The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.

注：すべての動物の手順は承認され、医学施設内動物管理使用委員会（IACUC）のテルアビブ大学サックラー学校の基準に準拠して実施した。 1.馴化培地調製<ol><li>シード2×10 8の体積が10cm培養皿6 U-87 MG細胞に加え、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン/ナイスタチン溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）。 </li><li> 37で細胞を培養する C°、 48時間で完全フルエンシーを達成するまで、5％のCO 2。 </li><li> 10ミリリットル注射器を用いて、プレートからすべてのメディアを撤回し、15ミリリットルチューブに0.45μmのフィルターでろ過する。 </li><li>細胞プレートを洗浄せずに1mlのトリプシン溶液（0.25％）を添加し、インキュベートする。 </li><li>すべての細胞が剥離されると、10％FBSを補充した、少なくとも5ミリリットルDMEMを使用してトリプシンを不活性化し、細胞数をリフォーム。 </li><li<html> &gt;血球計または他の細胞計数装置を用いて細胞数をカウントし、使用計数法による細胞の数を計算する。 注：これは、CMの濃度を正規化するために後で使用される。 </li><li>ガラス丸底フラスコにCMを移し、高真空ロータリーエバポレーター下で濃縮する。必要に応じてプロセスを促進するために、37℃までの浴温度を上昇させる。 CMはペースト状のテクスチャーを達成するまで続けます。 </li><li> 400μlの生理食塩水に各培養プレートからCMを懸濁します。複数のプレートを使用する場合は、同等のボリュームを使用。たとえば、2培養プレートのために、800μlのを使用しています。 4匹のマウスのために、各プレートを使用。 </li><li>異なる細胞株または治療を比較するために、ステップ1.6において、受信したセルの比率に応じて音量を調整する。一方のプレートは、1.5倍以上のセルが含まれている場合は、既存の400μlに生理食塩水を200μlを追加します。これが調整され、CMになります</li></ol>マウスにタイトル &quot;&gt; 2。ECM-模倣ジェルプラグ接種<ol><li>マウスにECM-模倣ゲルを接種する前に、以下の材料を準備します。 <ol><li>成長因子は、（氷上で4℃で、実験の前日、一晩解凍）フェノールフリーECM-模倣ゲルを減少させた。 </li><li>電気シェーバー。 </li><li>マウスを麻酔するために、ケタミンとキシラジン。 </li><li>氷のように冷たい千μlの滅菌チップ。 </li><li>氷のように冷たい1ミリリットルの注射器と27 G針。 </li></ol></li><li>各マウスについて80μlの調整されたCMを含む1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブを準備し、氷上に保つ。 </li><li>各チューブに、氷の上で、4℃で一晩解凍したフェノールフリーECM-模倣ゲルを減少させた600μlの氷冷成長因子を追加します。 ECM模倣ゲルを4℃で液体であり、体温で固化する。固化からECM-模倣ゲルを防ぐために、氷冷千μlのヒントを使用しています。慎重に気泡を形成することなく、チューブを混合し、氷上に保つ。 </li><li> 6週齢のBを麻酔ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（12 mg / kgを）を使用して、ALB / cマウス。実験前を開始する制度的動物のケアと使用委員会、 すなわちに応じた適切な麻酔を確認してください。彼らはもはやしっかりとつま先のピンチに反応しないときに動物は麻酔のそれらの適切な面に達している。 </li><li>マウスの腹部を剃ると手術スクラブ/アルコールを使用して消毒する。 </li><li>エッペンドルフチュー​​ブ皮下の内容を注入するためにコールド1mlシリンジおよび27Gのニードルを使用する。気泡の形成を防止するために、非常にゆっくりと注入を行う。すべてのボリュームが投与されると凝固が発生するまで、数分間針を吐出しない。 </li></ol>超音波を用いてECM-模倣ゲルプラグ血管新生の3。