Questo lavoro è stato sostenuto dalla Max Planck Society.

1. Creazione di plasmidi <ol><li> Subclone i cDNA per ogni proteina di interesse in entrambi i vettori pluc e pYFP, ​​utilizzando tecniche di biologia molecolare standard (Figura 1). Per i protocolli dettagliati vedere Green et al 13. </li><li> Sequenza tutti i costrutti per verificare che le proteine ​​di interesse in frame con la sequenza Luc / YFP senza intermedi codoni di stop. </li><li> Effettuare saggi funzionali come desiderato per confermare che le proteine ​​di fusione conservano attività biologica. Nel caso qui presentato localizzazione subcellulare delle proteine ​​di fusione YFP è stata accertata mediante microscopia a fluorescenza. </li><li> Fai plasmidi di espressione appropriata, proteine ​​di controllo Luc e YFP progettando i segnali di targeting rilevanti nei vettori di espressione pluc e pYFP. Nel caso qui presentato, generare Luc e YFP costrutti nucleari mirati inserendo un segnale di localizzazione nucleare nei vettori pluc e pYFP. </li><li> Rendereun costrutto controllo positivo in cui Luc e YFP si fondono in un singolo polipeptide. Nel caso qui presentato, generare un controllo positivo in cui la sequenza codificante YFP è inserito nel vettore pluc. </li><li> Selezionare un plasmide riempitivo neutro da utilizzare per equalizzare la massa di DNA in miscele di trasfezione. Utilizzare un plasmide che non ha promotore eucariotico e quindi sarà trascrizionalmente inattivo in cellule di mammifero, come un vettore di clonazione batterica. </li></ol> 2. Preparazione dei Mixes DNA <ol><li> Valutare la concentrazione di tutti i plasmidi descritti nella Sezione 1 basato su assorbanza a 260 nm (1 unità di assorbanza è equivalente a 50 mg / ml di DNA). Determinare la massa molecolare di ciascun plasmide moltiplicando il numero di coppie di basi da 650 bis. Utilizzare la concentrazione e la massa molecolare per calcolare la concentrazione molare di ciascun preparato plasmide. Diluire le preparazioni di DNA plasmide ad una concentrazione di 36 nM. Questi saranno i titoli di lavoroche verranno utilizzati per preparare le miscele DNA per trasfezione. </li><li> Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 1.800 ng di plasmide riempitivo in un volume finale di 20 ml di acqua. </li><li> Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 5 ml di costrutto pluc-controllo. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri. </li><li> Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 5 ml di pluc controllo costrutto e 5 ml di pYFP controllo costrutto. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri. </li><li> Preparare una miscela di DNA di controllo contenente 5 ml di costrutto di controllo positivo. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri. </li><li> Preparare la seguente miscela DNA per verificare omodimerizzazione di una proteina di interesse, X. Per ogni miscela di DNA combinare 5 microlitri del relativo pluc costruire e 5 microlitri del pYFP costruire. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri. A) pluc-controllo e pYFP-X B) pluc-X e pYFP controllo C) pluc-X e pYFP-X </li><li> Preparare la seguente miscela DNA per verificare un&#39;interazione tra una coppia di proteine ​​di interesse, X e Y. Per ogni miscela di DNA combinano 5 microlitri del relativo pluc costruire e 5 ml di pYFP costruire. Aggiungere riempitivo plasmide per portare la massa totale di DNA a 1.800 ng. Aggiungere acqua per portare il volume finale a 20 microlitri. A) pluc-controllo e pYFP-X B) pluc-X e pYFP controllo C) pluc-controllo e pYFP-Y D) pluc-Y e pYFP controllo E) pluc-X e pYFP-Y F) pluc-Y e pYFP-X </li></ol> 3. Transfezione <ol><li> Harvest subconfluente cellule HEK293 da un pallone 75 centimetri 2. Diluire il 10% delle cellule totali in 13 ml di terreno di coltura. Pipettare 130 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una biancachiaro a fondo piastra a 96 pozzetti di coltura tissutale. Cellule di coltura per 24 ore. </li><li> Calcolare il numero di pozzetti da trasfettate moltiplicando il numero di miscele di DNA da 3. Portare terreno privo di siero cultura a temperatura ambiente. Preparare una master mix contenente 6,3 ml di mezzo privo di siero e 0,18 ml di reagente di trasfezione per bene. Mescolare nel vortex e incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Preparare miscele di trasfezione con l&#39;aggiunta di 2 ml di miscela di DNA a 20 microlitri di media / trasfezione reagente master mix privo di siero. Non vortex. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Transfect tre pozzi con ciascuna miscela di trasfezione erogazione di 6,5 ml di miscela di trasfezione per pozzetto. Cultura le cellule di un ulteriore 36-48 ore. </li></ol> 4. Misurazione di segnale BRET <ol><li> Sciogliere live-cell substrato luciferasi a 34 mg / ml in DMSO di vortex. </li><li> Diluire ricostituito live-cell substrato luciferasi a 1:1000 in substrato diluizione medio pri-riscaldato a 37 ° C. Lasciare 50 ml di substrato medio diluizione per pozzetto. Vortex per mescolare. Potrebbe formarsi un precipitato, ma non interferisce con il test. </li><li> Aspirare il terreno di coltura dalla piastra a 96 pozzetti. Dispensare 50 ml di diluito live-cell substrato di luciferasi in ciascun pozzetto. Cellule di coltura per almeno 2 ore (fino a 24 ore). </li><li> Rimuovere il coperchio dalla piastra a 96 pozzetti ed incubare la piastra per 10 min a temperatura ambiente all&#39;interno luminometro. </li><li> Misurare le emissioni da Luc e YFP un bene alla volta. Misurare le emissioni da Luc usando un filtro di blocco lunghezze d&#39;onda superiore a 470 nm. Misurare le emissioni di YFP usando un filtro passa-banda 500-600 nm. Integrare segnali di emissione oltre 10 sec. </li></ol> 5. Analisi dei dati <ol><li> Calcolare la media dei valori di emissione Luc dai 3 pozzi che hanno ricevuto solo il plasmide di riempimento. Sottrarre questo valore da tutte le altre letture di emissione Luc per produrre i valori di emissione Luc fondo-sottratto.</li><li> Calcolare la media dei valori di emissione YFP dai 3 pozzi che hanno ricevuto solo il plasmide di riempimento. Sottrarre questo valore da tutte le altre letture di emissione YFP per produrre i valori di emissione YFP fondo-sottratto. </li><li> Per ogni bene, dividere il valore delle emissioni YFP background-sottratto dal valore delle emissioni Luc background-sottratto per dare il rapporto BRET corretta. </li><li> Calcolare la media dei rapporti BRET corretti dai tre pozzi che sono state trasfettate con il solo plasmide pluc-controllo. Sottrarre questo valore da tutti gli altri rapporti BRET corretti per dare i rapporti BRET corretti. </li><li> Per ciascuno dei rimanenti gruppi di rapporti BRET corretti, la media dei valori delle tre pozzi trasfettate avere un rapporto BRET finale. </li></ol>

