Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft unterstützt.

1. Erstellung der Plasmide <ol><li> Subklonierung der cDNA für jedes Protein von Interesse in sowohl den pLuc und pYFP Vektoren unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken (Abbildung 1). Für detaillierte Protokolle siehe Green et al 13. </li><li> Sequence alle Konstrukte, um zu überprüfen, dass die Proteine ​​von Interesse sind im Rahmen mit dem Luc / YFP-Sequenz ohne dazwischen Stop-Codons. </li><li> Funktionstests durchzuführen, wie gewünscht, um zu bestätigen, daß die Fusionsproteine, die biologische Aktivität beibehalten. In dem hier vorliegenden Fall wurde die subzelluläre Lokalisation von YFP Fusionsproteine ​​mittels Fluoreszenzmikroskopie ermittelt. </li><li> Machen Expressionsplasmide für entsprechende Luc und YFP Kontrollproteinen durch gentech die relevanten Targeting-Signale in den pLuc und pYFP Expressionsvektoren. In dem hier vorgestellten Fall erzeugen Kernziel Luc und YFP-Konstrukten durch Einfügen eines Kernlokalisationssignal in die pLuc pYFP und Vektoren. </li><li> Macheneine positive Kontrolle, in der Luc-Konstrukt und YFP zu einem einzigen Polypeptid fusioniert. In dem hier dargestellten Fall erzeugen eine positive Kontrolle, bei der die YFP-kodierenden Sequenz in den Vektor eingefügt pLuc. </li><li> Wähle einen neutralen Füllstoff-Plasmid verwendet werden, um die Masse der DNA-Transfektion in Mischungen auszugleichen. Verwenden ein Plasmid, das keine eukaryotischen Promotor und daher transkriptionell inaktiv in Säugerzellen, wie beispielsweise einer bakteriellen Clonierungsvektor. </li></ol> 2. Herstellung von DNA-Mischungen <ol><li> Schätzung der Konzentration aller in Abschnitt 1 auf der Basis der Absorption bei 260 nm beschriebenen Plasmide (1 Absorptionseinheit beträgt 50 ug / ml DNA). Bestimmung der Molekülmasse von jedem Plasmid durch Multiplizieren der Anzahl von Basenpaaren von 650 Da. Verwenden der Konzentration und Molmasse, um die molare Konzentration der einzelnen Plasmid-Präparation zu berechnen. Verdünne die Plasmid-DNA-Präparationen in einer Konzentration von 36 nM. Diese werden die Arbeitsvorräte werdendas wird verwendet, um die DNA-Mischungen für die Transfektion vorzubereiten. </li><li> Vorbereitung einer Kontroll-DNA-Gemisch, das 1,800 ng Plasmid-Füllstoff in einem Endvolumen von 20 &amp;mgr; l Wasser. </li><li> Bereiten Sie eine Kontroll-DNA-Mix mit 5 ul der pLuc-Kontrollkonstrukt. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen. </li><li> Bereiten Sie eine Kontroll-DNA-Mix mit 5 ul pLuc-Kontrollkonstrukt und 5 ul pYFP-Kontrollkonstrukt. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen. </li><li> Bereiten Sie eine Kontroll-DNA-Mix mit 5 ul der positiven Kontrolle Konstrukt. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen. </li><li> Bereiten Sie die folgenden DNA mischt, um für die Homodimerisierung eines Proteins von Interesse, X. Test für jede DNA-Mischung kombiniert 5 ul der entsprechenden pLuc konstruieren und 5 ul des pYFP zu konstruieren. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen. A) pLuc-Steuerung und pYFP-X B) pLuc-X und pYFP-Steuer C) pLuc-X und-X pYFP </li><li> Bereiten Sie die folgenden DNA vermischt, um eine Wechselwirkung zwischen einem Paar von Proteinen von Interesse zu testen, X und Y für jede DNA-Mischung kombiniert 5 ul der entsprechenden pLuc konstruieren und 5 ul der pYFP konstruieren. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen. A) pLuc-Steuerung und pYFP-X B) pLuc-X und pYFP-Steuer C) pLuc-Steuerung und pYFP-Y D) pLuc-Y und pYFP-Steuer E) pLuc-X-und-Y pYFP F) pLuc-Y und X-pYFP </li></ol> 3. Transfektion <ol><li> Ernte subkonfluenten HEK293-Zellen aus einem 75 cm 2-Kolben. Verdünnte 10% der gesamten Zellen in 13 ml Kulturmedium. Dispense 130 ul Zellsuspension in jede Vertiefung einer weißendurchsichtigem Boden 96-well Gewebekulturplatte. Kulturzellen für 24 Stunden. </li><li> Berechnung der Anzahl der Vertiefungen durch Multiplikation der Anzahl der DNA-Mischungen von 3 transfiziert werden. Bringen serumfreiem Kulturmedium auf Raumtemperatur. Erstellen Sie einen Master-Mix mit 6,3 ul Serum-freien Medium und 0,18 ul Transfektionsreagenz pro Vertiefung. Durch Vortexen mischen und bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Bereiten Transfektion Mischungen durch Zugabe von 2 ul DNA-Mix auf 20 ul Serum-freien Medium / Transfektionsreagenz Master-Mix. Nicht mit dem Vortex. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Transfektion von drei Brunnen mit jeder Transfektion Mix Abgabe 6,5 ul Transfektionsmischung pro Vertiefung. Kultur die Zellen für weitere 36 bis 48 Stunden. </li></ol> 4. Messung von BRET-Signal <ol><li> Auflösen lebenden Zellen Luciferase Substrat bei 34 mg / ml in DMSO durch Vortexen. </li><li> Verdünnen wiederhergestellt Lebendzell-Luciferase-Substrat bei 1:1000 in Verdünnungsmedium Substrat pauf 37 ° C wieder erwärmt, Lassen Sie 50 ul Substrat Verdünnungsmedium pro Vertiefung. Vortex mischen. Ein Niederschlag bilden kann, aber nicht mit dem Assay interferieren. </li><li> Absaugen Kulturmedium aus der 96-Well-Platte. Geben Sie 50 ul verdünnte Lebendzell-Luciferase-Substrat in jede Vertiefung. Kulturzellen für mindestens 2 Stunden (bis zu 24 h). </li><li> Nehmen Sie den Deckel von der 96-Well-Platte und Inkubation der Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur in dem Luminometer. </li><li> Messen von Emissions Luc und YFP eine gut zu einem Zeitpunkt. Messen Emission von Luc mit einem Filter blockieren Wellenlängen größer als 470 nm ist. Messen von Emissions YFP Verwendung eines 500-600 nm Bandpass-Filters. Integrieren Emissionssignale über 10 sek. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Mittelwert der Luc Emissionswerte von den 3 Brunnen, die nur den Füllstoff Plasmid erhielt. Subtrahieren Sie diesen Wert von allen anderen Luc Emissionswerte, die Hintergrund-subtrahiert Luc Emissionswerte zu erzeugen.</li><li> Mittelwert der YFP Emissionswerte von den 3 Brunnen, die nur den Füllstoff Plasmid erhielt. Subtrahieren Sie diesen Wert von allen anderen YFP-Emissionswerte, die Hintergrund-subtrahiert YFP-Emissionswerte zu erzeugen. </li><li> Für jeden gut, teilen Sie die Hintergrund-subtrahiert YFP-Emissionswert durch den Hintergrund-subtrahiert Luc Emissionswert um den unkorrigierten BRET-Verhältnis geben. </li><li> Mittelwert der unkorrigierten BRET-Verhältnisse aus den drei Brunnen, die nur mit dem pLuc-Kontroll-Plasmid transfiziert wurden. Subtrahieren Sie diesen Wert von allen anderen unkorrigierten BRET-Verhältnisse, um die korrigierten BRET-Verhältnisse zu geben. </li><li> Für jeden der verbleibenden Sätze von korrigierten BRET-Verhältnisse, der Mittelwert der Werte aus den drei Vertiefungen transfiziert, um eine endgültige BRET-Verhältnis zu erhalten. </li></ol>

