Les opinions exprimées dans le présent article sont celles des auteurs et ne doivent pas être interprétées comme fonctionnaire ou comme reflétant les vues du Département de l&#39;Armée ou le ministère de la Défense. Cette recherche a été réalisée alors que les auteurs Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, et Ramesh R. Kaini tenu un attaché de recherche postdoctorale du Conseil national de recherches à l&#39;USAISR. analyses de biopuces ont été effectuées par l&#39;Institut de recherche sur le cancer de puces à ADN base la facilité de la Greehey enfants et Département bioinformatique à l&#39;UT Health Science Center à San Antonio. Ce travail a été soutenu par le Programme de l&#39;armée américaine médecine clinique de réadaptation de la recherche (CRMRP) et militaire du programme de recherche de la médecine opérationnelle (MOMRP).

1. Préparation de la Culture Réactifs et Culture Plaques <ol><li> mTeSR1 médias: Préparer médias mTeSR1 selon les instructions du fabricant. Décongeler 100 ml de supplément mTeSR1 5x nuit à 4 ° C. Ajouter 100 ml de supplément mTeSR1 5x 400 ml de mTeSR1 milieux de base et bien mélanger. Ce support est stable à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 2 semaines et à -20 ° C pendant 6 mois. </li><li> médias de différenciation: Préparez le support de différenciation dans DMEM/F12 pour obtenir 0,1 mM β-mercaptoéthanol, 0,1 mM acides aminés non essentiels, 2,0 mM de L-glutamine, sérum de KO de 10%, et 10 pg / ml de gentamicine. </li><li> iPS-RPE médias: Préparer médias iPS-RPE dans MEM pour donner supplément 1x N1, 0,1 mM acides aminés non essentiels, 250 ug / taurine ml, ml de sel de sodium de 13 ng / triiodo-L-thyronine, 20 ng / ml d&#39;hydrocortisone, 5 ug / ml de gentamicine, 15 et 26% de FBS. </li><li> Sel de sodium solution stock triiodo-L-thyronine. Pour préparer la solution mère dissoudre 1,0 mg de triiodo-L-thyroninesel de sodium 1 N dans de l&#39;hydroxyde de sodium en remuant doucement. Suivant ajouter 49,0 ml de milieu de base pour faire 50,0 ml de 20 pg / ml de sel de sodium triiodo-L-thyronine. Préparer des aliquotes et congeler à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. Utiliser un volume approprié pour atteindre la concentration souhaitée dans les milieux de culture final. </li><li> Hydrocortisone solution stock: Pour préparer une solution stock d&#39;hydrocortisone, solubiliser 1 mg d&#39;hydrocortisone dans 1 ml d&#39;éthanol absolu par agitation douce. Ensuite, ajoutez 19,0 ml de milieu de base pour 20 ml d&#39;hydrocortisone solution stock de 50 pg / ml. aliquoter et congeler à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. Utiliser un volume approprié pour obtenir la concentration désirée dans le milieu de culture final. </li><li> Milieu de croissance de RPE foetal. Préparer le milieu de croissance en mélangeant tous les réactifs dans le kit RTEGM dans le milieu de base, selon les instructions du fabricant, sauf pour le FBS. </li><li> Fœtale médias RPE de placage. Préparer des milieux placage par transfert d&#39;une petite quantité de milieu de croissance dans un récipient stérile et d&#39;unedd FBS à une concentration finale de 2%. </li><li> Dispase: Préparer la solution de travail de dispase de 1 mg / ml dans DMEM/F12. </li><li> Matrigel plaques enduites: Préparer matrigel dans DMEM/F12 à 0,08 mg / ml. </li><li> Manteau de chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits avec 1,0 ml de la solution de Matrigel. </li><li> Incuber les plaques revêtues à la température ambiante pendant 1,0 h. </li><li> Après l&#39;incubation de 1,0 heures, aspirer l&#39;excédent DMEM/F12. </li><li> Ajouter 0,5 ml de milieu mTeSR1 pour éviter le séchage. Les plaques de matrigel enduit sont maintenant prêts à être utilisés. </li></ol> 2. IPS Culture <ol><li> Avant iPS cellules semis ont tous les tubes, les médias mTESR1 chaud à la température ambiante, et les matrigel plaques enduites de prêts. </li><li> Dégeler rapidement les cellules iPS IMR90-4 dans un bain d&#39;eau à 37 °. Ensuite, retirer le tube cryogénique du bain d&#39;eau et stériliser en utilisant 70% d&#39;éthanol. </li><li> Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette 2 ml de réduire au minimum la rupture des agrégats cellulaires. </li><li> Goutte à goutte, ajoutez 5 ml de warm médias mTeSR1 aux cellules et mélanger délicatement. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante et retirer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension soigneusement les agrégats de cellules dans 2 ml de milieu mTeSR1 et épépiner les cellules sur un puits d&#39;une plaque de six puits. </li><li> Placer la plaque dans un incubateur et la culture à 37 ° avec 5% de CO2, 95% d&#39;humidité. </li><li> Changer les milieux de culture de cellules iPS quotidien. Colonies indifférenciées apparaissent 5-7 jours après le semis. Vérifiez colonies indifférenciées qui sont prêts pour le passage (colonies avec un centre dense). </li></ol> 3. Repiquage des cellules iPS <ol><li> Avant de commencer le passage des cellules iPS, ont tous les tubes, solution dispase, DMEM/F12 et mTERS1 médias réchauffé jusqu&#39;à la température ambiante, et le matrigel revêtu des plaques prêtes. </li><li> Avant de passage de cellules iPS, retirez tous les domaines de la différenciation en grattant la zone et aspirer les médias. La différenciation devrait rester en dessous de 20% du bien pour une grandecultures de qualité. Rincer soigneusement le contenant des cellules iPS-bien avec 2 ml DMEM/F12 et ajouter 1 ml de 1 mg / ml dispase à chaque puits. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 7 min. Aspirer la dispase et rincer délicatement les colonies de cellules avec 2 ml de DMEM/F12 deux fois. </li><li> Après rinçage, ajouter 2 ml de mTSER1 à chaque puits. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un pipette de 5 ml gratter doucement les colonies de la plaque pour former des agrégats. </li><li> Transférer les colonies individuelles dans un tube conique de 15 ml. Ajouter un média mTeSR1 suffisantes pour ensemencer la suivante passage des cellules. </li></ol> 4. Différenciation des cellules iPS pour iPS-RPE <ol><li> Plaquer les cellules iPS sur une plaque nouvellement revêtu dans les médias mTESR1. </li><li> Permettre aux colonies de cellules iPS à développer pour 4-5 jours de culture. </li><li> Médias mTeSR1 substitut avec les médias de différenciation 4 ml. Changer la moitié des médias tous les 3 jours. </li><li> Permettre aux foyers pigmentées de croître suffisamment grande pour être disséqué manuellement de la culture (40-50 jours). </li><li> Utilisez un200 pi pointe de la pipette pour couper autour et lever les colonies pigmentées. </li><li> Recueillir et mettre en commun les colonies disséqués dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Ajouter ensuite 5 ml de DMEM/F12 aux cellules de l&#39;EPR en gestion commune et centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à deux reprises. </li><li> Préparer une solution à une seule cellule par incubation de la mise en commun iPS-RPE avec 0,25% de trypsine EDTA. </li><li> Rincer les cellules iPS-RPE avec les médias iPS-RPE et plaquer les cellules recueillies sur un matrigel revêtu bien dans 4 ml de milieu iPS-RPE frais. </li><li> Culture des cellules pendant 3 semaines avant au passage. Modifiez les médias tous les 3 jours. Pour l&#39;expérience, plaque iPS-RPE à 100 000 cellules / cm 2. Recueillir des cellules le jour 17. Comptez le jour de l&#39;ensemencement comme jour 0. </li></ol> 5. Prélèvement des échantillons <ol><li> Cellules iPS Collection <ol><li> Culture des cellules iPS jusqu&#39;à colonies indifférenciées sont observés à être dense au centre. </li><li> Rincer les colonies dans DMEM/F12. </li><li> Dissocier en cellules individuelles en utilisant accutas<html> e. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension dans 2 ml de DMEM/F12. </li></ol></li><li> Fœtale Collection RPE <ol><li> Rincer les cultures de cellules foetales RPE avec DMEM/F12 et se dissocier en cellules individuelles en utilisant 0,25% de trypsine EDTA. </li><li> Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension dans 2 ml de DMEM/F12. </li></ol></li><li> iPS-RPE cellulaire Collection <ol><li> Lorsque l&#39;IPS-RPE atteindre passage 3 et 5 passage, recueillir les cellules sur Jour 17 après le passage. Rincer iPS-RPE deux fois dans du PBS et on prépare une suspension de cellules isolées par incubation avec 1,0 ml de trypsine à 0,25%. </li><li> Neutraliser la trypsine avec 2 ml de glace froide médias iPS-RPE. </li><li> Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension la suspension de cellules dans 3 ml de tampon de coloration du kit de microbille. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. négatif Sélection des iPS-RPE pour éliminer les cellules indifférenciées <ol><li> Conservez tous les réactifs à 4 ° C jusqu&#39;à leur utilisation, mais ne fonctionnent pas sur la glace. Centrifugeuse cellule suspension de l&#39;étape 5.3.4 à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 100 ul de tampon de coloration du kit de microbilles par 2 x 10 6 cellules. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;anti-TRA-1-60-PE anticorps par 2 x 10 6 cellules. </li><li> Bien mélanger et incuber à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Laver les cellules dans 1-2 ml de tampon par 2 x 10 6 cellules. Centrifugeuse pendant 10 min à 300 x g. Aspirer le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 80 ul de tampon de coloration par 2 x 10 6 cellules. Ajouter 20 ul de microbilles anti-PE marqués (dans le kit) par 2 x 10 6 cellules. Mélangez bien. Incuber pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter 1-2 ml de tampon de coloration par 2 x 10 6 cellules. Centrifugeuse pendant 10 min à 300 x g. Aspirer le surnageant. </li><li> Remettre les cellules dans 500 &amp; #956; l de tampon de coloration. </li><li> Séparation magnétique de cellules: <ol><li> Placez colonne de tri cellulaire magnétique. Rincer la colonne avec 3 ml de tampon de coloration. </li><li> Appliquer suspension cellulaire de 6,8 sur une colonne. </li><li> Placez un tube au port négatif pour recueillir les TRA-1-60 cellules négatives. </li></ol></li></ol> 7. Extraction de l&#39;ARN total <ol><li> Lyse des cellules en exécutant les échantillons à travers une colonne microcentrifuge homogénéisateur mini tour disponible dans le commerce conçu pour minipreps d&#39;acides nucléiques. </li><li> Extraire l&#39;ARN total des cellules iPS, iPS-RPE, et RPE fœtale avec le kit d&#39;extraction d&#39;ARN disponible dans le commerce destinée à préserver les petites molécules d&#39;ARN 27. </li><li> Déterminer des concentrations d&#39;ARN totaux en utilisant un spectrophotomètre de Nanodrop. </li></ol> 8. Bioanalyzer et biopuces Assay <ol><li> Vérifier l&#39;intégrité de l&#39;ARN avec Bioanalyzer en conjonction avec kit disponible dans le commerce de la qualité de l&#39;ARN. </li><li> Incuber 100 ng del&#39;ARN total avec la phosphatase intestinale de veau à 37 ° C pendant 30 minutes </li><li> Dénaturer l&#39;ARN en utilisant 100% de DMSO à 100 ° C pendant 5 min. </li><li> Étiqueter les échantillons avec du PCP-Cy3 utilisant la T4 ligase par incubation à 16 ° C pendant 1 heure. </li><li> S&#39;hybrider sur un format de tableau 8_x_15K miARN humain. </li><li> Laver les tableaux selon les instructions du fabricant et de numériser à une résolution de 5 um en utilisant un scanner. </li><li> Acquérir des données en utilisant un logiciel d&#39;extraction de caractéristiques de puces à ADN compatible avec la puce miARN. </li><li> Traiter les signaux de miARN pour déterminer le niveau relatif d&#39;expression de chaque échantillon. </li><li> Comparer les niveaux de chaque miRNA entre les groupes d&#39;échantillons d&#39;expression. Sélectionnez miARN avec l&#39;expression différentielle au moins deux fois pour une analyse ultérieure. </li><li> Utilisation d&#39;un logiciel disponible dans le commerce pour l&#39;analyse des données, suivez les instructions pour générer des cartes de chaleur pour la visualisation des miARN exprimés de manière différentielle 28. </li></ol> 9. Analyse de Pathway <ol><li> Sauvegardez les données de miARN sélectionnés en 8.9 en format Excel. </li><li> Connectez-vous au programme d&#39;analyse en ligne de la voie de l&#39;ARN. Téléchargez le fichier Excel. Sélectionnez &quot;Format flexible&quot; pour le format de fichier et sélectionnez &quot;Agilent&quot; dans la liste déroulante pour le type d&#39;identificateur. </li><li> Au point de données brutes, assigner &quot;ID&quot; pour sonder la colonne d&#39;identification et d&#39;attribuer &quot;Observation 1&quot; et &quot;log rapport&quot; à la colonne journal de la ration. Sélectionnez &quot;ignorer&quot; pour toutes les autres colonnes. </li><li> Sélectionnez les paramètres d&#39;analyse comme suit: Confiance: observé expérimentalement que; inclure les relations directes et indirectes; et inclure des produits chimiques endogènes; Sélectionnez la base de connaissances d&#39;Ingenuity comme l&#39;ensemble de référence. Choisir la base de données des molécules de référence qui comprend des données provenant de toutes les espèces, toutes les lignées cellulaires et les tissus, et toutes les mutations. </li><li> réseau Run et la voie analyses. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