評価注：プロトコルのこの部分は、以前の超音波撮像システムを動作させる知識、または許可された技術者の援助を必要とする。 <ol><li>開始する前に、Fを持って準備材料や楽器をollowing： <ol><li>電気シェーバー。 </li><li>脱毛クリーム。 </li><li>マウスを麻酔するために、ケタミンとキシラジン。 </li><li>非標的マイクロバブル。 </li><li>活性化装置。 </li><li> 55 MHzの708プローブと3D取得マイクロマニピュレーターを含む米国のイメージングシステム。 </li></ol></li><li>プラグは接種後3週間以内に血管新生を測定します。 NOTE：U-87 MGベース動物モデルにおいて、3週間、撮像のための理想的な時間点を表すことが分かった。異なる設定の下では、プラグの接種後数日から始まる血管新生動態を校正。 <ol><li>ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（12 mg / kgを）を使用してマウスを麻酔。実験前を開始する制度的動物のケアと使用委員会、 すなわちに応じた適切な麻酔を確認してください。彼らはもはやしっかりとつま先のピンチに反応しないときに動物は麻酔のそれらの適切な面に達している。 </li><li>剃るマウスの腹部領域とは、脱毛クリームで処理。 </li><li>マイクロマニピュレータのステージ上で仰向けマウスを修正。 </li><li>生理食塩水と30 Gの針を含む1mlの注射器を使用して、尾静脈の中に針を置き、しっかりと針を固定し、注射器を緩めます。 </li><li>コントラスト3Dモード画像取得セッションのために設定する： <ol><li> 3Dモータステージを初期化し、所望の走査領域の中央にトランスデューサを配置するプレス「3D」。 </li><li>を押し「3D」と入力スキャン距離とステップサイズは、その後「スキャン」を押してください。 </li><li>全体プラグが表示された3D画像データに走査されたことを確認してください。しない場合は全体プラグはスキャン繰り返しステップ3.5.2で表示されるように、トランスデューサを調整します。 </li><li>を押し、「コントラスト」と時間をプッシュ利得補償（TGC）は、画像を暗くするために左に制御します。 </li></ol></li><li>指名打者であるバイアルミキサーを使用して、マイクロバブルをアクティブに45秒間のマイクロバブルの活性化のためにgnated。 </li><li> 1ミリリットルを50μlの生理食塩水でマイクロバブルを50μl注射器に混ぜる。 </li><li>活性化したマイクロバブルを含むシリンジに生理食塩含有緩めた注射器を交換してください。 3D取得モータを用い、定常状態に達し、その後、プラグの3次元造影シネループを取得するために、気泡のために数秒待ってから、マウスの尾静脈に希釈されたマイクロバブルを注入する。 <ol><li>を押し「3D」とは、3次元造影画像を取得した後、画像データを保存するために「シネストア」を押して「スキャン」を選択します。 </li><li>を押し「3D」とマイクロバブルを破壊するために &quot;破壊3D」をクリックします。 </li><li>を押し「3D」再びと「シネストア」を押し、ポスト破壊のシネ·ループを取得するために「スキャン」を選択します。 </li></ol></li><li>前とマイクロバブルの後の破壊オーバーレイ画像フレームを生成します。 <ol><li> ＆で＃8220;参照設定」参照を作成」画面の左側には、クリックして &quot;。 </li><li>プレス「検査管理は、「取得し、事前破壊シネループを開きます。 </li><li>緑のコントラストオーバーレイを生成するために、「プロセスシネ」をクリックし、「3Dにロードする」をクリックします。 </li></ol></li><li>プラグ内の血液量の結果の3D画像を定量するために、米国のイメージングソフトウェアを使用します。 <ol><li>プレス「スキャン/フリーズ &quot;とし、「モードの​​設定」を押してください。 </li><li> 「ボリューム」をクリックして、「パラレル」を選択します。 </li><li>輪郭の一連のセグメント化することによって、標的組織の3Dボリュームを作成する。 </li><li>セグメンテーションを完了するには「完了」をクリックします。 NOTE：造影剤の体積は、画面の左下に表示される。 </li></ol></li><li>手順の最後に、離れてから暖かい、きれいな、乾燥した、静かな環境でマウスを置く他の動物。齧歯類から12〜14インチ離れて配置された市販の外科加熱パッドや白熱灯（50〜75ワット）を使用して暖かさを提供します。直立姿勢を維持し、正常に歩行するまで継続的にマウスを監視します。 </li></ol></li></ol>繊維質共焦点内視顕微鏡を使用して、4の評価ECM-模倣ゲルプラグ血管系モルフォロジー注：プロトコルのこの部分は、直ちに次のUS画像化を行い、それが繊維質の共焦点内視撮像システム、または認定技術者の援助を操作する前の知識を必要とする。 <ol><li>開始する前に、以下の材料および機器の準備があります。 <ol><li>鉗子、はさみや吸収性縫合糸のような手術ツール。 </li><li> FITC結合デキストラン（70 kDa）の。 </li><li>校正溶液（過酸化水素、水又は蛍光溶液を含む3本のチューブそれぞれ）。 </li><li>撮像システムであり、aメーカーによると、血管のイメージングに適したプローブ。 </li></ol></li><li>ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（12 mg / kgを）を使用してマウスを麻酔。 </li><li> 、尾静脈を介して、10mg / mlのFITC標識デキストラン200μlの静脈内投与。 </li><li>外科スクラブ/アルコールを使用して腹部を消毒し、プラグから約1cmの小切開を適用します。 </li><li>そのままプラグを保ちながら優しくプラグの上に内視顕微鏡プローブを配置します。 </li><li>買収： <ol><li>プローブは、プラグ上に設定されたら、Enterキーを押してフットペダルを使用した「レーザーを開始します」。蛍光は、画面に表示されるべきである。 </li><li>画面上の「録音」を押すことで（30秒まで）ショートムービーを取得またはフットペダルを使用して「選択」。 </li><li>ムービー間、水を含むチューブにチップを置くことによって、プローブを洗う。 </li><li>終了したら、プローブを除去し、綿の先端が先端部を清掃してください。 </li></ol></li><li>分析するには、平均VEのSSEL径： <ol><li>血管検出モジュール]ウィンドウを開き、上部のパネルに「微小血管の検出」アイコンをクリックします。 </li><li> 「環境設定」をクリックして、「目的の統計」と「表示モード」の「ディスプレイヒストグラムバー」の「血管径平均」マーク。 </li><li>選択した測定値を表示するには、「検出」をクリックしてください。 </li></ol></li><li>血管に隣接する領域での蛍光シグナル強度を分析する。 <ol><li>左側のパネルで「円のROIを作成」をクリックして、関心領域の円を作成します。 </li><li>この地域に関連する値を計算するために「ROI内の計算ヒストグラム」をクリックしてください。 </li></ol></li></ol>マウスの5。術後の治療<ol><li>各撮像手順の最後に、離れて他の動物から暖かい、きれいな、乾燥した、静かな環境でマウスを置く。市販-Aを使用して暖かさを提供しますvailable外科加熱パッドや白熱灯（50〜75 W）は、齧歯類から離れに12-14を置いた。直立姿勢を維持し、正常に歩行するまで継続的にマウスを監視します。 </li><li>追加の時点でのプラグ「血管新生のさらなる分析のために、次の回復条件を適用する。 <ol><li>吸収性縫合糸を使用した小切開を縫合。 </li><li>そのような皮下にブプレノルフィン（1 mg / kgを）として、マウスの鎮痛を与え、個々のケージに戻す。 </li><li>さらに鎮痛剤治療が必要であり、毎日の再評価を監視し、苦痛のために評価するかどうかを判断するために、すべての動物を観察します。 </li></ol></li><li>実験のエンドポイントで、最初の頸椎脱臼が続くイソフルランを適用することにより、マウスを安楽死させる。 </li><li>追加の画像は、初期画像化手順以下の数週間で実行される場合は、すべての手順は、可能な限り無菌に保つ必要があります。外科、皮膚のスクラブ実行する必要があり、無菌のWAターおよび滅菌綿チップは内視プローブを洗浄するために使用されるべきであり、プローブは滅菌水を使用して、各動物の間に消毒されるべきである。 </li></ol>