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder.">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die Konstruktion der Fusionsprotein-Expressionskonstrukte ist ein kritischer Schritt bei der Einrichtung der BRET-Untersuchung. In den hier vorgestellten, wurden die Proteine ​​von Interesse an den C-Terminus von Luciferase oder YFP fusioniert. Es ist auch möglich und kann notwendig sein, um Proteine ​​an dem N-Terminus von Luciferase / YFP verschmelzen. Bei einigen Proteinen Fusionen können entweder nur an den N-oder C-Terminus um eine Unterbrechung der Proteinstruktur und-funktion zu vermeiden akzeptiert. Au...

Sowohl klassische Verknüpfung und Next-Generation-Sequencing-Analysen von menschlichen Erkrankungen werden enthüllt die klinische Bedeutung von Proteinen in einer Reihe von biologischen Stoffwechselwegen beteiligt. Es ist oft der Fall, dass vor der Identifizierung in dieser Untersuchungen hat es wenig oder keine Untersuchung der biologischen Funktion dieser Proteine. Ein fruchtbarer Weg erkunden die biologische Funktion eines Proteins von Interesse zu beginnen, ist zu erkennen, welche anderen Proteinen interagiert es mit in seine physiologischen Kontext. Charakterisierung molekularer Netzwerke auf diese Weise Einblicke in die biologischen Signalwege des menschlichen Phänotyp zugrunde liegen. Die am häufigsten verwendete Groß Screening Ansätze zur Identifizierung von Kandidaten-Interaktionspartner für Proteine ​​von Interesse sind Hefe-Zwei-Hybrid-Screening-1 und Massenspektrometrie-basierte Proteomik 2. Diese Methoden können in die eine mögliche interagierende Proteine ​​sehr erfolgreich sein, aber arE anfällig für falsch-positive Ergebnisse. Daher Bestätigung einer Interaktion von Hefe-Zwei-Hybrid-oder Massenspektrometrie Screening identifizierten erfordert Validierung der Interaktion mit einer zweiten Technik. Typischerweise wird eine Co-Immunfällung oder Pull-down-Assays für diesen Zweck 3 verwendet. Ein Nachteil der Verwendung derartiger Techniken zur Validierung der Anforderung zur Zelllyse, welche die intrazellulären Bedingungen, die für die Aufrechterhaltung bestimmter Protein-Wechselwirkungen sein können zerstört. Ein zweiter Nachteil ist, dass schwache oder transiente Protein-Interaktionen während der Waschschritte kann gestört werden. Darüber hinaus sind diese Assays verlangen bedeutende praktische Zeit werden in der Anzahl der Proben, die gleichzeitig verarbeitet werden kann, begrenzt, und oft zeitaufwändige Optimierung von Reagenzien und Protokollen. Um einige der Probleme, mit Co-Immunopräzipitation Experimente zu überwinden, wurden mehrere Assays, die auf Fluoreszenz-und biolum entwickeltinescent Proteine, die in lebenden Zellen verwendet werden kann. Die ersten dieser Tests wurden auf Fluoreszenz (oder Förster) Resonanzenergietransfer (FRET), die nicht-strahlende Energieübertragung zwischen zwei fluoreszierende Proteine ​​mit überlappenden Emissions-und Anregungsspektren 4 basiert. Die Effizienz der Energieübertragung ist stark abstandsabhängig, also die Beobachtung des FRET Phänomen erfordert, dass die Donor-und Akzeptor-Fluorophore in unmittelbarer Nähe sein. Und die zweite als eine Fusion mit dem Akzeptor-Fluorophor (üblicherweise gelb fluoreszierendes Protein, YFP), um eine Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen von Interesse zu testen, wird ein Protein als Fusion mit dem Donor-Fluorophor (GFP allgemein cyan fluoreszierendes Protein) ausgedrückt. Eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen von Interesse kann die Donor-und Akzeptor Fluorophore nahe genug für die Energieübertragung auftreten zu bringen, was zu einer messbaren Erhöhung der Emission von Licht aus dem Akzeptor YFP bezogen auf die GFP Spender führen wird. FRET wurde im Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen 4 erfolgreich. Der Hauptnachteil der Verwendung von FRET zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist die Voraussetzung für eine externe Beleuchtung zur Anregung des Donor-Fluorophors. Aussenbeleuchtung zu hohen Hintergrund in der Emissionssignal, unerwünschte Anregung des Akzeptor und Bleichen von Spender-und Akzeptor-Fluorophore. Diese Effekte verringern die Empfindlichkeit des Assays zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Eine Veränderung des FRET-Assay, der das Problem der hohen Hintergrund von externen Beleuchtungswindet die Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET)-Assay 5,6. Im BRET-System der Donor-Fluorophor durch eine Luciferase-Enzym ersetzt. Somit ist die Energie für die Anregung des Akzeptor-Fluorophors in dem System durch die Oxidation eines Luciferase-Substrat erzeugt, der eine externe Beleuchtung notwendig. In der am meistenallgemeine Konfiguration dieses Assays ist die Spender Renilla reniformis-Luciferase und der Akzeptor YFP (für eine Diskussion der alternativen Donor-und Akzeptor-Proteine ​​siehe Pfleger et al. 5). Dementsprechend wird in diesem System ein Protein von Interesse an Luciferase und einem potentiell