The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J. 
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.

楽器、基質、文化メディアと皿の調製<ol><li>窒化ケイ素（のSi 3 N 4）は、Windowsの取扱い。 <ol><li>もう一方の手でカプセルのもう一方の端を回転させながら、少しウィンドウ自体を圧迫しないような方法でウィンドウを含む一方の端を絞ることによってカプセルを開きます。 </li><li>逆のペアを確認して、実体顕微鏡下での先の細いピンセットは先端の接着剤、隙間や曲がりがないことを確認します。そうでない場合は、Windowsは、ピンセットにより破損またはその後の工程中にそれらの飛散することもできる。 </li><li>ウィンドウの端が出てくる必要がある広いカプセルになるように優しく方向に開放端加圧付近でカプセルを圧迫しながら、慎重にピンセットでウィンドウの枠をつかんでカプセルからウィンドウを削除します。 </li></ol></li><li>窓プレウォッシュ（オプション）。 <ol><li>穏やかにそれらを浸漬することにより、予備洗浄ウィンドウを所望の場合70％エタノール中で2分間洗浄し、100％エタノール中で2分間洗浄し、続いて5秒間蒸留水に。 </li></ol></li><li>貼り付けと培養皿上のウィンドウを殺菌する。 <ol><li>ウィンドウを固定するためには、培養皿の底の平らな面を上にしてウィンドウを設定、清浄なガラススライド上にテープ片を置く。テープの長辺下4インチのストリップをオフ約カット。きれいなかみそりの刃で（「3/4」⅛で）の短辺からテープのスライスを取る。 </li><li>グリッドまたはウィンドウの端にテープのスライスを適用するためにピンセットを使用してください。しっかりと窓の開口部自体を覆うことなく、それを接着するために十分なを使用してください。ピンセットで接着テープの操作、培養皿の底にダウンウィンドウを設定。しっかりと培養皿の底にテープを接着するためにピンセットの先端を使用してください。 </li><li>他のエッジに別のテープストリップを適用し、ピンセットの先でしっかりと底にこれを付着する。 </li><li>一旦全ての窓があるテープ、紫外線（UV）照射で培養皿でWindowsを殺菌する。約1時間、層流フード内でUVランプ下で皿を置くことによってこれを達成する。 </li><li> Windowsはポリ - リジンでプレコーティングする場合（オプション）、ウィンドウ·滅菌後そう。 37℃のインキュベーター中で1時間のための無菌0.01％ポリ-L-リジン溶液10μlとコートのウィンドウをした後、培養培地に残った溶液を洗い流してください。 </li></ol></li><li> XFMの前に最後の洗浄のためにバッファを準備します。 <ol><li>トリスグルコースまたはピペラジンNのいずれかを準備し、N &#39; -ビス（エタンスルホン酸）（PIPES）、カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）のオスモル濃度およびpH同等の任意の微量金属を含まない緩衝液-スクロース。細胞は化学的に固定された後、細胞をリンスし、これらのバッファのいずれかを使用します。 <ol><li>トリスグルコース溶液（10 mMトリス、260 mMグルコース、9 mMの酢酸、）を作るためには、トリス塩基の36 mgのグルコースを1.4g追加超純水20mlに酢酸16μlの。その後、超純水で30ミリリットルに、最終的な音量を調整します。 pH調整は必要ありません。 1週間まで室温で保管してください。 </li><li>作るPIPES、スクロース（20mMのPIPES、200mMのスクロース）を超純水20mlにPIPES 0.18gのスクロースと2.0gを追加し、濃酢酸少量のpHを7.4に調整する。