著者らは、このプロジェクトのための財政支援を提供するための自​​然科学とカナダの工学研究評議会に感謝したいと思います。

1。乾燥藻類バイオマスの分離は、蛍光読み取りのための基準として使用されるように<ol><li>乾燥バイオマスの少なくとも200ミリグラムを提供する成長藻類培養物からの試料体積を取り外し、400〜600 mgのが好ましい。 </li><li>万X gで10分間4℃で遠心分離サンプル。上澄み液を捨て、増殖培地と同じpHに策定リン酸緩衝液等容量のペレットを洗浄。 </li><li> 3回の洗浄工程の全体について、手順1.2。 </li><li>再懸濁脱イオン水でペレットを皿の重量を量る予め秤量しに転送。 48時間50℃で乾燥させます。 NOTE：真空下で乾燥すると、乾燥時間を減少し、50°C以上の温度で培養物を乾燥させて再懸濁が困難になることができる。 </li><li>将来の使用のために室温で保存して乾燥させ、藻類培養。 </li></ol>ヘキサン抽出による中性脂質の2。重量測定定量（ブライとダイアー4より） <ol><li>量る皿に乾燥藻類バイオマスの約50ミリグラムを測定します。 NOTE：40〜80 mgの範囲の質量は、再現性を失うことなく使用することができる。 </li><li>ヘキサンで予め洗浄乳鉢にバイオマスを転送します。必要であれば、完全に乳鉢にバイオマスを転送するために、パスツールピペットを用いて少量のヘキサン（1ml）で秤量皿を洗浄する。注：ヘキサン揮発性の高い有毒物質である。それは適切な防護服とドラフト内で処理する必要があります。 </li><li>乳棒を用いて5分間藻類バイオマスを挽く。穏やかな研削で始まり、徐々に強度を増加させる。 5分間で、微細で滑らかなペースト状にバイオマスを挽く。乳鉢にバイオマスを転送する際に、過剰のヘキサンを使用する場合は、ヘキサン、研削前に蒸発するのを待つのが最善である。 </li><li>それが均質化されるまで、乳鉢にヘキサン数mlを加え、乳棒で得られたスラリーを混合する。すべての細胞破片がMORの壁に付着していることを確認してくださいタールは、遊離ノックして、液体中に懸濁する。 </li><li>遠心管にヘキサン細胞量混合物を転送します。注：遠心管は、ガラスやテフロンなどヘキサンと互換性の適切なポリマーのいずれかである必要があります。 </li><li>すべてのバイオマスが遠心管（3-5X）に転送されるまで繰り返します2.4と2.5を繰り返します。 </li><li>遠心10,000倍gで20分間4℃で試料。 </li><li>慎重に、予め秤量した金属の皿の重さに、上清をピペットで。ドラフト内で保管してください。 </li><li>ペレットにヘキサンの3ミリリットルを加えて、1分間激しくボルテックスして2 回目のヘキサン抽出を行う。 </li><li>繰り返します2.7と2.8を繰り返します。必要に応じて、すべての細胞破片が完全に安定することを確認するために第二の抽出の際に遠心分離器で30分間のサンプルを実行します。ヘキサンが完全に蒸発した後に重量測定抽出された油の質量を決定する。 </li></ol>ナイルレッドを使用した中性脂質の3。蛍光定量（Reporとしてテッド·デ·ラ·HOZまちがいなくら 11による） 注：5グラム/ Lの藻類懸濁液のみ10μlの蛍光読み取りのために必要とされる。一般的には、培養液の1.5ミリリットルから乾燥藻バイオマスの分離は十分ではありません。また、分光光度計でのランプの光強度は経時的に分解することができる。これは、機器の変化が測定値に不必要なエラーを追加しないことを保証するためにすべての実験で基準を含めることをお勧めします。 <ol><li>アルコール試薬グレードのエタノールに溶解した10μgの/ mlの濃度でナイルレッド溶液を調製する。 4℃の暗所でこのソリューションを保存する</li><li> 4℃の脱イオン水およびストア内の30％（v / v）エタノール溶液を調製</li><li>同じバイオマス濃度全く藻類のサンプルを準備します（5グラム/ Lをお勧めします）と測定で使用される規格と同様に。