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	<li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li><li>Gingras, A. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder.">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il design dei costrutti di espressione della proteina di fusione è un passo fondamentale nella creazione del test BRET. Negli esperimenti presentati qui, le proteine ​​di interesse sono stati fusi al C-terminale della luciferasi o YFP. E &#39;anche possibile, e può essere necessario, per fondere le proteine ​​al N-terminale della luciferasi / YFP. Per alcune proteine, le fusioni possono essere accettate solo sia la N-o C-terminale al fine di evitare interruzioni della struttura e funzione delle proteine. Inolt...

Sia il collegamento classica e sequenziamento di prossima generazione analisi dei disturbi umani stanno rivelando la rilevanza clinica delle proteine ​​coinvolte in una serie di percorsi biologici. E &#39;spesso il caso che, prima della loro identificazione in tali studi, c&#39;è stata poca o nessuna indagine del ruolo biologico di queste proteine. Una via ancora da cominciare ad esplorare la funzione biologica di una proteina di interesse è quello di identificare quali altre proteine ​​interagisce con nel suo contesto fisiologico. Caratterizzare reti molecolari in questo modo fornisce approfondimenti sui percorsi biologici alla base del fenotipo umano. Lo screening su larga scala più frequentemente utilizzato approcci per l&#39;identificazione di partner di interazione candidati per le proteine ​​di interesse sono il lievito di screening del doppio ibrido 1 e massa proteomica basata spettrometria-2. Questi metodi possono essere molto efficace nel suggerire proteine ​​che interagiscono potenziali, ma arposta vulnerabile a risultati falsi positivi. Pertanto, la conferma di una interazione individuato da lievito doppio ibrido o lo screening spettrometria di massa richiede la convalida dell&#39;interazione con una seconda tecnica. In genere si utilizza un co-immunoprecipitazione o dosaggio pull-down per questo scopo 3. Uno svantaggio dell&#39;utilizzo di tali tecniche per la validazione è il requisito per la lisi delle cellule, che distrugge le condizioni intracellulari che possono essere essenziali per mantenere certe interazioni proteina. Un secondo svantaggio è che le interazioni deboli o transitori proteine ​​potrebbero essere disturbati durante le fasi di lavaggio. Inoltre, questi saggi richiedono hands-on tempo significativo, sono limitate nel numero di campioni che possono essere elaborati simultaneamente, e spesso richiedono l&#39;ottimizzazione in termini di tempo di reagenti e protocolli. Per superare alcuni dei problemi associati con esperimenti di co-immunoprecipitazione, diverse analisi sono stati sviluppati sulla base fluorescente e bioluminescent proteine ​​che possono essere utilizzati in cellule vive. I primi tali saggi erano basati su fluorescenza (o Förster) Resonance Energy Transfer (FRET), il trasferimento non radiativo di energia tra due proteine ​​fluorescenti con sovrapposizione di emissione e spettri di eccitazione 4. L&#39;efficienza del trasferimento di energia è fortemente dipendente dalla distanza, quindi osservazione del fenomeno FRET richiede che i fluorofori donatore e accettore essere nelle immediate vicinanze. Per testare per una interazione tra due proteine ​​di interesse, una proteina è espressa come una fusione con il fluoroforo donatore (proteina fluorescente comunemente ciano; PCP) e la seconda come una fusione con il fluoroforo accettore (proteina fluorescente comunemente giallo; YFP). L&#39;interazione tra le due proteine ​​di interesse può portare i fluorofori donatore e accettore sufficientemente vicini per il trasferimento di energia si verifichi, che si tradurrà in un aumento misurabile l&#39;emissione di luce da accettore YFP relativa al donatore PCP. FRET è riuscita a individuare le interazioni proteina-proteina in cellule vive 4. Lo svantaggio principale di utilizzare FRET per rilevare le interazioni proteina-proteina è il requisito per illuminazione esterna per l&#39;eccitazione del fluoroforo donatore. Risultati illuminazione esterna in alta sfondo nel segnale di emissione, di eccitazione indesiderata della accettore, e photobleaching del donatore e del fluorofori accettore. Questi effetti riducono la sensibilità del saggio per rivelare le interazioni proteina-proteina. Una modifica del dosaggio FRET che supera il problema di fondo elevato di illuminazione esterna è la bioluminescenza Resonance Energy Transfer (BRET) dosaggio 5,6. Nel sistema di BRET il fluoroforo donatore viene sostituito da un enzima luciferasi. Così l&#39;energia per l&#39;eccitazione del fluoroforo accettore viene generato all&#39;interno del sistema per ossidazione di un substrato di luciferasi, rendendo inutile illuminazione esterna. Nella piùconfigurazione comune di questo test, il donatore è Renilla reniformis luciferasi e l&#39;accettore è YFP (per una discussione di donatore alternativo e proteine ​​accettore vedere