンプルのために読んでいたし、積極的に標識された細胞の平均値は、サンプル全体のパーセント（± SEM）として表した。 <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig2.jpg" alt="図2"/> 図2フローサイトメトリーによる脊髄損傷におけるPMN浸潤の検出。 T9での適度な（200 KD）挫傷の傷害の後に、PMNがすぐに2時間（B）後の傷害を開始し、1解像度（C）のピーク脊髄に入った。すべてのフローサイトメトリーゲートは、無傷の動物（）から標識された細胞を使用して設定された。 <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。マクロファージ/フローサイトメトリーによる脊髄損傷におけるミクログリアの浸潤の検出。 T9での適度な（200 KD）挫傷の傷害の後、ED1 +マクロファージ/ミクログリア数は、解像度（D）3から脊髄損傷で増加して7解像度（E）で急性ピークに、14解像度（F）で低レベルに低下、前に60解像度（G）の第二ピークに上昇し、最大180解像度（H）に脊髄損傷にとどまった。 7解像度脊髄細胞のIgGアイソタイプのコントロールのラベル（B）は、最小限の抗体標識の背景と2時間からの抗体 - 標識された細胞のポスト外傷（C）または無傷（A）動物に違いを示した。すべてのフローサイトメトリーゲートは、無傷の動物からの標識された細胞を用いて設定されていました。 <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table2.jpg" alt="表2"/> 表2。 timecourse実験における動物のサンプルは、各時点（0時間180解像度）は、5匹の動物は、T9での適度な（200 KD）挫傷の傷害を受けたと脊髄組織はPMNは、ED1 +マクロファージ/ミクログリア、およびCD3 + T細胞の数のためにフローサイトメトリーによって評価した。ただし、すべての動物の試料はPMN（4-5）、ED1（3-5）、およびCD3（4-5）フローサイトメトリー分析のために正常に回復した。 <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig4.jpg" alt="図4"/> 図4。T9で中等度（200 KD）挫傷の傷害後脊髄の細胞の炎症のtimecourse。として、フローサイトメトリー、PMNの数字、ED1 +マクロファージ/ミクログリア、及びCD3によって評価+ T細胞急性ピーク（それぞれ1,7、および9解像度、）と脊髄損傷で慢性的に持続した。nは = 3〜5％グループは、平均± SEM。

<ol>
	<li>Beck, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cellular+inflammation+after+traumatic+spinal+cord+injury:+evidence+for+a+multiphasic+inflammatory+response+in+the+acute+to+chronic+environment.">Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment.</a> Brain. 133, 433-447 (2010).</li><li>Nguyen, H. X., Galvan, M. D., Anderson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+early+and+terminal+complement+proteins+associated+with+polymorphonuclear+leukocytes+in+vitro+and+in+vivo+after+spinal+cord+injury.">Characterization of early and terminal complement proteins associated with polymorphonuclear leukocytes in vitro and in vivo after spinal cord injury.</a> J Neuroinflammation. 5, 26-26 (2008).</li><li>Saville, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monoclonal+antibody+to+CD11d+reduces+the+inflammatory+infiltrate+into+the+injured+spinal+cord:+a+potential+neuroprotective+treatment.">A monoclonal antibody to CD11d reduces the inflammatory infiltrate into the injured spinal cord: a potential neuroprotective treatment.</a> J Neuroimmunol. 156, 42-57 (2004).</li><li>Popovich, P. G., Wei, P., Stokes, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+inflammatory+response+after+spinal+cord+injury+in+Sprague-Dawley+and+Lewis+rats.">Cellular inflammatory response after spinal cord injury in Sprague-Dawley and Lewis rats.</a> J Comp Neurol. 377, 443-464 (1997).</li><li>Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+hematogenous+macrophages+promotes+partial+hindlimb+recovery+and+neuroanatomical+repair+after+experimental+spinal+cord+injury.">Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 158, 351-365 (1999).</li><li>Jones, T. B., Hart, R. P., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+physiological+and+pathological+T-cell+recruitment+after+mouse+spinal+cord+injury.">Molecular control of physiological and pathological T-cell recruitment after mouse spinal cord injury.</a> J Neurosci. 25, 6576-6583 (2005).</li><li>Kigerl, K. A., McGaughy, V. M., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+lesion+development+and+intraspinal+inflammation+in+four+strains+of+mice+following+spinal+contusion+injury.">Comparative analysis of lesion development and intraspinal inflammation in four strains of mice following spinal contusion injury.</a> J Comp Neurol. 494, 578-594 (2006).</li><li>Lipton, H. L., Kallio, P., Jelachich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+quantitative+analysis+of+spinal+cord+cells+from+Theiler's+virus-infected+mice+without+the+requirement+for+myelin+debris+removal.">Simplified quantitative analysis of spinal cord cells from Theiler's virus-infected mice without the requirement for myelin debris removal.</a> J Immunol Methods. 299, 107-115 (2005).</li><li>Bagamery, K., Kvell, K., Landau, R., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+CD41-labeled+platelets+isolated+by+the+rapid,+one-step+OptiPrep+method+from+human+blood.">Flow cytometric analysis of CD41-labeled platelets isolated by the rapid, one-step OptiPrep method from human blood.</a> Cytometry A. 65, 84-87 (2005).</li><li>Majd, S., Zarifkar, A., Rastegar, K., Takhshid, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+adult+rat+hippocampal+neurons+with+long-interval+changing+media.">Culturing adult rat hippocampal neurons with long-interval changing media.</a> Iran Biomed J. 12, 101-107 (2008).</li><li>Tjoa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+flow+cytometry+to+assess+neutrophil+infiltration+in+the+injured+murine+spinal+cord.">The use of flow cytometry to assess neutrophil infiltration in the injured murine spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 129, 49-59 (2003).</li><li>Gonzalez, R., Glaser, J., Liu, M. T., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+inflammation+decreases+secondary+degeneration+and+functional+deficit+after+spinal+cord+injury.">Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 184, 456-463 (2003).</li><li>Stirling, D. P., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+inflammatory+response+after+murine+spinal+cord+injury+revealed+by+flow+cytometry.">Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry.</a> J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