適切な量​​のいずれかで中断予備乾燥したサンプルでこれを行うリン酸緩衝液（0.6グラム/ Lのリン酸カリウム二塩基、1.4グラム/ Lのリン酸二水素カリウム）、または濁度を測定した後、リン酸緩衝液では5g / Lまで成長藻類培養物の濃度を調整する。注：ライブ藻類培養物に対して実行される測定は、多くの場合、濁度検量線の精度によって、それらに関連する大きな誤差を持つことになります。乾燥サンプルを再懸濁する完全にバイオマスを分散させるホモジナイザの使用を必要とし得る。 </li><li>各サンプルについて、96ウェルプレートの単一のウェル中の30％エタノール溶液80μL、ナイルレッド溶液10μl、および藻類懸濁液10μlを混ぜて。適切に蛍光測定のばらつきを考慮するために、各試料の5回の反復を実行する。 </li><li>楽器と準備中の日々の変動を考慮するために、以前に調製した標準との2点較正曲線を実行します。秒を用いた蛍光測定のための標準を調製サンプルとしてAME手順。注：一般的に2つの点が、機器の再校正のために十分である、3点が直線性を検証するために実行することができます。 </li><li>マルチウェルプレートリーダー分光光度計で蛍光測定を行う。以下の条件が最も安定した結果11が得られることが分かった。 <ol><li> 30秒間、1,200 rpmで、軌道3ミリメートルで振る。 </li><li> 10分間40℃でインキュベートする。 </li><li> 30秒間、1,200 rpmで、軌道3ミリメートルで振る。 </li><li>レコード蛍光、530nmでの励起、604 nmでの発光。 </li></ol></li><li>蛍光測定は、内部標準からの結果を使用して、油含有量へ変換する。 </li></ol> 4。蛍光顕微鏡法 NOTE：項3に記載の染色プロトコルは、定量分析のために設計され、それはまた、教育、例示puのための染色に基づいた技術の視覚表現を提供するのに有用であり得るrposes。サンプルの蛍光1の画像を生成するためには、従来の伝送および追加の落射蛍光照明光源と光学顕微鏡を必要とします。 530ナノメートル（緑）、604ナノメートル（赤）の範囲内の励起および発光光フィルターは、それぞれ、ナイルレッド染色だけでなく、関連するソフトウェアを有する顕微鏡に取り付けられたカメラのために必要とされる。この研究（ 図1）に示す画像は、RGB変換部にモノクロカメラとを備えた明視野顕微鏡を用いて取得した。これらのツールを使用してナイルレッド蛍光画像を生成するための手順を以下に概説する。 <ol><li>プロトコルのセクション3に係るナイルレッド染色で培養試料を準備します。 NOTE：5g / Lの濃度範囲の試料が過密することなく、適切な細胞密度のスライドを生成する。 </li><li>染色プロトコールのステップ3.6を完了した後、標準的な実験手順に従って処理された試料の顕微鏡スライドを準備する。 </li><li>透過モードで顕微鏡を皮切りに、顕微鏡にプレパラートをロードし、（この記事に示されている画像は、100Xの目的で取得された）所望の倍率で細胞を探します。 </li><li>集中すると、落射蛍光照明モードへの送信から顕微鏡を切り替える。光源は、現在の対物レンズ（このスライドと対物レンズとの間の空間を観察することによって視覚的に確認することができる）から直接来るべきである。 </li><li>観察光路に、光源と、赤色発光フィルタに緑色励起フィルターを挿入する;染色された細胞の蛍光は、今接眼レンズを介して直接表示されるはずです。 </li><li>車載カメラに接眼から顕微鏡観察モードを切り替えて蛍光を発する細胞の画像をキャプチャするために閲覧ソフトウェアを使用しています。カメラの感度に応じて、サンプルが最初に（ つまり画面の意志プレビューウィンドウに表示されない場合があります）黒;これを改善するために、細胞が見えるレベルまで露出時間やカメラのゲインを調整します。具体的な設定は、機器·設備、および細胞型によって変化するであろう。 </li></ol>

