ここに記載されている意見やアサーションは、著者の個人ビューであり、公式または陸軍省や国防総省の見解を反映するものとして解釈されるべきではない。 著者ホイットニーA.グリーン、アルベルト·ムニーズ、とラメシュR. KainiがUSAISRで米国学術研究会議ポスドク研究Associateshipを開催しながら、本研究を実施した。 マイクロアレイアッセイは、UTの健康科学センターサンアントニオでGreehey小児がん研究所マイクロアレイ基盤施設およびバイオインフォマティクス部門によって行われた。 この作品は、米軍の臨床リハビリテーション医学研究プログラム（CRMRP）と軍事運用医学研究プログラム（MOMRP）によってサポートされていました。

文化試薬および培養プレートの1。準備<ol><li> mTeSR1メディア：製造業者の指示に従ってmTeSR1メディアを準備します。 4℃で一晩mTeSR1 5Xサプリメントの100ミリリットルを解凍mTeSR1基礎培地の400ミリリットルにmTeSR1 5Xサプリメントの100ミリリットルを加え、よく混ぜる。このメディアは2週間まで、4℃で6ヶ月間、-20℃で安定である。 </li><li>分化培地：0.1mMのβ-メルカプトエタノールを得たDMEM/F12中で分化培地を準備し、0.1mMの非必​​須アミノ酸、2.0mMのL-グルタミン、10％ノックアウト血清、および10μg/ mlのゲンタマイシン。 </li><li> IPS-RPEメディア：1X N1サプリメント、0.1mMの非必​​須アミノ酸、250μg/ mlのタウリン、13 ng / mlのトリヨード-L-チロニンナトリウム塩を得るために、MEMでIPS-RPEのメディアを準備し、20 ng / mlのヒドロコルチゾン、5μgの/ mlのゲンタマイシン、および15％FBS 26。 </li><li>トリヨード-L-チロニンナトリウム塩原液。ストック溶液を調製しトリヨード-L-チロニン1.0mgのを溶解穏やかに旋回1 N水酸化ナトリウム中のナトリウム塩。次のトリヨード-L-チロニンナトリウム塩の20μg/ mlのの50.0ミリリットルを作るために、ベースのメ​​ディアの49.0ミリリットルを追加。分量を用意し、必要になるまで-20℃で凍結する。最終培養培地中で所望の濃度を達成するために適切な容量を使用する。 </li><li>ヒドロコルチゾンストック溶液：穏やかな撹拌によって無水エタノール1ml中ヒドロコルチゾン1mgを可溶化し、ヒドロコルチゾンストック溶液を調製した。次の50μg/ mlのの20ミリリットルのヒドロコルチゾンストック溶液のための基本培地の19.0ミリリットルを追加。必要になるまで-20℃で一定分量および凍結。最終培養培地中で所望の濃度を達成するために適切な容量を使用する。 </li><li>胎児RPE細胞増殖培地。 FBSを除いて、製造業者の指示に従って、基礎培地にRTEGMキットにすべての試薬を混合することにより、増殖培地を準備します。 </li><li>胎児RPEメッキメディア。滅菌容器であり、aに増殖培地に少量を転送することによって、めっき媒体を調製2％の最終濃度までDD FBS。 </li><li>ディスパーゼ：DMEM/F12中1 mg / mlとディスパーゼのワーキング溶液を調製する。 </li><li>マトリゲルコーティングされたプレート：0.08 mg / mlのにDMEM/F12中でマトリゲルを準備します。 </li><li>マトリゲル溶液1.0mlで被覆6ウェルプレートの各ウェル。 </li><li> 1.0時間室温でコーティングしたプレートをインキュベートする。 </li><li> 1.0時間インキュベートした後、過剰のDMEM/F12を吸引する。 </li><li>乾燥を避けるために、mTeSR1培地の0.5ミリリットルを追加します。マトリゲルでコーティングしたプレートを使用する準備が整いました。 </li></ol> 2。のiPS文化<ol><li> iPS細胞の播種の前にはすべてのチューブ、室温に戻しmTESR1メディア、および準備マトリゲル被覆されたプレートを持っています。 </li><li>すぐに37℃の水浴中でIMR90-4 iPS細胞を解凍する。次いで水浴からクリオバイアルを除去し、70％エタノールを用いて滅菌する。 </li><li>細胞凝集体の破壊を最小限にするために2ミリリットルピペットを用いて15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す。 </li><li>一滴ずつWAの5ミリリットルを追加RM優しくmTeSR1細胞へのメディアとは混ぜる。室温で5分間300×gで細胞を遠心分離し、上澄み液を除去します。 </li><li>慎重にmTeSR1培地2mlに細胞集合体を再懸濁し、6ウェルプレートの1ウェルに細胞を播種。 </li><li> 5％のCO 2、湿度95％で37℃のインキュベーターと文化にプレートを置きます。 </li><li>毎日のiPS細胞培養培地を変更します。未分化コロニーは5〜7日播種後に表示されます。通過のため準備ができている未分化コロニー（密中心としたコロニー）をチェックします。 </li></ol> iPS細胞の3。継代<ol><li>前の通過に対して先頭にiPS細胞は、全てのチューブは、ディスパーゼ溶液、DMEM/F12とmTERS1メディアを室温に温めており、マトリゲルをコーティングしたプレートを準備。 </li><li> iPS細胞を継代する前に、エリアをこするとメディアを吸引することにより、分化の任意の部分を削除します。分化が高いために井戸の20％以下に維持する必要があり質の高い文化。慎重に2ミリリットルのDMEM/F12とよくiPS細胞を含むをすすぎ、各ウェルに1 mg / mlのディスパーゼの1ミリリットルを加える。 </li><li> 7分間37℃でインキュベートする。ディスパーゼを吸引し、ゆっくりと二度DMEM/F12 2mlで細胞コロニーをすすぐ。 </li><li>すすいだ後、各ウェルにmTSER1の2ミリリットルを追加します。 </li><li>を5mlピペットを用いて静かに凝集体を形成するプレートのコロニーを掻き取る。 </li><li> 15ミリリットルコニカルチューブに取り外したコロニーを転送します。細胞の次の通過をシードするに十分なmTeSR1メディアを追加します。 </li></ol> IPS-RPEにiPS細胞の4。分化<ol><li> mTESR1メディアに新しくコートしたプレート上にiPS細胞をプレート。 </li><li> iPS細胞コロニーが培養液中で4〜5日間拡大することができます。 </li><li> 4ミリリットル分化培地に置き換えてmTeSR1メディア。 3日ごとにメディアの半分を変更します。 </li><li>色素性病巣を手動文化（40から50日間）の摘出するのに十分な大きさに成長することができます。 </li><li>使用200μlのピペットチップの周囲にカットし、着色されたコロニーを持ち上げる。 </li><li> 15ミリリットルコニカルチューブで解剖コロニーを収集し、プールを提供しています。 </li><li> 2回5分間300×gでプールされたRPE細胞および遠心分離機にDMEM/F12の5ミリリットルを追加。 </li><li> 0.25％トリプシンEDTAでプールされたIPS-RPEをインキュベートすることによって単一の細胞溶液を調製する。 </li><li> IPS-RPEメディアでIPS-RPE細胞をすすぎ、IPS-RPE培地4mlによく新鮮でコーティングされたマトリゲル上で採取した細胞をプレート。 </li><li>文化の前に通過に3週間のために細胞。 3日おきにメディアを変更します。実験では、プレートIPS-RPE / cm 2で100,000細胞。 17日目に細胞を回収します。0日として播種の日をカウントします。 </li></ol> 5。サンプルの採取<ol><li> iPS細胞コレクション<ol><li>文化iPS細胞の未分化コロニーが中心で密であることが観察されるまで。 </li><li> DMEM/F12中でコロニーを洗浄します。 </li><li> accutasを使用して単一細胞に解離<html> E。 5分間300×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に細胞を回収します。上清を吸引し。 DMEM/F12 2ml中に再懸濁します。 </li></ol></li><li>胎児RPEコレクション<ol><li> DMEM/F12で胎児RPE細胞の培養物をすすぎ、0.25％トリプシンEDTAを使用して単一細胞に解離する。 </li><li> 15ミリリットルコニカルチューブ内の細胞を回収します。 5分間300×gで遠心分離する。上清を吸引し。 DMEM/F12 2ml中に再懸濁します。 </li></ol></li><li> IPS-RPE細胞コレクション<ol><li> IPS-RPEを継代3および継代5に到達すると、通過後17日目に細胞を回収。 PBSで2回IPS-RPEをすすぎ、1.0ミリリットル0.25％トリプシンとのインキュベーションにより単一細胞懸濁液を準備します。 </li><li>の氷冷IPS-RPE培地2mlでトリプシンを中和する。 </li><li> 5分間300×gで15ミリリットルコニカルチューブ遠心分離で細胞を回収します。上清を吸引し。 </li><li>マイクロビーズキットの染色緩衝液3ml中の細胞懸濁液を再懸濁する。 </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 6。未分化細胞を除去するために、IPS-RPEの負の選択<ol><li>使用するまで4℃で、すべての試薬を保持しますが、氷の上では動作しません。 5分間300×gでステップ5.3.4からの遠心細胞懸濁​​液。上清を吸引し。 </li><li> 2×10 6個の細胞あたりマイクロビーズキットの染色緩衝液100μlに再懸濁細胞。 </li><li> 2×10 6個の細胞あたりの抗TRA-1-60-PE抗体の10μlを加える。 </li><li>よく混ぜ、10分間、4℃でインキュベートする。 </li><li> 2×10 6個の細胞あたり1-2 mLのバッファーで細胞を洗浄。 300×gで10分間遠心します。上清を吸引し。 </li><li> 2×10 6個の細胞あたり染色バッファー80μlの再懸濁細胞。 2×10 6細胞あたり抗PEラベルマイクロビーズを20μl（キットから）を追加します。よく混ぜる。 4℃で15分間インキュベートする。 </li><li> 2×10 6個の細胞あたり染色緩衝液1〜2 mLを加え。 300×gで10分間遠心します。上清を吸引し。 </li><li> 500＆＃で細胞を再懸濁956;染色緩衝液のL。 </li><li>磁気細胞分離： <ol><li>磁気セルソーターで列を配置します。染色緩衝液3mlで列を洗浄します。 </li><li>カラムに6.8から細胞懸濁液を適用します。 </li><li> TRA-1-60陰性細胞を収集するために、負のポートにチューブを配置します。 </li></ol></li></ol> 7。全RNA抽出<ol><li>溶解核酸ミニプレップ用に設計された市販のマイクロ遠心ホモジナイザーミニスピンカラムを通してサンプルを実行することにより、細胞。 </li><li> iPS細胞、IPS-RPE、小さなRNA分子27を維持するように設計された市販のRNA抽出キットを用いて、胎児RPEから全RNAを抽出します。 </li><li>ナノドロップ分光光度計を用いて、全RNA濃度を決定します。 </li></ol> 8。バイオアナライザおよびマイクロアレイアッセイ<ol><li>市販のRNA品質のキットと一緒にバイオアナライザでRNAの完全性を確認してください。 </li><li> 100ngのインキュベート30分間37℃でのウシ腸ホスファターゼトータルRNA </li><li> 5分間、100℃で100％DMSOを用いてRNAを変性させる。 </li><li> PCP-Cy3では、1時間16℃でインキュベートすることにより、T4リガーゼを使用してサンプルにラベルを付けます。 </li><li> 8_x_15Kフォーマット人間miRNAアレイにハイブリダイズする。 </li><li>製造業者の説明書に従ってアレイを洗浄し、スキャナを用いて5μmの解像度でスキャンする。 </li><li> miRNAのマイクロアレイと互換性のあるマイクロアレイの特徴抽出ソフトウエアを用いてデータを取得する。 </li><li>各試料における発現の相対レベルを決定するために、miRNAの信号を処理する。 </li><li>サンプル群間の各miRNAの発現レベルを比較する。さらなる分析のために少なくとも2倍の差次的発現を有するmiRNAを選択する。 </li><li>データ解析のための市販のソフトウェアを使用して、示差的に発現されたmiRNA 28の可視化のヒートマップを生成するために、指示に従ってください。 </li></ol> 9。経路解析<ol><li> Excel形式で8.9で選択されたmiRNAからのデータを保存します。 </li><li>オンラインRNA経路解析プログラムにログインします。 Excelファイルをアップロードします。ファイル形式のための「柔軟なフォーマット」を選択し、識別子の型のためのドロップダウンリストから「アジレント」を選択します。 </li><li>生データの見出しの下に、ID列を調べるために、「ID」を割り当て、「観察1」を割り当て、ログ配給の列に &quot;比を記録」。他のすべての列は、「無視」を選択してください。 </li><li>以下のように分析するためのパラメータを選択します。信頼：実験的にのみ認められ;直接的および間接的な関係があります。および内因性化学物質を含む;リファレンスセットとして工夫ナレッジベースを選択します。すべての種からのデータを、すべての細胞株や組織、およびすべての変異を含む参照分子のデータベースを選択します。 </li><li>ファイル名を指定して実行]ネットワークおよび経路は分析しています。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