interagierenden Protein YFP oder umgekehrt fusioniert. BRET-Assay erfordert die Zugabe von Coelenterazin als Substrat für Luciferase. Da Coelenterazin zellpermeables, ist es möglich, BRET-Assays mit lebenden Zellen durchzuführen. Jedoch ist natives Coelenterazin in wässriger Lösung instabil, und das Enzym-unabhängigen Abbau von Coelenterazin sowohl die Konzentration von Substrat für den Test zur Verfügung und erzeugt Autolumineszenz, die die Empfindlichkeit der Messung der Luciferase-Aktivität reduziert. Die Verwendung von BRET in lebenden Zellen wurde durch die Entwicklung von Schutz Coelenterazine, die in wässriger Lösung stabil sind, aber durch cytosolische Esterase erleichterts nach der Diffusion durch die Zellmembran zum aktiven Coelenterazin in die Zelle 7 zu erzeugen. Nach der Zugabe von Substrat zu Zellen Luciferase-und YFP-Fusionsproteine ​​exprimieren, wird die Energieübertragung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die zu durch Überwachung der Emission von Luciferase und YFP quantifiziert. Weil Protein-Wechselwirkungen direkt in lebende Zellen in Multi-Well-Platten beobachtet werden, stellt die BRET-Untersuchung eine einfache, skalierbare Verfahren zur Validierung putative Wechselwirkungen, kosten-und zeiteffizient ist. Neben der Validierung putativen Interaktoren in Proteom-Screening Studien identifiziert, kann das BRET-System auch Testkandidat Interaktoren, die aus dem Stand der biochemischen und strukturellen Studien zu dem Protein von Interesse verwendet werden. Nachdem das Vorliegen einer Protein-Protein-Wechselwirkung (entweder unter Verwendung des BRET-Assays oder durch andere Verfahren) hergestellt wurde, gibt es ein Potential für die BRET-Untersuchung zu emp seinLoyed weiter, um die Interaktion zu charakterisieren. Zum Beispiel können die zusammenwirkenden Bereiche durch Erzeugen stumpf Versionen der Proteine ​​abgebildet werden, und die Beteiligung von spezifischen Resten in der Interaktion kann durch die Schaffung von Punktmutationen nachgewiesen werden. Weiterhin kann die modulatorische Wirkung von posttranslationalen Modifikationen oder kleine Moleküle (z. B. Drogen oder Liganden) an Protein-Protein-Wechselwirkungen untersucht werden 8-10. BRET-Assay hat auch ein großes Potenzial für die Untersuchung von Mutationen in Patienten-DNA identifiziert. In Fällen, wo eine ursächliche Rolle für eine Mutation festgestellt wurde, die Untersuchung der Wirkung der Mutation auf die Protein-Protein-Interaktionen mit BRET kann mehr über die molekularen Ätiologie des Phänotyps 11 offenbaren. Seit dem Aufkommen von Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation, ist es zunehmend üblich, mehrere potentiell schädlichen Mutationen in einer einzelnen identifiziert werden, in welchem ​​Fall es nicht klar, welche rele sindvant mit dem Phänotyp 12. In dieser Situation kann der BRET-Untersuchung wertvoll bei der Bewertung der Auswirkungen der Mutationen auf die Proteinfunktion und damit ihre Bedeutung für die Erkrankung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1333">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Nanodrop 8000</td>
			<td style="width:123px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:780px;">Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">96 microwell plates, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655098</td>
			<td style="width:780px;">White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:276px;">Infinite F200Pro plate reader with control software</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td style="width:780px;">Use the &#39;Blue 1&#39; and &#39;Green 1&#39; filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLuc, pYFP, positive control plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmids available from the authors upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-3Zf(+)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2271</td>
			<td>Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>85120602</td>
			<td>Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM, high glucose, with phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td style="width:780px;">This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 &#176;C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063</td>
			<td style="width:780px;">This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 &#176;C waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985</td>
			<td style="width:780px;">OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">GeneJuice transfection reagent</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70967</td>
			<td style="width:780px;">If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td style="width:780px;">Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">EnduRen live-cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6481</td>
			<td style="width:780px;">Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 &#176;C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer

