1。プロセスの前に、以下の項目を準備して収集する<ol><li>手順の実行中にマウスを抑制するために木製のプラットフォームを構築するための）は図1aの画像）と1bを参照してください。 </li><li>リンパ節のための消化ミックス - HBSS + 1.25mg/mlコラゲナーゼTypeIVまたは2.5 mg / mlのコラゲナーゼD </li><li>肺のための消化ミックス - HBSS + 1 mg / mlのコラゲナーゼ</li><li> LDLNsを可視化するために腹腔内注射のためにPBS中にラテックスビーズを（1:20）で希釈</li></ol> 注：LDLNsを見つけるのは小さいと難しいです。それらを見つける方法を学ぶために、マウスに赤色蛍光ラテックスビーズは、IP希釈1:20の200μlの注入。腹膜は、これらのLDLNs 8に排出されます。 24 HPIは、前述のようにマウスの胸腔を公開。 LDLNsは腹膜腔から排出ビーズからピンク色表示になります。 <ol start="5"><li>赤血球（RBC）のLysis Buffer - 0.15M NH 4 Clを 、10mMのKHCO 3、0.1mMの硫酸ナトリウム 1LのdH 2 0 EDTA。 7.2から7.4にpHを調整し、室温で保管。 </li><li> 70μmまたは100μmのセルストレーナー</li><li> 0.5M EDTAのストック溶液は、pH = 8.0 </li><li> CaCl 2とMgCl 2をなしHBSS </li><li>はさみと平滑末端鉗子</li><li>喉頭鏡</li><li>角度で強制経口投与の針（22ゲージ）曲げ（図2） </li><li>発泡スチロールボードとマウスを拡散するためのピン</li><li>トップパンのバランス</li><li>アニリンブルー溶液- H 2 Oで10mg/ml </li></ol> 注：我々はそれ注入技術の実証のためのこのソリューションを使用する。 2。マウス麻酔の準備と管理<ol><li>最終濃度がそれぞれ2mg/mlと10mg/mlとなるように滅菌PBSでキシラジンとケタミンの混合物を準備します。 </li><li>トップパンのバランスの上でマウスを量る。 </li><li>それぞれのマウスに必要な用量を計算する。キシラジン（2-4 mg / kg体重）とケタミン（70〜80 mg / kg）を体重で投与量は準備された混合物の適切な量を使用しており、intaperitoneallyを注入する。各マウス系統は、麻酔薬の最適化が必要な場合があります。あまりにも多くの麻酔薬を投与したマウスは、接種を肺に注入された後に致命的になる可能性が減少した呼吸速度を持つことができます。 </li><li> 3-5分後、麻酔の効果のためのマウスを観察。マウスが完全に麻酔であることを確認するために、次の標識を確認してください： <ol><li>呼吸速度が遅くなるはず。 </li><li>首が拾ったときにマウスがその腕を伸ばしてはいけません。 </li><li>後肢が刺激されているすべての応答があってはいけません。 これらの基準が満たされていない場合、数分間待つと次のステップに進む前にもう一度確認してください。 </li></ol></li></ol> 3。気管内注入<ol><li> 50μlの生理食塩水でinnoculumを準備します。 innoculumと無菌ベントの強制経口投与の針を備えた1ミリリットル注射器を埋める。注射器は、流体のすべてが肺に注入されるようにinnoculum背後に100μlのエアポケットをロードする必要があります。 </li><li>ワイヤ上の切歯がぶら下がって斜め木製の台の上にマウスを置き、そっとリボンの部分のある場所でそれを抑制する。 </li><li>左手で喉頭鏡をオンにする（あなたは右利きの場合）と平滑末端ピンセットをつかむ。そっと口を開く詮索する喉頭鏡と鉗子の先端を使用してください。 </li><li>鉗子で、舌を引き出し、側にそれを保持する。口の奥に向かって喉頭鏡のブレードをガイド。あなたが気管の開口部が表示されるまで、90 °の角度で非常に穏やかに押された喉頭鏡を保持。場所で喉頭鏡を保持する。口から舌を引っ張るとは組織の損傷が発生しないので、これは穏やかに行われる必要がある場合は注意が必要です。 </li><li>針の曲がりが正面切歯がなるまで、もう片方の手で、あなたの右の手で曲げ胃管栄養針を備えたinnoculumを含む1ミリリットル注射器を、取ると気管に針を挿入する。 innoculumを提供するために均等にプランジャーを押してください。 innoculumはバブルではないはずです。できるだけ早く気管の針を引き抜きます。マウスは呼吸ができなくなると気管が長時間ブロックされていれば死んでしまう。 innoculumが肺に吸入できるようにするために数秒間直立マウスを押したまま。 </li><li>プラットフォームのノックアウトマウスを取り出し、加熱ランプの近くに置きます。長時間直接加熱マウスを放置しないでください。マウスは、プロシージャ（回復時間は菌株によって異なる場合があります）後30分以内に完全に目覚めでなければなりません。マウスはこの期間中に熱心に観察されるべきであると、熱過ぎたり冷た過ぎたりすることは許されないこれはまた、死に至る呼吸困難にマウスを置くことができます。 </li></ol> 4。フローサイトメトリーのための収穫と処理肺所属リンパ節と肺<ol><li> AVMAの安楽死ガイドラインに従って目的のメソッドを使用してマウスを生け贄に捧げる。これは、個々の収穫の成果によって異なる場合があります。ペントバルビタールナトリウムの致死行うの管理は、適切な安楽死の手順の例です。我々はCO 2で安楽死の否定的な肺の効果を見ていない。 </li><li>解剖ボード上の腕と脚を固定する。はさみと腹側の中央に沿って切開を加えます。お肌を引っ張ると胸壁の筋肉を公開。 </li><li>腹部の臓器を公開する胸壁の筋肉を通して切開を加えます。 </li><li>鉗子や穿刺ダイアフラムと胸骨の先端を保持する。胸郭の側面に沿って振動板をカット。 </li><li>解剖の基板面に平行なはさみは、両側の背腹のラインに沿って胸腔カットスルーで。 </li><li>わずかに胸郭を持ち上げる。心臓の右側に、ちょうど胸腺の下に、二つのリンパ節を探します。少し大きめの第三リンパ節は気管に垂直に動作する小動脈の血管の下に位置しています。収穫のリンパ節リンパ節消化ミックス1mlに。 </li><li>リンパ節を採取した後、ピンセットで心臓を保持し、別の肺をつかむ。 6ウェルプレートに、氷冷PBSの3ミリリットルに収穫の肺。 </li><li> 、肺の葉を分離するPBSを吸引し、鉗子や鋏を使用して小片に葉を切る。肺のための消化ミックスの3ミリリットルを追加。このステップの間に氷の上で6 - ウェルプレートを保管してください。 </li><li> 37℃で30分25-30分と肺のリンパ節をインキュベート℃に氷上に反応し、場所を停止する消化混合物の各々に10mMの最終濃度にEDTAを追加。 </li><li> 3ミリリットル注射器を使用して、18GA針を通して3回肺の部分を渡します。マッシュ1ミリリットル注射器のプランジャーのバックエンドを使用して70 -100μmのセルストレーナーを通って肺とLNSの作品。のCa 2なしHBSS 10mlの+およびMg 2 +を持つセルストレーナーを洗浄してください。 5分間、500 × gで遠心する。 </li><li> RBC溶解バッファー5mlにペレットを再懸濁し、室温で3分間インキュベート。のCa 2なしHBSS 10mlのを追加する+およびMg 2 +溶解して急冷する。 5分間、500 × gで遠心する。それぞれ10ミリリットルと5ミリリットルに肺とLDLN単一の細胞懸濁液を立ち上げます。トリパンブルー排除により、血球計を用いて生細胞を数える。セルはフローサイトメトリーのために染色する準備が整いました。肺の1葉は、フローサイトメトリーのための十分な場合があります。他の葉は、そのような組織のためのサイトカインまたは組織のホモジネートと同じマウス内の他の実験の質問のために使用することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果： 後発開発途上国（LDCs）や肺の肺胞マクロファージは、肺の肺胞腔から抗原を取得、すぐに注射した後。図3は、CD11cは+（後発開発途上国（LDCs）や肺胞マクロファージに発現する）の割合蛍光標識炭疽菌の芽胞陽性の細胞は、30分後に注入を示しています。この時点では、肺の単一細胞の懸濁液中のCD45 + CD11c +細胞の〜15.9％ 炭疽菌の胞子（図3、下側のパネル）をかくまった。肺のCD11c +細胞のさらなる特徴付けのために、金とBraciale 4を参照してください。蛍光標識ビーズを日常的にLDLNs 9に粒子状抗原の人身売買を評価するために使用されます。 LDLNsに肺からこの輸送を評価するために、蛍光ラテックスビーズは、LPSとLDLNsでそれを注入した24 HPIで分析した。 LDLNsのCD11c ハイテク細胞の約4％が24hpi（図4）で蛍光ビーズをかくまった。これらの代表的な実験は、このプロトコルは効率的にLDLNsへのトラフィック、それらを後に肺に吸入粒子状抗原を獲得し、細胞を追跡するために使用できることを示している。 <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。木製のそれ注入中にマウスを抑制するためのプラットフォーム。木製のブロックが斜めにカットし、金属の棒は、正面図1a適合させたれた）と側面図を図1b）。ワイヤーの小片は、マウスの前部歯を固定する金属の棒に巻き付けていた。リボンの部分は、手順の間の場所を保存しておいてマウスの周りに結びつけるためのプラットフォームに装着された。 <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。その注射のための強制飼養針。強制飼養針は（右）に注射用〜135 °（左）の角度で曲がっていた。 <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。 炭疽菌の発現に注入されたGFP（スターン- p6GFP）、5時間後の課題を抱いて肺内のすべてのCD11c +細胞の割合 。 AJマウスは1xでの挑戦であった10 8 GFP -炭疽菌の胞子と肺は5時間後の感染で分析した。ドットプロットでは、 炭疽菌の陽性なのCD11c +肺細胞の割合を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig4.jpg" alt="図4"/> 図4。私は以下のリンパ節の24時間排水肺の蛍光ビーズの検出（緑/黄）。トン注入。 AJマウスは、それとLDLNsが24hpi分析した10μgのLPS（右パネル）を含むPBS（左パネル）または5 × 10 9 Fluoresbrite YGミクロスフェア（0.5μmの）のどちらかを与えられた。代表的なドットプロットでは、空のチャネルに対してプロットした蛍光ビーズを抱いLDLNsのCD11c ハイテクの細胞の割合を示しています。