CNSでの免疫細胞を定量化するためにフローサイトメトリーの使用は、脂質/ミエリン含量と破片によって複雑になる。抗体の結合および特異性に干渉に加えて、ミエリンの残骸は、測定感度と精度が8減少、免疫細胞に類似した大きさと造粒特性を持つことができます。ここで説明する新しい細胞の調製法は、ミエリン破片の除去に有効であり、それによって損傷した脊髄の細胞の炎症の変化を検出するフローサイトメトリーの感度を向上させます。 SCIは、PMNはのための完全な時間の経過を含むようにした後、例えば、免疫細胞のこの方法の拡張検出によってミエリン破片の除去がalone.Critically酵素的解離に比べ、この方法の斬新な使用量は、急性および慢性の細胞の炎症の最初の特性を許可マクロファージ/ミクログリア、及びT -細胞の最大180 dpiの、そして細胞の炎症の新たな第二相を同定した。神経炎症の多​​面的なコンポーネントのこれらの重要な知見は、SCIの両方のセルベースおよび薬理学的介入を含む合理的な治療戦略の設計および実装するために重要になることがあります。 OptiPrep勾配システムは、細胞培養の目的で10の脳から血液9の細胞、または浄化するニューロンから別の破片に使用されていますが、我々は、修正や脊髄解離細胞からミエリン破片を分離するためにこのメソッドシステムを進め、および許可されているフローサイトメトリーによる細胞の炎症を迅速かつより正確に定量化。ほとんどの研究が唯一の特定の細胞型ではないか常にtrueを提供することができない形態学的および組織学的手法を用いて中枢神経系の細胞の炎症を特徴としているとして、フローサイトメトリーと一緒にこの方法では、CNSの損傷または病理学的状態の後に炎症の研究に大きな進歩を提供しそうです定量的評価。さらに、いくつかの最近の研究では、新鮮な解離脊髄組織11,12またはPercoll勾配システム13により分離された細胞を用いたフローサイトメトリーにより脊髄損傷の免疫細胞を定量化しようとしましたが、これらの研究は、低細胞収量のいずれかを実証するか区別しないしている免疫細胞の検出。 対照的に、OptiPrep勾配の細胞調製法は、最初に段階的傷害の重症度に応じて、180 dpiの拡張timecourse以上の細胞炎症の変化へのフローサイトメトリーによる高感度かつ信頼性の高い定量的な評価を提供しています。フローサイトメトリー分析の感度及び信頼性は、特定の免疫細胞の種類を検出するために使用される抗体の特異性に依存し、フローサイトメトリーとして形態学的基準は、さらに細胞の種類を区別することを許可していません。 PMNは、マクロファージ/ミクログリアやT -伝えるための抗体の特異性は、腹膜PMNは、負傷した脊髄組織の1,2の文化と細胞の肺胞マクロファージのフローサイトメトリーで徹底的にテストされています。 OptiPrep勾配のシステムと一緒に、フローサイトメトリーで使用する場合のこれらの抗体は、SCIの微小環境のダイナミクスに新たな洞察を提供している細胞の炎症の時間と定量分析の世代に貢献し、そして最初に拡張された多面的な応答を同定した細胞性炎症の。 SCI後の細胞のこの多面的な応答は、損傷後の特定の時間に存在する特定の細胞型の役割を調べるため、けがを悪化させることができる特定の細胞型に対する治療的介入を生成することが重要な場合があります。さらに、これらの知見は、SCIに最適な薬剤や細胞ベースの介入のために適切な根拠の開発を支援することがあります。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> OptiPrep </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> NC9182490 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td>シグマ</td><td> H1387 </td></tr><tr><td>ウサギ抗ラットPMN（FITC） </td><td>正確なケミカル＆サイエンティフィック</td><td> AIFAD51140 </td></tr><tr><td>マウス抗ラットED1（のAlexa Fluor ® 488） </td><td> ABD Serotec </td><td> MCA341A488 </td></tr><tr><td>マウス抗ラットCD3（FITC） </td><td> ABD Serotec </td><td> MCA772F </td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>シグマ</td><td> T9935 </td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>シグマ</td><td> C5138 </td></tr><tr><td> DME </td><td>シグマ</td><td> D1152 </td></tr><tr><td>マウスIgG1（のAlexa Fluor ® 488） </td><td> ABD Serotec </td><td> MCA1209A488 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td>ウサギ血清</td><td>ジャクソンイムノ</td><td> 011-000-120011-000-120 </td></tr><tr><td>マウス血清</td><td>ジャクソンイムノ</td><td> 015-000-120 </td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td> BDファルコン</td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry:  a novel use for a cell purification method

