このプロトコルは、例えば創傷治癒や癌転移などの多くの生理学的および病理学的プロセスにおいて細胞力が果たす役割の解明を可能にするので重要である。この力学ベースの技術の主な利点は、同時に細胞と細胞の接合を中断し、細胞生成力、主に牽引力と細胞間ストレッサーへの影響を測定する能力です。私たちのプロトコルは、例えば癌転移、アテローム性動脈硬化症、高血圧などの広範な病態生理学的プロセスに適用可能である。
当社の方法は、臓器オンチップモデル、バイオエンジニアリング組織構築物、インビトロドラッグデリバリーシステム、および組織共培養システムを使用して、生化学的およびバイオメカニカル分析を実行するために統合することができます。私たちのプロトコルは、実行するかなり簡単です。しかし、私たちは、このプロトコルを初めて行う人は忍耐を持ち、このプロトコルのステップを急いでいないことをお勧めします。
私たちのプロトコルには、初めてのユーザーには明らかではないユニークなステップがあります。したがって、ユーザーは、私たちの書面によるステップバイステップの手順に従い、目視デモンストレーションをガイダンスとして使用することをお勧めします。まず、200ミリリットルの超純水と80マイクロリットルの酢酸と50マイクロリットルのシランメタクリレートを混合して、ブラインドシラン溶液を調製します。
ビンスシラン溶液を攪拌プレートで少なくとも1時間撹拌します。ペトリ皿の中央をよく、バインドシラン溶液で45分間処理します。バインドシラン溶液を取り除き、ペトリ皿を超純水で2~3回洗い流します。
ペトリ皿表面を乾かして、将来の使用のために室温で保管してください。ヒドロゲル溶液を調製するには、12.49ミリリットルの超純水を2.062ミリリットルの40%アクリルアミド、375マイクロリットルの2%ビサクリアミドを15ミリリットルの遠心チューブに混ぜます。80マイクロリットルの蛍光ビーズをヒドロゲル溶液に加えます。
チューブを軽く振って、ビーズとゲル溶液を混ぜます。キャップを遠心管に緩めておき、真空チャンバーに入れます。ゲル溶液を真空チャンバ内で少なくとも45分間脱ガスする。
ヒドロゲルを重合するには、まず10%の過硫酸アンモニウムの75マイクロリットルを加え、次に8マイクロリットルのTEMEDをヒドロゲル溶液に加えます。ペトリ皿の中央にヒドロゲル溶液の24マイクロリットルを置きます。18ミリメートルのカバースリップでヒドロゲルを押してヒドロゲルを平らにし、約100マイクロメートルの高さを作ります。
ゲル重合のために少なくとも30〜40分待ちます。ゲル脱水を防止するために、超純水に重合ヒドロゲルを沈下します。ペトリ皿にアルミホイルを覆い、蛍光ビーズの光の吹き出しを防ぎ、摂氏4度で保存します。
まず、50ミリリットルの遠心管に20対1の比率で、PDMSシリコーンベースをシリコーン硬化剤と混合します。チューブを逆さまに反転し、PDMS溶液の適切な混合を確実にするために何度も激しく振ります。PDMS溶液中の気泡を190回G.Pourで1分間1分間遠心して取り除き、PDMS溶液を100ミリメートルペトリ皿の中央に5~6ミリリットル流し、PDMS溶液がペトリ皿表面全体を覆うまで攪拌します。
PDMS溶液を摂氏50~60度で一晩硬化させます。次に、穴パンチャー付きの直径16ミリメートルの円形PDMSステンシルを取り外します。PDMS ステンシルに小さな穴を作成するには、直径 1.25 ミリメートルの生検パンチを使用します。
PDMSステンシルを70%エタノールに2〜3分間浸し、余分なエタノールを吸い取り、5分間UV光の下に置いて殺菌します。余分な液体を吸引し、ヒドロゲルからカバースリップを取り除きます。PDMS ステンシルをハイドロゲル表面に配置し、ピンセットを使用して PDMS ステンシルに光圧を適用し、PDMS ステンシルとハイドロゲル表面の間に水密シールを確保します。