<ol>
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V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、肺からLDLNsに炭疽菌の胞子の人身売買を研究するためにこのプロトコルを利用してきた。同様のアプリケーションの場合は、肺に送達粒子の数を慎重に注入材をフローサイトメトリーによってLDLNsで検出することができるように選択する必要があります。我々はまた、正常細胞と蛍光標識抗体を使用して、特定の肺の細胞集団のラベリングの養子移入のためにこのメソッドを使...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> 70μmセルstariner </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td>アニリンブルー</td><td>フィッシャー</td><td> A967 - 25 </td><td></td></tr><tr><td>動物の餌針</td><td>ポッパーとサンズ株式会社</td><td> 7920 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>シグマ</td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼTypeIV </td><td>ワージントン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼD </td><td>ロッシュ</td><td> 11088974103 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite YGミクロスフェア（0.5μmの） </td><td> Polysciences、株式会社</td><td> 17152 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなしHBSS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td>ケタミン塩酸（100mg/ml） </td><td>ホスピーラ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>喉頭鏡ブレード</td><td> PennCentury株式会社</td><td>モデルLS - 1の</td><td>を参照してください<a href="http://www.penncentury.com">www.penncentury.com</a> </td></tr><tr><td>軽量の光ファイバー喉頭鏡</td><td> WelchAllyn </td><td> 80814 </td><td></td></tr><tr><td>レッド蛍光ビーズ（0.5μmの） </td><td>インビトロジェン</td><td> F8812 </td><td> ip注射用</td></tr><tr><td>キシラジン（100mg/ml） </td><td>ロイド研究所</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry

このような肺胞マクロファージや肺樹状細胞（後発開発途上国）などの貪食細胞が継続的に肺の肺胞腔からの抗原をサンプリング。後発開発途上国（LDCs）は、特に、肺所属リンパ節（LDLNs）彼らは免疫原1,2の様々な適切な免疫応答を開始するT細胞に吸入抗原を提示場所。に移行することが知られていますマウスの肺と空気中の抗原との間のモデルの相互作用に、抗原は気管内に5またはエアロゾル6など、鼻腔内に1,3,4に投与することができる。それぞれの経路による配送は別個の技術的スキルと実験を設計する前に考慮する必要があるの制限を伴います。例えば、鼻腔とエアロゾルの暴露は、肺や上気道の両方に抗原を提供します。したがって、抗原は、潜在的に結果の解釈を複雑にして、鼻関連リンパ組織（NALT）7にアクセスできます。さらに、嚥下、くしゃみやマウスの呼吸数も納入線量の不整合が生じる可能性があります。上気道の関与がいくつかの研究のために好まれるかもしれませんが、それは特に肺に開始されたイベントを中心に実験を複雑にすることができます。それは直接肺に試験材料を提供し、NALTをバイパスするため、この設定では、気管内（IT）ルートが望ましい。多くのIT注入プロトコルでは、口腔や肺にアクセスするために気管の外科的暴露による気管のどちらかのブラインド挿管を伴う。ここで、我々はそれを点眼するためのシンプルで一貫性のある、非外科的方法を説明します。気管の開口部は、喉頭鏡を用いて可視化されており、曲げ胃管針は、innoculumを提供するために気管に直接挿入されます。我々はまた、フローサイトメトリーにより抗原の人身売買の分析のためにLDLNsと肺の収穫と処理を行うための手順について説明します。