その後、超純水で30ミリリットルに、最終的な音量を調整します。 1週間まで室温で保管してください。 注：最終すすぎにPBSを使用しないようにする理由は、PBS中のリン酸塩、塩化物、カリウムの濃度は、それが完全に空気乾燥する前に除去されていない場合、それはXFMを妨害できるように高いことである。 </li></ol></li></ol></li><li>細胞プレーティングのためのバッファを準備します。 <ol><li>準備または正常O接着細胞を継代するために行われるであろうように、特定の付着細胞株の必要に応じて、そのようなRPMI培地1640などのすべてのメディアを、1×トリプシン-EDTA溶液、D-PBS、および任意の他の試薬を取り出すFの関心、そして37℃にそれらを温める。 </li></ol></li></ol>細胞の2.メッキ<ol><li>窓を含む滅菌した培養皿に、層流フード中で、穏やかな角度で傾け、それに培養皿の側面に沿って、メディア（100mm培養ディッシュ10 ml）を加える。不要な表面張力を作成または窒化ケイ素の窓の表面に直接メディアを落とさない。メディアが追加されると、徐々に被覆する傾斜角を媒体とグリッドウィンドウを和らげる。 </li><li>細胞株を継代するためにいつものように、プレートのオフの細胞をトリプシン処理または掻き、適切に関心の付着性細胞株を準備します。新鮮なプレートに細胞を適用する前に必要なすべての細胞計数、または他の準備を行います。 </li><li>典型的には24〜72時間以内に50％〜70％のコンフルエンスに到達するために必要とされる細胞密度で窓付きの培養皿に細胞を追加し、5％二酸化炭素を含む加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートする。 </LI&gt; <li>所望の細胞密度（通常50％〜70％の集密度）が達成されるまで、倒立光学顕微鏡を使用して、時折、細胞の成長を観察する。 </li></ol>細胞の3。固定<ol><li> （サンプルに過剰のナトリウムを加えることを避けるために）購入した株式（例えば25％のパラホルムアルデヒド）を希釈し、酢酸でpHを7.4に調整することにより、D-PBS中で新鮮な4％パラホルムアルデヒドを準備します。 </li><li>細胞は、必要に応じて成長してきた、と（例えばヘキストなどの）重要な汚れが適用され、画像化されてきた、片手で45°の角度でディッシュを傾け、穏やかな吸引によってメディアを削除し、他のと手のピペットで吸引した場合。 注：代わりにペッティング過ごしたメディアの、代替案は、ウィンドウを拾う二回D-PBSでマイクロ遠心チューブにウィンドウを浸した後、PBS洗浄の2回に続いて20分間固定液ソリューションを新しい培養容器にそれを置くことです残留固定剤を除去することができる。これを選択すると、ディレクトリを移動ectly 3.5に移行する。 </li><li> D-PBSで優しく料理をすすぎ、皿の側に、45°の角度でピペット操作を一品を押しながら静かに新鮮な4％PFA / PBSを追加し、ゆっくりとできるように、傾斜角度を緩和することにより、すぐに除去された液体を交換固定液は、Windowsをカバーする。室温で20分間固定液で覆われた細胞を保管してください。 </li><li>少し料理を傾け、手で吸引、上記のように、再び、穏やかな吸引によって液体を除去します。 </li><li>優しくステップ3.3で説明した傾斜とピペット操作方法を使用して、パイプ/スクロース溶液の一部を追加することにより除去された液体を交換してください。 </li><li>繰り返します3.4と3.5を繰り返します。 </li><li>乾燥のための材料を準備します。 <ol><li>そのようなキムワイプなどの糸くずの出ないタオルを収集し、それは非常に迅速かつ簡単に便利ですので、箱から1を引く。 </li><li>乾燥するためにウィンドウを設定するには、きれいな、非レベルの場所を準備します。