結論として、この報告書は、文化iPS細胞、IPS-RPE、胎児RPEするために使用される方法を説明します。 IPからの派生のRPEは、形態学的および機能的に胎児RPEに似ています。 IPS-RPEはまた、RPE65、CRALBP、PEDF、及びLRAT 16を含む特徴的なRPE遺伝子を発現する。さらに、これらの細胞を特徴付けるために、RNAを抽出し、示差的に発現するmiRNAを同定するためにマイクロアレイ解析を実行するため?...

幹細胞は無制限に複製する能力、および任意の体細胞型に分化する可能性を有する。パーソナライズされた組織再生の出現が地平線1にあるように多能性幹細胞への体細胞を再プログラムするための技術の開発は、研究コミュニティ内や臨床医の間で大きな興奮を誘発しました。誘起多能性幹（IPS）細胞のESCに関連する倫​​理的ジレンマを回避しながら、胚性幹（ES）細胞のような無限の複製能力と多能性の同じ特徴を示す。加えて、患者由来の幹細胞が大幅に成功した治療への応用2-3の確率を増大させる、免疫応答を刺激しないであろう。特定の培養条件下で、iPS細胞は、心筋細胞、ニューロン、膵臓β細胞、肝細胞、および網膜色素上皮（RPを含む、インビトロでいくつかの異なる細胞型に分化することが示されているE）を4月12日 。 RPEは、生産に特化したような光受容体外側セグメントの迷光、食作用の吸収などの視覚的な健康と機能に不可欠ないくつかの機能を実行、網膜の奥に位置して色素上皮細胞層、およびレチノイドの処理である視覚発色団の。例えば、加齢性黄斑変性症（AMD）、シュタルガルト病、及び網膜色素変性症（RP）などの下地RPE病理の結果である失明疾患によって証明されるようによる損傷または疾患にRPEの機能不全が深く、感光体の健康および視覚機能に影響を与え13。視力を回復することができ、本当に効果的な治療が達成されておらず、健全なRPEと病気のRPEの交換はビジョン14〜15の損失を防止するための最良の選択肢かもしれません。のiPS（IPS-RPE）に由来するRPEが破損し、RPEを置き換えるために、細胞の可能性のあるソースです。 IPS-RPEはcharacterisを表現TICのRPEタンパク質LRAT、CRALBP、PEDF、及びRPE65;古典高度に着色六角形のRPE形態を表示します。 シスレチナール5,16 -など食作用、レチノイド処理、および11の分泌としてRPE機能を実行する。 IPS-RPEを治療的に使用することができる前に、しかし、IPS-RPEを徹底的に特徴づけされなければならない。 RPE分化を支配する要因を理解することは、臨床用途に使用する細胞の収率および純度を向上させる必要がある。 細胞分化は、高度に調節される遺伝子発現の結果である。転写因子のゲノムとの連携のエピジェネティックな改造は、分化および発生17中に発生する細胞運命決定のために必要とされる。マイクロRNA（miRNAを）によるメッセージRNA（mRNA）の翻訳の調節は、細胞運命1に影響を与える規制のさらに別のレベルを示します。 miRNAは、〜22、NT、によって翻訳を抑制するいずれかのヌクレオチドの長さが不足しているmRNAの3 &#39;UTRに結合するか、分解のためにmRNAをターゲットにしています。 miRNAは、事実上すべての組織で検出されており、現在までに2000以上のユニークな人間のマイクロRNAは、miRBaseデータベースに登録されています。 すなわち 、単一のmRNAは、いくつかの異なるmiRNAによって標的とすることができる。miRNAは、標的mRNAと結合することが部分的にしか相補性を必要とするので、一つのmiRNAは、潜在的に数十あるいは数百の目標、およびその逆に結合することができる。この無差別結合特性を飛躍的に規制の複雑さのレベルだけでなく、個々のmiRNAの機能を決定することの難しさのレベルと役割の細胞機能18〜21の各プレーを向上させます。それにもかかわらず、研究は、miRNAがDNAメチル化状態17に影響を与えることによって分化の間の遺伝子発現を洗練することが示されている。 RPEへのより具体的な研究において、miR-204/211はRPE 22の上皮表現型を促進することが示された。別のグループは、miRNAプロファイルを分析したRPEのES細胞からの分化の間およびmiRNAの別個のセットを明らかにしたが、分化プロセス23の間に発現される。実際、miRNAプロファイルは、明確にES細胞、前駆細胞、および分化細胞24,25を含む細胞タイプを区別することができる。 250以上のmiRNAは、網膜で発現される。これらの研究に基づき、我々は、miRNAがIPからのRPEの分化の際に重要な役割を果たしていると仮定した。 このレポートの目的は、IMR90-4 iPS細胞は、マイクロアレイによる解析のためにRNAを収集し、示差的3種の細胞型間で発現されるmiRNAを同定するためのマイクロアレイデータの解析、iPS細胞からのRPEの分化のためのプロトコルを記述することである、IPS-RPEおよび胎児RPE。総RNAを、各細胞型の培養物から抽出され、1205のヒトmiRNA及び144ウイルスのmiRNAに特異的なプローブを含む、miRNAのマイクロアレイにハイブリダイズさせた。マイクロアレイの結果を比較した示差的に異なる細胞型間で発現されたmiRNAを決定するためにdを。 2倍以上の発現のより大きな倍率変化を有するmiRNAは、さらなる分析のために選択した。 miRNAの解析ソフトが差次的に発現miRNAの潜在的な標的を同定するために、選択したmiRNAによって調節セルラー·ネットワークを生成するために使用された。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td style="width:156px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5850</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:235px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">MEM media</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Taurine</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium salt</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal RPE media RTEGM kit</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">195406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Dispase</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Matrigel</td>
			<td style="width:156px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Trypsin</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec washing buffer</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-092-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec rinsing buffer</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-092-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Anti-TRA-1-60 microbead kit</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-095-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec cell sorter column</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-021-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">RNeasy micro kit</td>
			<td style="width:156px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">QIA shredder</td>
			<td style="width:156px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">RNA 6000 Pico LabChip kit</td>
			<td style="width:156px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2938-90046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Human miRNA microarray v16</td>
			<td style="width:156px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G4471A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microrna expression profiles of human ips cells, retinal pigment epithelium derived from ips, and fetal retinal pigment epithelium