形態学的または組織学的手法を用いて負傷した中枢神経系の免疫細胞（CNS）の検出は、常に細胞の炎症の真の定量分析が提供されていない。フローサイトメトリーは負傷し、脳や脊髄の組織に免疫細胞を定量化するために迅速な方法の一つです。歴史的に、フローサイトメトリーは、血液または解離脾臓または胸腺から採取した免疫細胞を定量するために使用されている、とだけいくつかの研究では、新鮮な解離脊髄組織を用いたフローサイトメトリーにより損傷した脊髄の免疫細胞を定量することを試みた。しかし、解離脊髄組織は、細胞と誤認し、フローサイトメーターにより得られた細胞数の信頼性を減らすことができますミエリン破片に集中している。我々は、フローサイトメトリーによる脊髄損傷における細胞性炎症の高感度かつ信頼性の高い、数量を提供して、細胞から効率的に別個の脂質/ミエリン破片にOptiPrep勾配系を用いて細胞の調製法を進めてきた。我々の最近の研究（。。ベック＆グエンら、脳2010年2月、133（パート2）：433〜47）に記載されているように、OptiPrepの細胞調製はのカウントで、損傷した脊髄の細胞の炎症を検出する感度を増加していた傷害の重症度と相関する特定の細胞タイプ。批判的に、このメソッドの小説用法は2時間からに至るまでの期間にわたって多形核白血球（PMNは、好中球）、マクロファージ/ミクログリア、及びT -細胞のための完全な時間の経過を含むようにSCI後の急性および慢性の細胞の炎症の最初の特性評価を提供180日後の傷害（解像度）、細胞の炎症の驚くべき小説第二段階を識別する。この方法を使用して細胞性炎症の徹底した特性評価は、負傷したCNSの神経炎症のより良い理解を提供し、セルベースおよび薬理学の両方を含む、合理的な治療戦略の設計と実装のために重要かもしれない神経炎症の重要な多面的な構成要素を明らかにすることがありますSCIのための介入。

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Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

フローサイトメトリーによる負傷者/病理学的な中枢神経系における細胞性炎症の定量は感度/精度を低下させる、細胞に類似した大きさと造粒を持つことができる脂質/ミエリン破片によって複雑になる。我々は、ミエリン破片を除去し、損傷した脊髄のフローサイトメトリーによって細胞の検出を向上させるために細胞の調製法を進めてきた。

フローサイトメトリーによって負傷した脊髄組織における免疫細胞の定量的評価：セルの精製方法のための新しい使用法

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

quantitative-assessment-immune-cells-injured-spinal-cord-tissue-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.0K ビュー.  University of California. フローサイトメトリーによる負傷者/病理学的な中枢神経系における細胞性炎症の定量は感度/精度を低下させる、細胞に類似した大きさと造粒を持つことができる脂質/ミエリン破片によって複雑になる。我々は、ミエリン破片を除去し、損傷した脊髄のフローサイトメトリーによって細胞の検出を向上させるために細胞の調製法を進めてきた。

ビデオ: Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

免疫・感染学

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

パーコール勾配を用いて脳と脊髄単核細胞の単離

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

フローサイトメトリーによる胸腺正と負の選択の検討

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

免疫応答やスリープ中の定量的測定<em&gt;ショウジョウバエ</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

T細胞におけるクロマチンの状態を評価するためにフローサイトメトリーの使用

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...