<ol>
	<li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiesel+from+microalgae.">Biodiesel from microalgae.</a> Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Algal+Biofuels+Technology+Roadmap.+Energy+Efficiency+&amp;+Renewable+Energy.">National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency &amp; Renewable Energy.</a> U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , (2010).</li><li>de la Hoz Siegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+microalgal+productivity+using+an+adaptive,+non-linear+model+based+strategy.">Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy.</a> Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A Rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li><li>Hara, A., Radin, N. 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(73), (2013).</li><li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species.">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).</li><li>Izard, J., Limberger, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+method+for+quantitation+of+bacterial+cell+lipids+from+whole+cells.">Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells.</a> J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Nile+red+method+for+quantitative+measurement+of+neutral+lipids+in+microalgae.">A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae.</a> J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).</li><li>de la Hoz Siegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+reliability+of+fluorescence-based+neutral+lipid+content+measurements+in+microalgal+cultures.">Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures.</a> Algal Res. 1, 176-184 (2012).</li><li>de la Jara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+lipid+content+in+a+marine+dinoflagellate,+Crypthecodinium+cohnii.">Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii.</a> J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).</li><li>Elsey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+measurement+of+microalgal+neutral+lipids.">Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids.</a> J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).</li><li>Feng, G. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+FT-IR+and+Nile+Red+methods+for+microalgal+lipid+characterization+and+biomass+composition+determination.">Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination.</a> Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).</li><li>Guzm&#225;n, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimate+by+means+of+flow+cytometry+of+variation+in+composition+of+fatty+acids+from+Tetraselmis+suecica+in+response+to+culture+conditions.">Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions.</a> Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).</li><li>Huang, G. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+method+for+lipid+production+in+alga+based+on+Nile+red+fluorescence.">Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence.</a> Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+method+for+the+determination+of+lipid+from+the+green+alga+Botryococcus+braunii.">Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii.</a> Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).</li><li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-lipid+content+strains+of+the+marine+microalga+Tetraselmis+suecica+for+biodiesel+production+by+flow+cytometry+and+single-cell+sorting.">Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting.</a> J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).</li><li>Vigeolas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+mutants+with+elevated+lipid+content+in+Chlorella+sorokiniana+and+Scenedesmus+obliquus.">Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus.</a> J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).</li><li>Bertozzini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+standard+addition+method+for+the+absolute+quantification+of+neutral+lipids+in+microalgae+using+Nile+red.">Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red.</a> J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).</li><li>Kou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+measurement+of+lipid+content+in+the+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii.">Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