このレポートの目的は、マイクロRNA（miRNAを）ヒトiPS細胞（IPS-RPE）に由来する人為-多能性幹（IPS）細胞、網膜色素上皮（RPE）、および胎児RPEのプロファイルを比較するためのプロトコルを記述することである。プロトコルは、マイクロアレイによる解析のためのRNAの収集、および差次3種の細胞型間で発現されるmiRNAを同定するためのマイクロアレイデータの分析を含む。 iPS細胞や胎児RPEの培養のための方法を説明します。ヒトiPSからのRPEの分化に使用されるプロトコルにも記載されている。我々が記述するRNA抽出技術は、miRNAのマイクロアレイにおける使用のための非常に小さなRNAの最大の回収を可能にするように選択した。最後に、マイクロアレイデータの細胞経路およびネットワーク分析を説明する。これらの技術は、3つの異なる細胞型のmiRNAプロファイルの比較を容易にする。

iPS細胞（ 図1A）は 、RPEのiPS細胞への分化を誘導する分化条 ​​件下で増殖させた。 IPS-RPEは、胎児RPE（ 図1C）と同様の六角形色素性細胞の形態（ 図1B）の古典的なRPE表現型を示した。 良好なmiRNAがのiPSからのiPS-RPEへの分化過程において役割を果たし得ることを理解することは、miRNA発現のマイクロアレイ解析を行った。総RNAを、iPS?...