そうリッジを持つ電子顕微鏡に使用する種類のゴム製のグリッドマットを設定しますそれが乾燥しながら、ウィンドウは、一方の端部に支えことができる。これは、乾燥などの乾燥表面に立ち往生からウィンドウを維持し、サンプルの縁に残っているバッファを排出します。 </li></ol></li><li>慎重に液体の外にウィンドウを保持するためのウィンドウに接続されているテープをピンセットで抜く。彼らが浮遊し、その後、逆ピンセットでそれらを拾ってもらうことPIPES /スクロースの少量を適用することにより、テープの外れのウィンドウを取得します。 </li><li>慎重に（ウィンドウ自体に触れることなく）、徹底的にキムワイプでウィンドウの端から余分なパイプ/ショ糖を塗りつける。また、キムワイプの丸い倍を使用して戻ってインデント領域を​​塗りつける。 注：目標は、できるだけ窓の表面上の塩または緩衝剤のような小さな結晶を有することである。 </li><li>グリッドマットの上にウィンドウを配置します。ウィンドウがグリッドマットの上に平らに横たわったが、端に立てかけ（グリッドマットのリッジを使用して）、グリッドのわずかに触れていないことを確認してくださいできるだけマット。ウィンドウを乾燥してみましょう。 </li></ol> 4.サンプル取付け·イメージング<ol><li>サンプルが乾燥した後、光学顕微鏡を使用したWindowsでの細胞の存在を確認します。シンクロトロンへの輸送のためのサンプルを準備する前に、この検証を行います。 </li><li>あなたの実験をホストしているシンクロトロンビームラインへの輸送のための窓をパッケージ化します。優しくその後、スライドガラスに両面テープを使用してWindowsを貼付プラスチックシャーレの底にテープでスライドガラスを貼付。ペトリ皿を閉じてテープで固定します。 注：以前は、この時点まで、これらのステップは、任意の標準的な実験室で行うことができる。次の手順は、最高の放射光ビームラインで行われます。 </li><li>ピンセットでそっと窓からテープを外します。シンクロトロンでのビームラインの協力者が提供するアルミホルダーにWindowsを保護するために、ウィンドウの端に沿って薄い均一なコーティングで、マニキュアを使用してください。 </li><li>にアルミニウムホルダーを挿入しますキネマティックマウントした後、X線顕微鏡の位置にそれを配置します。ビームラインでの試料室の内部で、電動ステージに接続するブラケットのサンプルをマウントします。 </li><li>サンプルのX線顕微鏡計器エリア（鉛満たされた壁で作られておりません）を出た後、セットアップスキャン。ビデオ十字線とを備えたカメラを用いて試料上のX線ビームの位置を確認しながら、スキャンするサンプルの適切な領域を選択し、ビームライン固有のソフトウェアを使用して、プリアライメント下流シンチレータカメラで。 </li><li>興味のある最小の特徴の大きさの推定値に基づいて、試料のための適切な解決を、選択してください。シングル、哺乳動物細胞（サイズは〜20〜40μm）を画像化するための、0.25〜0.5ミクロンの解像度を使用。組織の領域を画像化し、相互に細胞層を区別するために、2~20ミクロンの解像度を使用する。 </li><li>満たさの量の推定値に基づいて、試料の適切な滞留時間を選択する存在する目的のアル。簡単な概要スキャンのために、または金属の高い量が存在する場合、ピクセルあたり30〜300ミリ秒の滞留時間でフライスキャンを使用。少ない材料が存在する場合、または、低い相対的存在の金属を測定するピクセルあたり1〜2秒の滞留時間でステップスキャンを使用します。 </li><li>ビームライン固有のソフトウェアにスキャンをするプログラム。ラスタスキャン画像を取得する。各要素の特性エネルギーのピークを同定するソフトウェアを使用してデータを分析するためにビームラインの協力者と一緒に作業します。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