En conclusion, ce rapport décrit les méthodes utilisées pour la culture de cellules iPS, iPS-RPE, et RPE fœtale. EPR dérivé de iPS sont morphologiquement et fonctionnellement similaire à RPE fœtale. L&#39;IPS-RPE exprime aussi des gènes de RPE caractéristiques dont RPE65, CRALBP, PEDF, et LRAT 16. Pour mieux caractériser ces cellules, l&#39;ARN a été extrait et utilisé pour effectuer l&#39;analyse des microréseaux d&#39;identifier exprimé de manière différentielle miARN. Analyse des intensit...

Les cellules souches ont la capacité de se répliquer sans limite et le potentiel de se différencier en n&#39;importe quel type de cellules somatiques. Le développement des techniques de reprogrammer des cellules somatiques en cellules souches pluripotentes a suscité beaucoup d&#39;enthousiasme dans la communauté des chercheurs et des cliniciens, comme l&#39;avènement de la régénération des tissus personnalisé à l&#39;horizon 1. Induire-souches pluripotentes (iPS) présentent les mêmes caractéristiques de potentiel réplicatif illimité et pluripotence comme souches embryonnaires (ES) des cellules tout en contournant les dilemmes éthiques liés à la CES. En outre, les cellules souches provenant de patients ne seront pas stimuler une réponse immunitaire, ce qui augmente considérablement la probabilité de succès des applications thérapeutiques 3.2. Dans des conditions de culture spécifiques, les cellules iPS ont été montrés pour se différencier en plusieurs types différents de cellules in vitro, y compris les cardiomyocytes, les neurones, les cellules bêta pancréatiques, des hépatocytes, et l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (RPE) 4-12. La RPE est une couche de cellules epitheliales spécialisées pigmentés situés à l&#39;arrière de la rétine qui exécute plusieurs fonctions qui sont essentielles pour la santé visuelle et fonction telle que l&#39;absorption de la lumière parasite, la phagocytose des segments externes des photorécepteurs, et le traitement des rétinoïdes pour la production de chromophore visuelle. Le dysfonctionnement de l&#39;EPR en raison de dommages ou maladie affecte profondément la santé des photorécepteurs et la fonction visuelle comme en témoignent les maladies cécitantes qui sont le résultat de la pathologie de l&#39;EPR sous-jacente comme la dégénérescence liée à l&#39;âge (DMLA), la maladie de Stargardt et la rétinite pigmentaire (RP) 13. Traitements vraiment efficaces qui peuvent restaurer la vision n&#39;ont pas été atteints, et le remplacement des RPE malade avec sain RPE peut être la meilleure option pour éviter la perte de vision 14-15. EPR dérivé de cellules iPS (iPS-RPE) est une source possible de cellules pour remplacer l&#39;EPR endommagé. iPS-RPE exprime caracprotéines RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF, et RPE65; affiche la classique fortement pigmentée hexagonale RPE morphologie; et exerce des fonctions RPE comme la phagocytose, le traitement rétinoïde, et la sécrétion de 11 - 5,16 rétinienne cis. Toutefois, avant iPS-RPE peut être utilisé en thérapeutique, l&#39;IPS-RPE doit être caractérisée à fond. La compréhension des facteurs qui régissent différenciation RPE est nécessaire d&#39;améliorer le rendement et la pureté des cellules pour être utilisé pour des applications cliniques. La différenciation cellulaire est le résultat de l&#39;expression des gènes fortement réglementé. Remodelage épigénétique du génome et de la coordination des facteurs de transcription sont requis pour les décisions du destin cellulaire qui se produisent lors de la différenciation et de développement 17. Règlement de message de l&#39;ARN (ARNm) traduction par les microARN (miARN) présente encore un autre niveau de la réglementation qui affecte le destin des cellules 1. MiRNAs sont courtes, ~ 22 nt, longueurs de nucléotides qui soit la traduction suppress parla liaison à la 3 &#39;UTR de l&#39;ARNm ou de cibler l&#39;ARNm de la dégradation. MiRNAs ont été détectés dans pratiquement tous les tissus et à ce jour plus de 2000 microARN humains uniques ont été enregistrés dans la base de données miRBase. Depuis miARN exigent complémentarité partielle de se lier à l&#39;ARNm cible, un seul miARN peut potentiellement se lier à des dizaines ou des centaines de cibles, et vice versa, c&#39;est à dire un seul ARNm peut être visé par plusieurs miARN différents. Cette caractéristique de liaison promiscuité augmente considérablement le niveau de complexité de la réglementation ainsi que le niveau de difficulté de déterminer les fonctions de miARN individuels et le rôle de chacun dans les fonctions cellulaires 18-21. Néanmoins, des études ont montré que les miARN affine l&#39;expression des gènes lors de la différenciation en affectant le statut de méthylation d&#39;ADN 17. Dans une étude plus spécifique de l&#39;EPR, miR-204/211 a été montré pour promouvoir le phénotype épithélial de l&#39;EPR 22. Un autre groupe a analysé le profil miRNAde RPE cours de la différenciation des cellules ES et révélé ensembles distincts de miARN sont exprimés au cours du processus de différenciation 23. En fait, les profils de miARN peuvent clairement distinguer les types de cellules, y compris les cellules souches embryonnaires, des cellules précurseurs et des cellules à différenciation terminale 24,25. Plus de 250 miARN sont exprimés dans la rétine. Sur la base de ces études, nous faisons l&#39;hypothèse que les miARN jouent un rôle important au cours de la différenciation des RPE de iPS. L&#39;objectif de ce rapport est de décrire les protocoles pour la différenciation des RPE de IMR90-4 cellules iPS, collection de l&#39;ARN pour l&#39;analyse par puces à ADN, et l&#39;analyse des données de puces à ADN pour identifier les miARN qui sont exprimés de manière différentielle entre trois types de cellules, les cellules iPS , iPS-RPE et RPE fœtale. L&#39;ARN total a été extrait à partir de cultures de chaque type de cellule et hybride à une puce à ADN miRNA, contenant des sondes spécifiques pour 1205 miARN humains et 144 miARN viraux. Les résultats de puces à ADN ont été comparerd pour déterminer le miARN ont été exprimés de façon différentielle entre les différents types cellulaires. miARN avec 2 fois ou plus facteur de variation de l&#39;expression ont été sélectionnés pour une analyse plus approfondie. Un logiciel d&#39;analyse miARN a été utilisé pour identifier des cibles potentielles des miARN exprimés de manière différentielle et de générer des réseaux cellulaires régulés par les miARN sélectionnés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td style="width:156px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5850</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:235px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">MEM media</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Taurine</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium salt</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal RPE media RTEGM kit</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">195406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Dispase</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Matrigel</td>
			<td style="width:156px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Trypsin</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec washing buffer</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-092-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec rinsing buffer</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-092-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Anti-TRA-1-60 microbead kit</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-095-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec cell sorter column</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-021-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">RNeasy micro kit</td>
			<td style="width:156px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">QIA shredder</td>
			<td style="width:156px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">RNA 6000 Pico LabChip kit</td>
			<td style="width:156px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2938-90046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Human miRNA microarray v16</td>
			<td style="width:156px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G4471A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microrna expression profiles of human ips cells, retinal pigment epithelium derived from ips, and fetal retinal pigment epithelium