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MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

マイクロRNA（miRNAを）人為-多能性幹（IPS）細胞（IPS-RPE）、および胎児RPE由来のヒト誘起多能性幹（IPS）細胞、網膜色素上皮（RPE）のプロファイルは、比較した。

ヒトiPS細胞のマイクロRNA発現プロファイル、IPから派生網膜色素上皮、および胎児の網膜色素上皮

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

microrna-expression-profiles-human-ips-cells-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K ビュー.  JBSA Fort Sam Houston. マイクロRNA（miRNAを）人為-多能性幹（IPS）細胞（IPS-RPE）、および胎児RPE由来のヒト誘起多能性幹（IPS）細胞、網膜色素上皮（RPE）のプロファイルは、比較した。 

ビデオ: MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

生物学

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

ニトロレダクターゼ/メトロニダゾール媒介アブレーションとゼブラフィッシュ網膜色素上皮の再生を研究するためのMATLABプラットフォーム(RpEGEN)

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

ブタ網膜色素上皮細胞の初代培養

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

初代マウス網膜色素上皮細胞の単離

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and vision. Proteins on the RPE apical surface are tightly associated with proteins on the photoreceptor outer segment surface, making it difficult to consistently separate the RPE from the photoreceptors/retina. We developed a method to efficiently separate the retina from the RPE of human eyes to generate complete RPE/choroid and retina flatmounts for separate cellular analysis of the photoreceptors and RPE cells. An intravitreal injection of a high-osmolarity solution of D-mannitol, a sugar not transported by the RPE, induced the separation of the RPE and retina across the entire posterior chamber without causing damage to the RPE cell junctions. No RPE patches were observed attached to the retina. Phalloidin labeling of actin showed RPE shape preservation and allowed morphometric analysis of the entire epithelium. An artificial intelligence (AI)-based software was developed to accurately recognize and segment the RPE cell borders and quantify 30 different shape metrics. This dissection method is highly reproducible and can be easily extended to other animal models.

We describe a method to efficiently separate retinal pigment epithelium (RPE) from the retina in human eyes and generate whole RPE/choroid flatmounts for histological and morphometric analyses of the RPE.

組織学的分析のためのヒトの眼からの網膜色素上皮/脈絡膜フラットマウントの効率的かつ一貫した生成

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) and proliferative vitreoretinopathy (PVR). Since RPE are highly metabolically-active cells, alterations in their metabolic status reflect changes in their health and function. High-resolution respirometry allows for real-time kinetic analysis of the two major bioenergetic pathways, glycolysis and mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS), through quantification of the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), respectively. The following is an optimized protocol for conducting high-resolution respirometry on primary human retinal pigment epithelial cells (H-RPE). This protocol provides a detailed description of the steps involved in producing bioenergetic profiles of RPE to define their basal and maximal OXPHOS and glycolytic capacities. Exposing H-RPE to different drug injections targeting the mitochondrial and glycolytic machinery results in defined bioenergetic profiles, from which key metabolic parameters can be calculated. This protocol highlights the enhanced response of BAM15 as an uncoupling agent compared to carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) to induce the maximal respiration capacity in RPE. This protocol can be utilized to study the bioenergetic status of RPE under different disease conditions and test the efficacy of novel drugs in restoring the basal metabolic status of RPE.

The metabolic status of human retinal pigment epithelial cells (H-RPE) reflects their health and function. Presented here is an optimized protocol for examining the real-time metabolic flux of H-RPE using high-resolution respirometry.

高分解能肺活量測定法を用いた初代ヒト網膜色素上皮細胞における生体エネルギーのリアルタイム解析

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential application in molecular biology studies, including gene expression analyses. In the context of eye growth regulation and myopia, the RPE likely plays a role as a cellular relay for growth modulatory signals, as it is located between the retina and the two walls of the eye, such as the choroid and sclera. While protocols for isolating the RPE have been developed for both chicks and mice, these protocols have proven not to be directly translatable to the guinea pig, which has become an important and widely used mammalian myopia model. In this study, molecular biology tools were used to examine the expression of specific genes to confirm that the samples were free of contamination from the adjacent tissues. The value of this protocol has already been demonstrated in an RNA-Seq study of RPE from young pigmented guinea pigs exposed to myopia-inducing optical defocus. Beyond eye growth regulation, this protocol has other potential applications in studies of retinal diseases, including myopic maculopathy, one of the leading causes of blindness in myopes, in which the RPE has been implicated. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and&#160;once perfected, yields high-quality RPE samples suitable for molecular biology studies, including RNA analysis.

We describe a simple and efficient method for isolating cells of the retinal pigment epithelium (RPE) cells from the eyes of young pigmented guinea pigs. This procedure allows for follow-up molecular biology studies on the isolated RPE, including gene expression analyses.

モルモットの目からの網膜色素上皮細胞の分離

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

網膜変性症のモデリングと解析

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

著者スポットライト:加齢性黄斑変性の病因を解明し、潜在的な治療法を発見する 

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.