ハイドロゲルの表面を、1~1,000の濃度で0.1モルHEPESバッファー溶液に溶解し、8分間36ワットの電力を持つUVランプの下にヒドロゲルを置きます。余分なスルフォ-SAMPAとHEPES溶液を吸引し、ヒドロゲルを0.1モルHEPESで2回リンスし、続いて超純水でさらに2リンスを加えます。余分な超純水を吸引し、200マイクロリットルのピペットを使用して、コラーゲン-1の1ミリリットル当たり0.1ミリグラムでヒドロゲルをコーティングします。
蛍光ビーズを光漂白から保護するために皿を覆い、ハイドロゲルを摂氏4度で一晩保管します。次に、フラスコに1Xトリプシンを3ミリリットル加え、37°Cのインキュベーターに3〜5分間置き、組織培養フラスコから細胞を取り外します。トリプシン化後、フラスコに3ミリリットルの細胞培養培地を加え、渦巻いて混合し、混合物を15ミリリットルの遠心分離管に移します。
細胞溶液を1、710倍のG.吸上術で3分間遠心し、培地中の細胞を1ミリリットル当たり4個の細胞に50倍の濃度に再懸濁する。冷蔵庫からヒドロゲル皿を取り出します。コラーゲン-1をヒドロゲルから取り出し、PBSで1回リンスします。
PDMSステンシルの上部に3番目のセルに75倍の10を加え、37°Cと5%の二酸化炭素でインキュベーターで少なくとも1時間ヒドロゲル表面に細胞を取り付けることができます。PDMS ステンシルを削除し、10X トリプシンの PDMS ステンシルを 10 ~ 15 秒間水没させ、接続されているセルを削除します。ペトリ皿に少なくとも2ミリリットルの培地を加え、70%エタノールを噴霧してステンシルを殺菌し、UV光の下に5分間置きます。
ペトリ皿をインキュベーターに少なくとも36時間置くか、またはコンフルエント単層が観察されるまで置く。カルコン処理の30分前及びカルコン処理の2時間後の位相コントラスト画像を比較した。細胞誘導ビーズ変位は、コントロールHUVEC単層と比較した場合、低用量カルコンおよび高用量カルコン条件の両方で減少することが観察された。
カルコン処理の前に、RMSの牽引は、すべての条件のための約51パスカルでした。カルコン処理後、低用量カルコン処理単層では59パスカルへのRMSトラクションがわずかな増加し、制御と比較して高用量カルコン処理単層では18パスカルにRMSトラクションがほぼ2倍減少した。カルコン治療は、低用量で平均正常な正常な細胞間ストレスの大きさを増加させたが、対照と比較して高用量で平均正常な細胞間ストレスの大きさを有意に減少させた。
カルコン治療はまた、コントロールと比較して低および高カルコン濃度の両方で最大の完全な細胞間ストレスを減少させる。カルコン処理の影響は、T検定と単因子ANOVA試験の両方に基づいて統計的に有意です。PDMS ステンシルをゲルの上に置きながら、ゲルが十分に乾燥して PDMS ステンシルとゲルの間に水密シールが付くようにしてください。
このプロトコルは、細胞-細胞接合、細胞骨格タンパク質、細胞マトリックス接着分子、または細胞外分子の生体力学的寄与を生画像化でプローブするためにも適用することができる。このin vitroプロトコルを使用すると、研究者は、動物モデルのない組織修復、創傷治癒、または癌転移中の生化学的特性だけでなく、生体機械のホストを調査することに成功しました。これらの薬物の吸入は有害であると報告されているので、我々は、我々は、カルコンとDMSOを扱っている間、非常に注意するように視聴者に助言します。