<ol>
	<li>Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+SIKVAV+site+of+laminin+in+promotion+of+angiogenesis+and+tumor+growth:+an+in+vivo+Matrigel+model.">Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model.</a> J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).</li><li>Passaniti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+quantitative+method+for+assessing+angiogenesis+and+antiangiogenic+agents+using+reconstituted+basement+membrane,+heparin,+and+fibroblast+growth+factor.">A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor.</a> Lab Invest. 67, 519-528 (1992).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+assays:+a+critical+overview.">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clin Chem. 49, 32-40 (2003).</li><li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+assessment+of+angiogenesis+in+a+matrigel+model+in+rats.">Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats.</a> Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).</li><li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent.">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent.</a> Manner. 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The authors have nothing to disclose.

補完的なイメージング法を組み合わせることにより、異なる血管新生コンポーネントの微小血管密度、機能性と形態学上の情報の取得を可能にする。 ECM-模倣ゲルプラグ上のローディングCMは、プラグに募集し、浸出された内皮細胞のように、他の細胞集団から分離され、腫瘍の微小環境を生成します。 行うことにより、並行して、造影USイメージングをマイクロバブル?...

マトリゲルプラグ血管形成アッセイは、最初Kibbey らにより記載された。それは、ペプチドSIKVAV（のSer-イルリジンヴァルのAla-ヴァル、1）血管新生刺激を評価するために使用された1992年。他のin vivo血管新生アッセイとは対照的に、マウス角膜血管新生またはニワトリ絨毛尿膜アッセイのように、このアッセイは、2を実行することは比較的容易である。注入されたECM模倣ゲルは細胞が、血管新生促進または抗血管新生化合物および/または因子を含んでいてもよい。抗血管新生化合物の活性を評価する場合、プラグは、通常、血管内皮増殖因子（VEGF）および線維芽細胞増殖因子（FGF）の混合物を含み、抗血管新生物質が、プラグに直接投与または全身3ことができる4。 それは数分以内に固化する場合ECM模倣ゲルを皮下注射する。その結果、プラグの血管のリクルートの評価はtypicallですyは、フルオレセインイソチオシアネートの注射（FITC）以下蛍光シグナル測定により、プラグ内のヘモグロビンレベルを測定することによって行わは、内皮特異的マーカーの組織学的切片の免疫染色により、または蛍光活性化細胞選別（FACS）2,5により、デキストランを標識6。しかし、この評価は、エンドポイント分析を可能にし、血管の機能および形態学に関する情報を欠いている。血液量は、血管の大きさ、血液の停滞プールの程度によって影響されるので、また、血漿量の測定は、ヘモグロビンレベル、または指標としてデキストランFITCのいずれかを使用して、誤解を招くかもしれない。動員、血管系の透過性が向上し、保持（EPR）効果7によって特徴付けられる場合に特に重要である。 我々は、ここで二つの相補的なイメージングモダリティを組み合わせることによって動員、血管の可視化のための新たな、より正確な、方法を提案する。 HIG血管密度は約だけでなく、その形態および機能だけでなく情報を提供することができる生体fibred共焦点内視と組み合わさ時間分解能のマイクロバブルコントラスト増強超音波（US）。さらに、この分析は、それによって血管新生動態のモニタリングを可能にするいくつかの時点で行うことができる。米国は、血管区画8-11に独占的に残っているマイクロバブルの静脈内（IV）注射後の血管の画像化のための高空間分解能を持って広く利用されている画像診断法である。マイクロバブルは、米国のパルスで励起し、良好な造影剤​​として作用するとき、強いエコー源信号を生成するガス充填マイクロバブルである。プラグの3D画像は、マイクロバブルの破壊以下の米国イメージングシステムソフトウェアを使用して取得される。得られた画像は、マイクロバブルの前後の破壊の画像フレームから構成され、色の映像強度の差を反映している。これらのオーバーレイ画像は自動的にソフトウェアによって表示されます。したがって、プラグ内の機能血管の割合を定量することができる。共焦点内視繊維質の高解像度は、血管の形態の報告による補完的なイメージングモダリティとして機能します。