X線蛍光イメージングは、地球科学、材料科学、化学、生物学26-34を含む多くの分野において有用である。シンクロトロンX線の進歩、およびそれらの焦点は、非常に高強度のビームを生成した。フォーカスX線は、現在利用可能なシリコンドリフト検出器技術を用いて測定可能な信号を生成する、現在存在する細胞における内因性金属を励起するのに十分なビーム。そして細胞中の金?...

X線蛍光イメージングは​​、空間的に分解されるサンプル中に存在する元素の同一性および量の両方を可能にする。 、関心の重い元素の電子の結合エネルギーよりも大きいこと核1内殻電子の結合エネルギーを克服するために選択されたエネルギーの入射X線、。これは電子殻の「穴」を作成します。高エネルギー電子は、これらの孔に落下するように、蛍光X線は波長がそれらの軌道のエネルギー間隔に依存して放出される。軌道のエネルギー間隔は、与えられた要素の特性であるので、X線蛍光放射は、要素に依存する特徴的な波長を有する。これは、存在する元素の同定を可能にする特性波長におけるこの放出である。蛍光強度の較正要素の定量が存在することができます。 X線蛍光microscopY（XFM）は、フランスの日本におけるSPring-8のもの、欧州の放射線シンクロトロン施設（ESRF）のように、部分的に非常に鮮やかなX線シンクロトロン源の開発に、ますます利用になり、光量子ソース（い米国2でAPS）。これらのソースは、非常に高強度のX線ビームを提供する。同時に、このようなゾーンプレート技術としてX線光学系の改善は、かなり非効率的ではあるが3、サブミクロンのスポットにこれらのビームの集束を可能にした。非常に高強度のビームを、焦点を合わせることができる光の比較的少量が、現在利用可能な検出器技術を用いて測定することができる信号を生成する、細胞中の内因性金属を励起するのに十分である。このように、セル内の金属の化学生物学を研究することは、この技術の4-10における最近の進展の多くを利用し、特に1のアプリケーションです。 アプリながら検討すべき多くの重要な要因があります培養哺乳動物細胞または他の生物学的サンプルの元素分布と定量化を調査するXFMに横たわっ。まず、サンプルは有意義であると測定するために、構造的にも、その元素組成については、そのまま保持される必要がある。それは、集束X線ビームによって引き起こされる可能性が放射線損傷に丈夫であるように第二のサンプルはまた、いくつかの方法で保存されなければならない。サンプルを一度にこれらの基準の両方を満たすことができる一つの方法は、急速にガラス質、アモルファス氷11,12に凍結されるべきである。急速凍結は、多くの場合、プランジ凍結または13-16の凍結高圧のような種々の凍結保存技術を介して達成される。これは、一般的に凍結保存が可能な限り天然の状態に近い生体試料中の全体的な細胞構造や化学組成を保持することが認められている。 Wなどの細胞や組織への固定剤のゆっくりと選択的な浸透に起因する一方、化学的固定、膜透過性のその後の変化などのエル、従って17-19次善のこれらの要素の調査をレンダリングする、紛失したり、再配置、例えば、Cl、CaおよびKとして特に拡散イオンを浸出させるための種々の細胞のイオンを可能にすることができる。特に接着性の哺乳動物細胞のための一般的な化学固定、オーバークライオ固定の明らかな利点にもかかわらず、凍結保存は、様々な制限20-23を持っています。最も明らかな1ではなく、すべての研究室は、凍結保存機器に簡単にアクセスを持っていることである。現在のほとんどの高圧冷凍庫、あるいは冷凍庫を急落は、高価なだけ遠くに細胞が培養される場所からのものであってもよいクライオ施設のサブセットによって所有されている。凍結保存の利点は、細胞上に置か走行ストレスの欠点のために取引されている可能性があります。凍結保存は確実に蛍光X線分析用のサンプルを保存するための最も厳格な方法ですがこのように、それは確かに、すべての状況下で、すべての研究者に最もアクセスすることはできません。またそれは常に重要である - 興味のある金属がしっかりと固定可能な巨大分子に結合して、サンプルが画像化される解像度は、乾燥時に発生する可能性がある超微細構造へのダメージよりも大きいしている場合。警告24留意、化学固定、乾燥は、適切な選択である。 成功したX線蛍光イメージング実験における他の要因は、適切な分析を含む。 X線蛍光画像化は、基本的に空間分解能を提供するために、ラスタースキャンと組み合わせたX線蛍光発光分光法である。収集されたX線蛍光発光スペクトルは、発光ピーク、背景、及び入射ビームの弾性および非弾性散乱ピークの重複の組み合わせを含む。これらの貢献のデコンボリューション、及び発光ピークのフィッティングを可能にするソフトウェアは、このフィールド25に重大な開発であった。また、開発および商業DIST物質量に対する蛍光強度を相対的に較正するために使用される既知の組成の薄膜規格ributionも非常に重要であった。 このプロトコルは、化学固定し、空気乾燥による接着細胞の準備について説明します。このプロセスにおける重要なステップは、多くの場合、成功への特定のファッションのキーに優しいリンスを作り、うまく接着しないシリコン窒化窓に細胞の成長である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">silicon nitride windows</td>
			<td style="width:423px;">Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom</td>
			<td style="width:119px;">No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.&#160; Thickness 500 nm.&#160; Frame size: 5 mm x 5 mm.&#160; Frame thickness: 200 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">reverse tweezers</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">78520-5X</td>
			<td style="width:167px;">EMS 5X, NC &#8211; Ultra Fine Tweezers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">rubber grid mat</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">71170</td>
			<td style="width:167px;">Round Grid Mat</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">acetic acid</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">338826</td>
			<td style="width:167px;">trace metals grade concentrated acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PIPES buffer</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:167px;">solid PIPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">formaldehyde stock solution</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">RT 17113</td>
			<td style="width:167px;">10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

生物学的サンプルについての情報を提供するために、X線蛍光イメージングの能力は、これらのサンプルは、それらが実験の時間スケールでの放射線障害に対してロバストであるように準備され次第であり、しかもそれらの化学的および構造的特徴は周知である保存。固定は、細胞のこれらの側面に（ 図1）に保存されていることを示す-上述のように調製し、撮像されたサンプル?...