Assays, die auf Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer (BRET) eine empfindliche und zuverlässige Mittel zur Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu überwachen. BRET ist die nicht-strahlende Energieübertragung von einem &quot;Geber&quot; Luciferase-Enzym, um eine &quot;Akzeptor-Fluoreszenzprotein. Bei der häufigsten Konfiguration dieses Assays ist die Spender Renilla reniformis-Luciferase und der Akzeptor gelb fluoreszierendes Protein (YFP). Da die Effizienz der Energieübertragung ist stark abstandsabhängige Beobachtung des BRET Phänomen erfordert, dass der Donor und der Akzeptor in der Nähe sein. Um eine Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen von Interesse in kultivierte Säugerzellen zu testen, wird ein Protein als Fusion mit Luciferase und die zweite als eine Fusion mit YFP ausgedrückt. Eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen von Interesse kann die Donor-und Akzeptor nahe genug für die Energieübertragung auftreten zu bringen. Im Vergleich zu anderen Techniken für die Untersuchung von Protein-Protein-inWechselwirkungen, die BRET-Assay ist empfindlich, erfordert wenig Handhabungszeit und einige Reagenzien und ist in der Lage, Wechselwirkungen, die schwache, vorübergehende, oder abhängig von der biochemischen Umgebung innerhalb einer lebenden Zelle gefunden werden, sind zu erkennen. Es ist daher ein idealer Ansatz für die Bestätigung mutmaßlichen Wechselwirkungen von Hefe-Zwei-Hybrid-oder Massenspektrometrie Proteomik Studien vorgeschlagen, und außerdem ist es gut geeignet für die Zuordnung der Interaktion Regionen, die den Effekt von post-translationalen Modifikationen auf Protein-Protein-Wechselwirkungen und Bewertung der Auswirkungen von Mutationen in Patienten-DNA identifiziert.