この低侵襲性の方法では、画像は、FITC結合デキストラン12の静脈内投与後に取得される。蛍光ポリマーは、血流を染色し、従って、血管の形態及び血流のための「造影剤」として機能する。注入されたポリマーは、70キロダルトンの大きさであるので、腫瘍脈管構造に見られるようにまた、それだけで漏れやすい血管を通過することができる。これは、血管外のFITC標識デキストランの高いバックグラウンドをもたらす。その結果、繊維質の共焦点内視はneovasculature-腫瘍に平滑末端を有する拡大された、漏出、高もつれ血管を、EPR効果の典型的な特徴を視覚化するために使用することができる。 このシステムモデルはdescriたU-87 MGヒト神経膠芽とその休眠クローン13の血管新生能の比較でベッド。プラグ内の血管新生は、3週間ECM-模倣ゲル接種後に評価した。これは、休止中の腫瘍生成細胞からのCMを含むプラグ内の血管新生と比較した場合、U-87 MG急成長している腫瘍生成細胞からのCMを含むプラグ内の血管新生が著しく、数、密度および機能性の面で増加したことが示された。したがって、著者らは、CMがU-87 MG急成長している腫瘍を発生する細胞から単離されたが、休眠腫瘍生成細胞からのCMと比較して、血管新生促進因子のより高いレベルが含まれていると結論することができました。これらの要因は、積極的に、血管新生カスケード（ すなわち 、増殖、発芽、遊走および内皮細胞の管状構造の最後に、形成）のすべてのステップに影響を与えることによって、機能的な血管の形成を刺激する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Company</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Catalog number</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Rotary Vacuum Evaporator</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Growth-factors reduced phenol-free Matrigel</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">BD Bioscience</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">FAL356231</td>
			<td style="width:251px;">Thaw overnight, at 40C on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Depilatory cream&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 US imaging system</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">55 MHz 708 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 imaging software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">VialMix&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VMIX</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">DEFINITY microbubbles</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DE4</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Activate for 45 seconds using Vialmix before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ProFlex MiniO/30 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">70 kD FITC-labeled Dextran</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">46945</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ImageCell software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Calibration Kit</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td align="left" height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td align="left">Gibco Life Tecchnologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td align="left" height="37" style="height:37px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td align="left" height="39" style="height:39px;">Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring functionality and morphology of vasculature recruited by factors secreted by fast-growing tumor-generating cells