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Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

我々は気管を経由して麻酔したマウスの肺に試験物質の非外科的配信を示しています。このメソッドは、肺の細菌やウイルス性病原体への曝露、サイトカイン、抗体、ビーズ、化学物質、または染料を許可します。我々は、さらにフローサイトメトリーのために肺および肺リンパ節（LDLNs）の収穫と処理を説明します。

フローサイトメトリーによる肺および肺リンパ節の分析とマウスの非外科的気管内注入

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

non-surgical-intratracheal-instillation-mice-with-analysis-lungs-lung

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

57.0K ビュー.  University of Colorado School of Medicine. 我々は気管を経由して麻酔したマウスの肺に試験物質の非外科的配信を示しています。このメソッドは、肺の細菌やウイルス性病原体への曝露、サイトカイン、抗体、ビーズ、化学物質、または染料を許可します。我々は、さらにフローサイトメトリーのために肺および肺リンパ節（LDLNs）の収穫と処理を説明します。

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Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

の相互作用を研究<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;フローサイトメトリーとタイムラプス顕微鏡による好中球と

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

免疫・感染学

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

での感染の間に流入領域リンパ節へのマウスの皮膚樹状細胞の移動を研究するためにCFSEベースアッセイ<em&gt;マイコバクテリウム・ボビス</em&gt;カルメット - ゲラン

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

This article provides detailed methodology to identify and quantify functional T lymphocyte subsets present within murine kidney, aorta and lymph nodes by intracellular staining and flow cytometry. The model of angiotensin II induced hypertension was chosen to explain, step-by-step, the procedures and fundamental principles of flow cytometry and intracellular staining.

細胞内染色およびフローサイトメトリーは、高血圧のモデルにおけるマウス大動脈、腎臓及びリンパ節内のリンパ球サブセットを識別するために、

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

コレクションと RNA 解析のための大型動物からリンパ節の処理: リンパ節トランスクリプトーム研究大型動物種のための準備

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

マウス胸腺、膵リンパ節および脾臓フローサイトメトリーを用いた排水における制御性 T 細胞サブセットの定量

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic findings similar to human acute respiratory distress syndrome (ARDS). The resulting alveolar edema, alveolar-capillary barrier damage, and leukocyte infiltration predominantly affect the left lung, preserving the right lung as an uninjured control and allowing animals to survive. This model of self-limited acute lung injury enables investigation of tissue resolution mechanisms, such as macrophage efferocytosis of apoptotic neutrophils and restitution of alveolar-capillary barrier integrity. This model has helped identify important roles for resolution agonists, including specialized pro-resolving mediators (SPMs), providing a foundation for the development of new therapeutic approaches for patients with ARDS.

Selective intra-bronchial acid instillation to the left lung in mice results in unilateral and self-limited acute lung injury that models human acute respiratory distress syndrome (ARDS) induced by gastric acid aspiration.

一方的気管支内酸インスティレーションによる自己限定急性肺損傷のモデル

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...