Pfleger et al. 5). Di conseguenza, in questo sistema, una proteina di interesse è fuso ad una proteina luciferasi e potenzialmente interagenti per YFP, o viceversa. La prova BRET richiede l&#39;aggiunta di coelenterazina come substrato per la luciferasi. Poiché coelenterazina è cellula-permeabile, è possibile effettuare saggi BRET in cellule vive. Tuttavia, coelenterazina nativo è instabile in soluzione acquosa, e la ripartizione enzima-indipendente di coelenterazina sia riduce la concentrazione di substrato disponibile per il dosaggio e genera autoluminescence, che riduce la sensibilità di misurazione dell&#39;attività di luciferasi. L&#39;uso di BRET in cellule vive è stata facilitata dallo sviluppo di coelenterazines protette, che sono stabili in soluzione acquosa, ma vengono scisse da esterasi citosolicos dopo la diffusione attraverso la membrana cellulare per generare coelenterazina attiva all&#39;interno della cella 7. Dopo l&#39;aggiunta di substrato di cellule che esprimono proteine ​​YFP-fusione-luciferasi, e il trasferimento di energia derivante da interazioni proteina-proteina viene quantificata attraverso il monitoraggio delle emissioni di luciferasi e YFP. Poiché le interazioni proteina possono essere monitorati direttamente in cellule vive in piastre multi-pozzetto, il saggio BRET costituisce un metodo semplice e scalabile per la convalida interazioni putativi che costo e in tempi rapidi. Oltre a convalidare putativi interattori identificati in studi di screening proteomica, il sistema di BRET può essere utilizzato anche per interattori prova candidati derivanti da precedenti studi biochimici e strutturali sulla proteina di interesse. Una volta stabilita l&#39;esistenza di una interazione proteina-proteina (utilizzando la prova BRET o con altre tecniche), esiste il potenziale per la prova BRET sia empnon legato per caratterizzare ulteriormente l&#39;interazione. Ad esempio, le regioni interagenti possono essere mappati generando versioni troncate di proteine, e il coinvolgimento di specifici residui nell&#39;interazione possono essere dimostrati creando mutazioni puntiformi. Inoltre, l&#39;effetto modulatorio di modifiche post-traduzionali o piccole molecole (ad esempio farmaci o ligandi) sulle interazioni proteina-proteina può essere indagata 8-10. Il test BRET ha anche un grande potenziale per lo studio mutazioni identificate nel DNA del paziente. Nei casi in cui è stato stabilito un ruolo causativo per una mutazione, studiando l&#39;effetto della mutazione sulle interazioni proteina-proteina mediante BRET può rivelare più sulla eziologia molecolare del fenotipo 11. Con l&#39;avvento delle metodologie di sequenziamento di prossima generazione, è sempre più comune per le diverse mutazioni potenzialmente dannosi per l&#39;identificazione all&#39;interno di un individuo, nel qual caso non è chiaro quali sono relenenti al fenotipo 12. In questa situazione la prova BRET può essere utile nel valutare l&#39;impatto di mutazioni sulla funzione della proteina e quindi la loro rilevanza per il disturbo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1333">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Nanodrop 8000</td>
			<td style="width:123px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:780px;">Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">96 microwell plates, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655098</td>
			<td style="width:780px;">White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:276px;">Infinite F200Pro plate reader with control software</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td style="width:780px;">Use the &#39;Blue 1&#39; and &#39;Green 1&#39; filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLuc, pYFP, positive control plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmids available from the authors upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-3Zf(+)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2271</td>
			<td>Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>85120602</td>
			<td>Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM, high glucose, with phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td style="width:780px;">This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 &#176;C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063</td>
			<td style="width:780px;">This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 &#176;C waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985</td>
			<td style="width:780px;">OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">GeneJuice transfection reagent</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70967</td>
			<td style="width:780px;">If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td style="width:780px;">Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">EnduRen live-cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6481</td>
			<td style="width:780px;">Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 &#176;C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer

Le prove basate sul trasferimento bioluminescenza Resonance Energy (BRET) forniscono un mezzo sensibile e affidabile per monitorare le interazioni proteina-proteina in cellule vive. BRET è il trasferimento non radiativo di energia da un &#39;donatore&#39; enzima luciferasi ad una proteina fluorescente &#39;accettore&#39;. Nella configurazione più comune di questa analisi, il donatore è Renilla reniformis luciferasi e l&#39;accettante è proteina fluorescente gialla (YFP). Poiché l&#39;efficienza del trasferimento di energia è fortemente dipendente dalla distanza, osservazione del fenomeno BRET richiede che il donatore e accettore essere nelle immediate vicinanze. Per testare per una interazione tra due proteine ​​di interesse in cellule di mammifero in coltura, una proteina è espressa come una fusione con luciferasi e la seconda come una fusione con YFP. L&#39;interazione tra le due proteine ​​di interesse può portare il donatore e accettore sufficientemente stretto per trasferimento di energia a verificarsi. Rispetto ad altre tecniche per indagare proteina-proteina ininterazioni, il saggio BRET è sensibile, richiede poca hands-on tempo e poche reagenti, ed è in grado di rilevare le interazioni che sono deboli, transitori, o dipendente per l&#39;ambiente biochimico trovato all&#39;interno di una cella dal vivo. E &#39;quindi un approccio ideale per la conferma interazioni putativi suggeriti da lievito two-hybrid o spettrometria di massa proteomica studi, e in aggiunta è particolarmente adatto per le regioni mappatura interagire, valutando l&#39;effetto di modificazioni post-traduzionali sulle interazioni proteina-proteina, e valutare l&#39;impatto delle mutazioni identificate nel DNA paziente.

Il principio della prova BRET è illustrato nella Figura 2. Il setup dosaggio utilizzato nel corso degli esperimenti presentati qui è mostrata in Figura 3. L&#39;individuazione di un forte segnale BRET da cellule trasfettate con una proteina di fusione luciferasi-YFP confermato che il trasferimento di energia era osservabile in questa configurazione sperimentale (Figura 4). La nostra ricerca si concentra sul ruolo della famiglia FOXP di rep...

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Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Le interazioni tra le proteine ​​sono fondamentali per tutti i processi cellulari. Uso bioluminescenza Resonance Energy Transfer, l&#39;interazione fra una coppia di proteine ​​può essere monitorata in cellule vive e in tempo reale. Inoltre, gli effetti delle mutazioni potenzialmente patogeni possono essere valutati.

Indagare interazioni proteina-proteina in cellule vive utilizzando il trasferimento bioluminescenza Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

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22.7K Views.  Max Planck Institute for Psycholinguistics.  Le interazioni tra le proteine ​​sono fondamentali per tutti i processi cellulari. Uso bioluminescenza Resonance Energy Transfer, l'interazione fra una coppia di proteine ​​può essere monitorata in cellule vive e in tempo reale. Inoltre, gli effetti delle mutazioni potenzialmente patogeni possono essere valutati. 