マウスの皮下マトリゲルプラグアッセイは、プロ及び抗血管新生因子のインビボ評価のために選択される方法である。この方法では、所望の因子を皮下注射した後、癌の環境を模倣する環境を形成するために固化し、冷液体ECM模倣ゲルに導入される。このマトリックスは、内皮細胞、および血管系の、したがって、形成などの宿主細胞の浸透を可能にする。 本明細書において、我々は、特定の因子（ 例えば、bFGFおよびVEGF）または薬剤とは対照的に、癌細胞によって分泌される因子のプールの血管新生可能性を例示するために利用することができる新たな変更されたマトリゲルプラグアッセイを、提案する。 ECM-模倣ゲルを含むプラグは急速に成長する腫瘍を発生する神経膠芽腫細胞のCMに分泌因子のプールでホスト（ すなわち、マウス）を導入するために利用されている。我々は以前の血管新生能の大規模な比較を記載しているU-87 MG親細胞で誘導される血管新生を示すこのシステムモデルでU-87 MGヒト神経膠芽とその休眠由来のクローン、、。 CMは、48時間のインキュベーション後の細胞株のいずれかのコンフルエントな組織培養プレートから収集媒体を濾過することによって調製される。それゆえ、細胞自体ない細胞によって分泌因子のみを含有する。ここで説明する二つのイメージングモダリティの組み合わせである、プラグ内の新たに形成された血管の大きさ、形態及び機能の正確なリアルタイムの特性解析のために、造影超音波イメージングと生体繊維質共焦点内視をマイクロバブル。

豊富な血管新生の結果は、急成長中の血管新生腫瘍生成細胞株U-87 MGからCMとECM-模倣ゲルプラグを注入する。この血管系は広く二つの相補的なイメージング法を用いて探索することができる。 マイクロバブル造影USイメージングは、U-87 MG CMロードされたプラグは、休眠腫瘍発生細胞からのCMを含むプラグ内で検出不可能な血流とは対照的に（ 図1）内の豊富な?...

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Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

急成長腫瘍生成細胞によって分泌される因子によって募集のモニタリング機能と血管系の形態

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

monitoring-functionality-morphology-vasculature-recruited-factors

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K ビュー.  Tel Aviv University. We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

ビデオ: Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

免疫手術でヒト胚性幹細胞の導出

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

生物学

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate that acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network and its anti-correlated sensorimotor/paralimbic network at multiple levels of the brain and that the hemodynamic response is influenced by the psychophysical response.  Physiological monitoring may be performed to explore the peripheral response of the autonomic nerve function. This video describes the studies performed at LI4 (hegu), ST36 (zusanli) and LV3 (taichong), classical acupoints that are commonly used for modulatory and pain-reducing actions. Some issues that require attention in the applications of fMRI to acupuncture investigation are noted.

FMRI and physiological monitoring is used to study the effects of Acupuncture on the central and peripheral nervous systems. Acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network, with great overlap with the default mode network, to modulate neurological activity, possibly related to its autonomic effect in the peripheral nervous system.

fMRIによるヒト脳機能に対する鍼の効果のモニタリング

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

テラトーマ形成により、ヒト胚性幹細胞の運命のマッピング

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

肝灌流による肝細胞の精製した生体肝エンドサイトーシスに

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

&quot;過酸化&quot;と&quot;酸化&quot;ヒドロキシルラジカルフットプリントにより、RNAの構造における均衡の変化を監視する

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

山中因子の過剰発現によって多能性の成体体細胞のin vivoでの再プログラミング中

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a population always have accumulated mutations that are either detrimental or beneficial for the cell. If the fitness effect of a mutation provides the subpopulation with a strong selective growth advantage, the individuals of this subpopulation may rapidly outcompete and even completely eliminate their immediate fellows. Thus, small genetic changes and selection-driven accumulation of cells that have acquired beneficial mutations may lead to a complete shift of the genotype of a cell population. Here we present a procedure to monitor the rapid clonal expansion and elimination of beneficial and detrimental mutations, respectively, in a bacterial cell population over time by cocultivation of fluorescently labeled individuals of the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis. The method is easy to perform and very illustrative to display intraspecies competition among the individuals in a bacterial cell population.

Bacteria may accumulate either detrimental or beneficial mutations during their lifetime. In a population of cells individuals that have accumulated beneficial mutations may rapidly outcompete their fellows. Here we present a simple procedure to visualize intraspecies competition in a bacterial cell population over time using fluorescently labeled individuals.&#160;

蛍光標識株の共同栽培による細菌細胞集団における種内競争のモニタリング

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...