標準曲線に使用される藻類は測定されているものと同じ実験条件下で栽培し、同じ種でなければなりません。有意な培地組成の変化、栽培技術、および染色プロトコルが蛍光読み取りの強度に影響を与えることができる。 （セクション1および2に記載されている）ヘキサン抽出は、標準曲線に使用した試料の中性脂質含量を測定した。正確な蛍光強度測定のために、すべてのサンプルが同じ?...

による一定のストレス条件下で脂質体を格納するためのそれらの能力のために、藻類は、潜在的な再生可能な燃料源1,2として近年注目を集めている。中性脂質は、適切な成長条件3の下で細胞乾燥重量の60％以上を占めることができます。しかし業界では、適切にバイオプロセスのパフォーマンスを監視するために、藻類の細胞の脂質含有量を定量文化を分析し、新しい株をスクリーニングするために、シンプルなきれいな、迅速で、信頼性の高い標準化されたプロトコルを持っていません。 ブライ·ダイアー重量法は、いくつかの50年前に開発、現在4,5使用される最も一般的な技術の中に残っている。この手順は、単純で信頼性が高く、実施が容易であるが、それは時間がかかり、大量の試料を必要とし、有毒な溶媒を使用する。これは、発酵実行から多くのサンプルを分析したり、新しい油を多く含む株をスクリーニングするための実用的ではありません。他の方法は、bは有するEENを開発するが、通常は先進的な設備を必要とし、6を標準化されていない。 大きな関心を集めている選択肢は、ナイルレッド染色である。ナイルレッド、非極性環境で優先的蛍光を発する染料は、線虫7、8、酵母、細菌9、10-19および藻類を含む様々な生物における脂質体を同定または定量するために使用されている。ナイルレッドを含む初期の技術は、単一キュベット分光光度法、またはフローサイトメトリー染色を組み合わせて、主に定性的または半定量的であった。また、このような緑藻類などの藻類のいくつかのクラスは、技術10の範囲が制限されて染料に大部分が不透過性で厚い細胞井戸を持っている。 ナイルレッド染色法への最近の改善は、プロトコル10,11の初期の欠点をバイパスすることが報告されている。カーの存在下で細胞を染色するIERは、DMSOの10系溶媒またはエタノール10,11は、信頼性の高い定量的な測定を可能にし、油含有量と吸光度との関係を線形化する。溶媒は、ナイルレッド分子が通過できるように、細胞膜を透過性にするのに役立ちます。さらに、マイクロプレート読み取り機能を備えた分光光度計を組み込むこと定量分析に適した高スループットプロトコルを可能にする。 この記事の我々の詳細にエタノール、穏やかな溶媒の存在下でナイルレッドと文化を染色することにより、藻の油含有量を測定するための簡単​​な方法。最も正確にするために、測定におけるバックグラウンドノイズを考慮し、油含有量を蛍光強度を相関させる標準曲線は、既知油組成物の藻類細胞を用いて現像される。この方法は、以前公開されたプロトコル10,11から採用されている。 96ウェル分光光度計を使用することにより、時間の股関節内のサンプルと同じ量を分析することができるTは、重量法により監視するために何日もかかるでしょう。さらに、所望藻類種の代表的なサンプルを使用して校正することにより、このメソッドを直接解釈可能である比較的正確な測定値を生成します。異なる株およびアプリケーション向けに最適化されたナイルレッドで藻類を染色する方法を概説し、多くのプロトコルが存在する;ここで紹介するプロトコルは、もともとデラHOZまちがいなくらによって開発されました。Auxenochlorellaのprotothecoides、クロレラ·ブルガリス 、 セネデスムスのdimorphus、及びセネデスムス斜ための11を 、それがより多くの種やクラスのための可能性が適しているが。これは、監視、バイオプロセスのパフォーマンスの特定のアプリケーションで設計されており、それが成長している培養物から、以前に乾燥した試料と湿潤試料でも同様に動作します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dry Weight</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">25 ml disposable pipettes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pipette Bulb</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">13-681-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">05-562-16A</td>
			<td>Teflon needed for hexane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Weigh Dishes (polypropylene)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">2-202B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1.5 ml micro-centrifuge tubes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Sorvall</td>
			<td style="width:152px;">RC6plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Drying Oven (Fisher 625D)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">13-254-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Storage vials</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">0337-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">05-40-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Gravimetric Quantification</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Porcelain Mortar (Coorstek)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">12-961A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Porcelain Pestle (Coorstek)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">12-961-5A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">40 ml Centrifugation tubes (FEP)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">05-562-16A</td>
			<td>Could also use glass tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Aluminum weigh dishes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">08-732-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Hexanes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">H292-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:347px;">Fluorometric quantification of oil content</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Lab Systems</td>
			<td style="width:152px;">Fluoroskan Ascent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fluorescence reader software</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Lab Systems</td>
			<td style="width:152px;">Ascent Software 2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">COSTAR 96 well plate with round bottom</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">06-443-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Nile Red&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Sigma</td>
			<td style="width:152px;">N3013-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethanol (Alcohol reagent grade)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">AC65109-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Imaging Fluorescent cells</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">DMRXA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Microscope cover slips</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Camera</td>
			<td style="width:152px;">Qimaging</td>
			<td style="width:152px;">Retiga Ex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Imaging software</td>
			<td style="width:152px;">Qimaging</td>
			<td style="width:152px;">QCapture v.1.1.8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and rapid protocol for measuring neutral lipids in algal cells using fluorescence

藻類は、彼らの自然な脂質貯蔵能力による再生可能な燃料源のための優れた候補と考えられている。藻類発酵プロセスと新しいオイルが豊富な株をスクリーニングするための堅牢なモニタリングは、細胞内の脂質含有量の測定のための高速かつ信頼性の高いプロトコルが必要です。現在の慣行は、油含有量を決定するために、重量法に大きく、時間がかかり、大量の試料を必要とする数十年前に開発された技術に頼る。本稿では、ナイルレッド、多数のタイプの生物における脂質体の存在を同定するために使用されている蛍光色素は、緑色、Auxenochlorellaのprotothecoidesの中性脂質含量を測定するための、簡単、迅速、かつ信頼性の高いプロトコルに組み込まれている藻類。この方法は、染色前に細胞膜と蛍光強度測定中に試料容量を増加させる96ウェルマイクロプレートを透過性にするために、エタノール、比較的穏やかな溶媒を使用する。それがデザインされているバイオプロセスのパフォーマンスを監視する特定のアプリケーションに編成長している培養物から、以前に乾燥されたサンプルやライブのサンプルをアッセイに使用することができます。