L&#39;objectif de ce rapport est de décrire les protocoles pour comparer le profil des anthropique-souches pluripotentes (iPS), l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules iPS humaines (iPS-RPE), et RPE fœtale microRNA (miRNA). Les protocoles comprennent la collecte de l&#39;ARN pour l&#39;analyse par puces à ADN, et l&#39;analyse des données de puces à ADN pour identifier les miARN qui sont exprimés de manière différentielle entre trois types de cellules. Les méthodes de culture de cellules iPS et RPE fœtale sont expliqués. Le protocole utilisé pour la différenciation de l&#39;EPR de iPS humaines est également décrite. La technique d&#39;extraction d&#39;ARN, nous décrivons a été choisie pour permettre une récupération maximale de l&#39;ARN très faible pour une utilisation dans un microréseau miARN. Enfin, voie cellulaire et l&#39;analyse du réseau de données de puces à ADN est expliqué. Ces techniques vont faciliter la comparaison des profils de miARN de trois types de cellules différents.

cellules iPS (figure 1A) ont été cultivées dans des conditions de différenciation pour induire la différenciation en cellules iPS-RPE. L&#39;IPS-RPE exposé classique phénotype de l&#39;EPR de hexagonal pigmentée morphologie cellulaire (figure 1B) similaire à RPE fœtale (figure 1C). Pour mieux comprendre le rôle que peut jouer miRNA au cours du processus de différenciation de cellules iPS à iPS-RPE, l&#39;analyse des microréseau...