Das Prinzip der BRET-Untersuchung ist in Fig. 2 dargestellt. Assay-Setup in den hier vorgestellten Experimenten verwendet, ist in Fig. 3 dargestellt. Die Erfassung eines starken BRET-Signal von Zellen mit einem Luciferase-YFP Fusionsprotein transfiziert bestätigt, dass die Energieübertragung zu beobachten war in dieser Versuchsanordnung (Fig. 4). Unsere Forschung konzentriert sich auf die Rolle der Familie von FOXP Transkriptionsrepressore...

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Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Wechselwirkungen zwischen Proteinen sind von grundlegender Bedeutung für alle zellulären Prozesse. Verwendung Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer, kann die Wechselwirkung zwischen einem Paar von Proteinen in lebenden Zellen und in Echtzeit überwacht werden. Darüber hinaus können die Auswirkungen von potentiell pathogenen Mutationen zu beurteilen.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

investigating-protein-protein-interactions-live-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

22.8K Aufrufe.  Max Planck Institute for Psycholinguistics.  Wechselwirkungen zwischen Proteinen sind von grundlegender Bedeutung für alle zellulären Prozesse. Verwendung Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer, kann die Wechselwirkung zwischen einem Paar von Proteinen in lebenden Zellen und in Echtzeit überwacht werden. Darüber hinaus können die Auswirkungen von potentiell pathogenen Mutationen zu beurteilen. 

Serie: Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Mikrofluidik-Co-Kultur von Epithelzellen und Bakterien für die Untersuchung Löslich Signal-vermittelte Wechselwirkungen

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Forschung

Biologie

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Echtzeit-Überwachung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mit Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Zusammenfassung

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