ナイルレッド染料で染色した代表的な藻体を図1に示されている。A. 図1の表示画像のパーツA及びB protothecoidesは非常に低い細胞内脂質の蓄積につながる、過剰窒素中で増殖させた。部品CとD、Aのサンプルにおける窒素制限下で増殖させprotothecoidesが示されている。透過照明の下では、細胞の?...

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A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

ナイルレッド染色手順を使用して藻の中性脂質含有量を決定するための簡単​​なプロトコルが記載されている。この時間節約の技術は、従来の重量ベースの脂質定量化プロトコルに代わるものを提供しています。これは、バイオプロセスの性能を監視する特定の用途のために設計されている。

蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単​​かつ迅速なプロトコル

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

35.3K ビュー.  University of Alberta. ナイルレッド染色手順を使用して藻の中性脂質含有量を決定するための簡単​​なプロトコルが記載されている。この時間節約の技術は、従来の重量ベースの脂質定量化プロトコルに代わるものを提供しています。これは、バイオプロセスの性能を監視する特定の用途のために設計されている。 

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Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

化学

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

化学固定することによりX線蛍光イメージングのための接着細胞の準備

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

リアルタイム高分解能質量分析法で直接分析を用いた植物材料の急速なハイスループット種の同定

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

A Simple and Efficient Protocol for the Catalytic Insertion Polymerization of Functional Norbornenes

Norbornene can be polymerized by a variety of mechanisms, including insertion polymerization whereby the double bond is polymerized and the bicyclic nature of the monomer is conserved. The resulting polymer, polynorbornene, has a very high glass transition temperature, Tg, and interesting optical and electrical properties. However, the polymerization of functional norbornenes by this mechanism is complicated by the fact that the endo substituted norbornene monomer has, in general, a very low reactivity. Furthermore, the separation of the endo substituted monomer from the exo monomer is a tedious task. Here, we present a simple protocol for the polymerization of substituted norbornenes (endo:exo ca. 80:20) bearing either a carboxylic acid or a pendant double bond. The process does not require that both isomers be separated, and proceeds with low catalyst loadings (0.01 to 0.02 mol%). The polymer bearing pendant double bonds can be further transformed in high yield, to afford a polymer bearing pendant epoxy groups. These simple procedures can be applied to prepare polynorbornenes with a variety of functional groups, such as esters, alcohols, imides, double bonds, carboxylic acids, bromo-alkyls, aldehydes and anhydrides.

We describe the catalytic insertion polymerization of 5-norbornene-2-carboxylic acid and 5-vinyl-2-norbornene to form functional polymers with a very high glass transition temperature.

機能性ノルボルネンの触媒挿入重合のためのシンプルで効率的なプロトコル

Norbornene can be polymerized by a variety of mechanisms, including insertion polymerization whereby the double bond is polymerized and the bicyclic ...

A Protocol for Safe Lithiation Reactions Using Organolithium Reagents

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents warrants proper technique, thorough training, and proper personal protective equipment. To aid in the training of researchers using organolithium reagents, a thorough, step-by-step protocol for the safe and effective use of tert-butyllithium on an inert gas line or within a glovebox is described. As a model reaction, preparation of lithium tert-butyl amide by the reaction of tert-butyl amine with one equivalent of tert-butyl lithium is presented.

The safe and proper use of organolithium reagents is described.

有機リチウム試薬を用いて安全なリチウム化反応のためのプロトコル

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents ...