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MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Le profil des souches d&#39;origine humaine pluripotentes (iPS), l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de l&#39;homme induit-souches pluripotentes (iPS) (iPS-RPE), et RPE fœtale microARN (miARN), ont été comparés.

Profils MicroRNA d&#39;expression de cellules iPS humaines, l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

microrna-expression-profiles-human-ips-cells-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K vues.  JBSA Fort Sam Houston.  Le profil des souches d'origine humaine pluripotentes (iPS), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de l'homme induit-souches pluripotentes (iPS) (iPS-RPE), et RPE fœtale microARN (miARN), ont été comparés. 

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Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

Sous-rétinienne Transplantation de cellules souches embryonnaires humaines pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules épithéliales dans un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Recherche

Biologie

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Cultures de cellules primaires de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissection efficace et culture des cellules épithéliales rétiniennes primaires de pigment de souris

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

Ablation médiée par la nitroréductase/métronidazole et une plate-forme MATLAB (RpEGEN) pour l’étude de la régénération de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Culture primaire de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes porcines

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

Isolement de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes primaires de souris

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and vision. Proteins on the RPE apical surface are tightly associated with proteins on the photoreceptor outer segment surface, making it difficult to consistently separate the RPE from the photoreceptors/retina. We developed a method to efficiently separate the retina from the RPE of human eyes to generate complete RPE/choroid and retina flatmounts for separate cellular analysis of the photoreceptors and RPE cells. An intravitreal injection of a high-osmolarity solution of D-mannitol, a sugar not transported by the RPE, induced the separation of the RPE and retina across the entire posterior chamber without causing damage to the RPE cell junctions. No RPE patches were observed attached to the retina. Phalloidin labeling of actin showed RPE shape preservation and allowed morphometric analysis of the entire epithelium. An artificial intelligence (AI)-based software was developed to accurately recognize and segment the RPE cell borders and quantify 30 different shape metrics. This dissection method is highly reproducible and can be easily extended to other animal models.

We describe a method to efficiently separate retinal pigment epithelium (RPE) from the retina in human eyes and generate whole RPE/choroid flatmounts for histological and morphometric analyses of the RPE.

Génération efficace et cohérente d’épithélium/platures choroïdes pigmentaires rétiniens à partir d’yeux humains pour l’analyse histologique

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential application in molecular biology studies, including gene expression analyses. In the context of eye growth regulation and myopia, the RPE likely plays a role as a cellular relay for growth modulatory signals, as it is located between the retina and the two walls of the eye, such as the choroid and sclera. While protocols for isolating the RPE have been developed for both chicks and mice, these protocols have proven not to be directly translatable to the guinea pig, which has become an important and widely used mammalian myopia model. In this study, molecular biology tools were used to examine the expression of specific genes to confirm that the samples were free of contamination from the adjacent tissues. The value of this protocol has already been demonstrated in an RNA-Seq study of RPE from young pigmented guinea pigs exposed to myopia-inducing optical defocus. Beyond eye growth regulation, this protocol has other potential applications in studies of retinal diseases, including myopic maculopathy, one of the leading causes of blindness in myopes, in which the RPE has been implicated. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and&#160;once perfected, yields high-quality RPE samples suitable for molecular biology studies, including RNA analysis.

We describe a simple and efficient method for isolating cells of the retinal pigment epithelium (RPE) cells from the eyes of young pigmented guinea pigs. This procedure allows for follow-up molecular biology studies on the isolated RPE, including gene expression analyses.

Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes à partir d’yeux de cobaye

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

Modélisation et analyse de la dégénérescence rétinienne

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

Pleins feux sur l’auteur : Démêler la pathogenèse de la dégénérescence maculaire liée à l’âge et découvrir des thérapies potentielles 

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.

Méthode de caractérisation et de quantification de dépôts lipidiques basée sur l’apprentissage automatique à l’aide d’un épithélium pigmentaire rétinien dérivé d’iPSC