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

化学固定することによりX線蛍光イメージングのための接着細胞の準備

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

preparing-adherent-cells-for-x-ray-fluorescence-imaging-chemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.3K ビュー.  Argonne National Laboratory. Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays. 

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A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単​​かつ迅速なプロトコル

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

化学

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

保存科学における粉末X線回折：遺産アートオブジェクトに対する腐食製品のルーチンの結晶構造の決意に向けて

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical composition and elemental distribution within a material. Synchrotron-based XRF has become an integral characterization technique for a variety of research topics, particularly due to its non-destructive nature and its high sensitivity. Today, synchrotrons can acquire fluorescence data at spatial resolutions well below a micron, allowing for the evaluation of compositional variations at the nanoscale. Through proper quantification, it is then possible to obtain an in-depth, high-resolution understanding of elemental segregation, stoichiometric relationships, and clustering behavior.
This article explains how to use the MAPS fitting software developed by Argonne National Laboratory for the quantification of full 2-D XRF maps. We use as an example results from a Cu(In,Ga)Se2 solar cell, taken at the Advanced Photon Source beamline 2-ID-D at Argonne National Laboratory. We show the standard procedure for fitting raw data, demonstrate how to evaluate the quality of a fit and present the typical outputs generated by the program. In addition, we discuss in this manuscript certain software limitations and offer suggestions for how to further correct the data to be numerically accurate and representative of spatially resolved, elemental concentrations.

Here, we demonstrate the use of the X-ray fluorescence fitting software, MAPS, created by Argonne National Laboratory for the quantification of fluorescence microscopy data. The quantified data that results is useful for understanding the elemental distribution and stoichiometric ratios within a sample of interest.

X 線蛍光データ マップを使用しての定量化

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The devices are patterned from epoxy glue using soft lithography and are suitable for in situ X-ray diffraction experiments at room temperature. The sample wells are lidded on both sides with polymeric polyimide foil windows that allow diffraction data collection with low X-ray background. This fabrication method is undemanding and inexpensive. After the sourcing of a SU-8 master wafer, all fabrication can be completed outside of a cleanroom in a typical research lab environment. The chip design and fabrication protocol utilize capillary valving to microfluidically split an aqueous reaction into defined nanoliter sized droplets. This loading mechanism avoids the sample loss from channel dead-volume and can easily be performed manually without using pumps or other equipment for fluid actuation. We describe how isolated nanoliter sized drops of protein solution can be monitored in situ by dynamic light scattering to control protein crystal nucleation and growth. After suitable crystals are grown, complete X-ray diffraction datasets can be collected using goniometer based in situ fixed target serial X-ray crystallography at room temperature. The protocol provides custom scripts to process diffraction datasets using a suite of software tools to solve and refine the protein crystal structure. This approach avoids the artefacts possibly induced during cryo-preservation or manual crystal handling in conventional crystallography experiments. We present and compare three protein structures that were solved using small crystals with dimensions of approximately 10-20 &#181;m grown in chip. By crystallizing and diffracting in situ, handling and hence mechanical disturbances of fragile crystals is minimized. The protocol details how to fabricate a custom X-ray transparent microfluidic chip suitable for in situ serial crystallography. As almost every crystal can be used for diffraction data collection, these microfluidic chips are a very efficient crystal delivery method.

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes in detail how to fabricate and operate microfluidic devices for X-ray diffraction data collection at room temperature. Additionally, it describes how to monitor protein crystallization by dynamic light scattering and how to process and analyze obtained diffraction data.

シリアル結晶の結晶 x 線回折その場その場での動的光散乱のためのマイクロ流体チップ

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for the purpose of biophysical characterization, and measure substrate transfer between periplasmic and cytoplasmic compartments. By carefully limiting the time that the periplasm is separated from the cytoplasm, the experimenter can extract the protein of interest and assay each compartment individually for substrate without carry-over contamination between compartments. The extracted protein from fractionation can then be further analyzed for three-dimensional structure determination or substrate-binding profiles. Alternatively, this method can be performed after incubation with a radiotracer to determine total percent uptake, as well as distribution of the tracer (and hence metal transport) across different bacterial compartments. Experimentation with a radiotracer can help differentiate between a physiological substrate and artefactual substrate, such as those caused by mismetallation.
X-ray fluorescence can be used to discover the presence or absence of metal incorporation in a sample, as well as measure changes that may occur in metal incorporation as a product of growth conditions, purification conditions, and/or crystallization conditions. X-ray fluorescence also provides a relative measure of abundance for each metal, which can be used to determine the best metal energy absorption peak to use for anomalous X-ray scattering data collection. Radiometal uptake can be used as a method to validate the physiological nature of a substrate detected by X-ray fluorescence, as well as support the discovery of novel substrates.