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

使用した金ナノ粒子の効率的な放射性標識のために最適化されたプロトコル<sup&gt; 125</sup&gt; I標識アジド補綴グループ

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

HDAC1 と HDAC6 hela 細胞活性の同時測定セルを用いたクロマト MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical composition and elemental distribution within a material. Synchrotron-based XRF has become an integral characterization technique for a variety of research topics, particularly due to its non-destructive nature and its high sensitivity. Today, synchrotrons can acquire fluorescence data at spatial resolutions well below a micron, allowing for the evaluation of compositional variations at the nanoscale. Through proper quantification, it is then possible to obtain an in-depth, high-resolution understanding of elemental segregation, stoichiometric relationships, and clustering behavior.
This article explains how to use the MAPS fitting software developed by Argonne National Laboratory for the quantification of full 2-D XRF maps. We use as an example results from a Cu(In,Ga)Se2 solar cell, taken at the Advanced Photon Source beamline 2-ID-D at Argonne National Laboratory. We show the standard procedure for fitting raw data, demonstrate how to evaluate the quality of a fit and present the typical outputs generated by the program. In addition, we discuss in this manuscript certain software limitations and offer suggestions for how to further correct the data to be numerically accurate and representative of spatially resolved, elemental concentrations.

Here, we demonstrate the use of the X-ray fluorescence fitting software, MAPS, created by Argonne National Laboratory for the quantification of fluorescence microscopy data. The quantified data that results is useful for understanding the elemental distribution and stoichiometric ratios within a sample of interest.

X 線蛍光データ マップを使用しての定量化

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Fabrication and Testing of Catalytic Aerogels Prepared Via Rapid Supercritical Extraction

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three preparation methods are described: (a) the incorporation of metal salts into silica or alumina wet gels using an impregnation method; (b) the incorporation of metal salts into alumina wet gels using a co-precursor method; and (c) the addition of metal nanoparticles directly into a silica aerogel precursor mixture. The methods utilize a hydraulic hot press, which allows for rapid (&#60;6 h) supercritical extraction and results in aerogels of low density (0.10 g/mL) and high surface area (200-800 m2/g). While the work presented here focuses on the use of copper salts and copper nanoparticles, the approach can be implemented using other metal salts and nanoparticles. A protocol for testing the three-way catalytic ability of these aerogels for automotive pollution mitigation is also presented. This technique uses custom-built equipment, the Union Catalytic Testbed (UCAT), in which a simulated exhaust mixture is passed over an aerogel sample at a controlled temperature and flow rate. The system is capable of measuring the ability of the catalytic aerogels, under both oxidizing and reducing conditions, to convert CO, NO and unburned hydrocarbons (HCs) to less harmful species (CO2, H2O and N2). Example catalytic results are presented for the aerogels described.

Here we present protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms. Methods for preparing materials using copper salts and copper-containing nanoparticles are featured. Catalytic testing protocols demonstrate the effectiveness of these aerogels for three-way catalysis applications.

急速な超臨界抽出法によって作製した触媒のエアロゲルの作製と試験

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three ...

Separation of Aldehydes and Reactive Ketones from Mixtures Using a Bisulfite Extraction Protocol

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer by generating a charged structure provides an opportunity to use extraction as a simple purification technique. By combining the use of a miscible organic solvent with saturated sodium bisulfite, aldehydes and reactive ketones can be successfully transformed into charged bisulfite adducts that can then be separated from other organic components of a mixture by the introduction of an immiscible organic layer. Here, we describe a simple protocol for the removal of aldehydes, including sterically-hindered neopentyl aldehydes and some ketones, from chemical mixtures. Ketones can be separated if they are sterically unhindered cyclic or methyl ketones. For aliphatic aldehydes and ketones, dimethylformamide is used as the miscible solvent to improve removal rates. The bisulfite addition reaction can be reversed by basification of the aqueous layer, allowing for the re-isolation of the reactive carbonyl component of a mixture.

Here, we present a protocol to remove aldehydes and reactive ketones from mixtures by a liquid-liquid extraction protocol directly with saturated sodium bisulfite in a miscible solvent. This combined protocol is rapid and facile to perform. The aldehyde or ketone can be re-isolated by the basification of the aqueous layer.

アルデヒドおよびケトン類の反応性の重亜硫酸塩の抽出のプロトコルを使用して混合物からの分離

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer ...

蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単​​かつ迅速なプロトコル

蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単かつ迅速なプロトコル