A protocol for the extraction of a periplasmic transition metal chaperone in the context of its native binding partners, and biophysical characterization of its substrate contents by X-ray fluorescence and radiometal uptake is presented.

グラム陰性の細菌で重要な金属吸収: 蛍光、放射性同位元素、およびセル分別

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid based on volatile solar and wind sources. The pressing demand of developing high-performance electrochemical energy storage solutions, i.e., batteries, relies on both fundamental understanding and practical developments from both the academy and industry. The formidable challenge of developing successful battery technology stems from the different requirements for different energy-storage applications. Energy density, power, stability, safety, and cost parameters all have to be balanced in batteries to meet the requirements of different applications. Therefore, multiple battery technologies based on different materials and mechanisms need to be developed and optimized. Incisive tools that could directly probe the chemical reactions in various battery materials are becoming critical to advance the field beyond its conventional trial-and-error approach. Here, we present detailed protocols for soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS), soft X-ray emission spectroscopy (sXES), and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) experiments, which are inherently elemental-sensitive probes of the transition-metal 3d and anion 2p states in battery compounds. We provide the details on the experimental techniques and demonstrations revealing the key chemical states in battery materials through these soft X-ray spectroscopy techniques.

Here, we present a protocol for typical experiments of soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS) and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) with applications in battery material studies.

軟 x 線吸収分光と共鳴非弾性 x 線散乱による電池の化学元素高感度検出

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. These cell lines, after treatment with ascorbic acid (AA) and &#946;-glycerophosphate (&#946;-GP), undergo complete osteogenic transdifferentiation from proliferation to mineralization and produce matrix vesicles (MVs) that trigger apatite nucleation in the extracellular matrix (ECM).
Based on Alizarin Red-S (AR-S) staining and analysis of the composition of minerals in cell lysates using ultraviolet (UV) light or in vesicles using TEM imaging followed by EDX quantitation and ion mapping, we can infer that osteosarcoma Saos-2 and osteoblastic hFOB 1.19 cells reveal distinct mineralization profiles. Saos-2 cells mineralize more efficiently than hFOB 1.19 cells and produce larger mineral deposits that are not visible under UV light but are similar to hydroxyapatite (HA) in that they have more Ca and F substitutions.
The results obtained using these techniques allow us to conclude that the process of mineralization differs depending on the cell type. We propose that, at the cellular level, the origin and properties of vesicles predetermine the type of minerals.

We present a protocol to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. Their mineralization profiles were analyzed by Alizarin Red-S (AR-S) staining, ultraviolet (UV) light visualization, transmission electron microscopy (TEM) imaging and energy dispersive X-ray microanalysis (EDX).

HFOB 1.19 によって生成される鉱物と Sao 2 セルを使用して透過型電子顕微鏡エネルギー分散型 x 線微小分析での分析

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

リガンドを介した核生成とパラジウムの金属ナノ粒子の成長

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

微結晶の時間分解フェムト秒シリアル結晶学 x 線レーザーのための高粘度押出を改善

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample preparation is a key and often complex procedure, particularly for biological samples. Although X-ray speciation techniques are widely used, no detailed protocol has been yet disseminated for users of the technique. Further, chemical state modification is of concern, and cryo-based techniques are recommended to analyze the biological samples in their near-native hydrated state to provide the maximum preservation of chemical integrity of the cells or tissues. Here, we propose a cellular preparation protocol based on cryo-preserved samples. It is demonstrated in a high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy study of selenium in cancer cells and a study of iron in phytoplankton. This protocol can be used with other biological samples and other X-ray techniques that can be damaged by irradiation.

This protocol presents a detailed procedure to prepare biological cryosamples for synchrotron-based X-ray absorption spectroscopy experiments. We describe all the steps required to optimize sample preparation and cryopreservation with examples of the protocol with cancer and phytoplankton cells. This method provides a universal standard of sample cryo-preparation.

高分解能X線吸収分光法を用いた極低温でのスペシエーションのための生体試料調製

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...