Name: deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies
Uploaded: 2015-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
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The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Mu&#241;iz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

培養試薬および培養プレートの調製<ol><li>幹細胞基礎培地400 mlに5倍の無血清補充を100mlを添加することにより無フィーダー幹細胞培養培地を準備する。培地は、最大2週間と6ヶ月間、-20℃で、4℃で安定である。 </li><li>市販の胚様体（EB）形成培地にRho関連、コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ROCK）阻害剤（Y-27362）の10μMの溶液を加える。 </li><li> （ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12に0.1 mMのβメルカプトエタノール、0.1mMの非必​​須アミノ酸、2mM L-グルタミン、10％ノックアウト血清代替物（KSR）および10μg/ mlのゲンタマイシンを添加することによりDMEMを分化培地を調製/ F12）。 </li><li> 1×N1サプリメント、0.1mMの非必​​須アミノ酸、250 / mlのタウリン、13 / mlのトリヨードLチロニンナトリウム塩、を20ng / mlのヒドロコルチゾン、5μg/ mlのゲンタマイシン、および15％添加したiPS-RPEの培地を調製ウシ胎児血清（FBS）&lt;SUP&gt;最小必須培地イーグル（MEM）に21。 7.4にpHを調整する。 </li><li>トリヨード-L-チロニンナトリウム塩ストック溶液を準備します。穏やかに回転させることによって1 N水酸化ナトリウムでトリヨード-L-チロニンナトリウム塩1mgを溶解させる。トリヨード-L-チロニンナトリウム塩20μgの/ mlの50ミリリットルを作るために、MEMの49ミリリットルを追加します。アリコートを準備し、必要になるまで-20℃で凍結する。最終培養培地中の所望の濃度を達成するために適切な容量を使用する。 </li><li>ヒドロコルチゾンストック溶液を準備します。穏やかに撹拌し、100％エタノール1ml中ヒドロコルチゾン1mgを可溶化する。 50μg/ mlのヒドロコルチゾンストック溶液20ミリリットルを作るために、MEMの19ミリリットルを追加します。必要になるまで-20℃で小分けして凍結。最終培養培地中の所望の濃度を達成するために適切な容量を使用する。 </li><li> DMEM / F12中1mg / mLのディスパーゼのワーキング溶液を準備します。 </li><li>マトリックスコーティングされたプレートの調製<ol><li> MOUエンゲルブレス·ホルム - スウォーム（EHS）から抽出したタンパク質基質を準備0.08 mg / mlでのDMEM / F12中でそれ自体肉腫細胞。コー​​トマトリックス溶液1mlを6ウェルプレートの各ウェル。室温で1時間コーティングしたプレートをインキュベートします。 </li><li> 1時間のインキュベーション後、過剰のDMEM / F12を吸引する。ウェルの乾燥を防ぐために無フィーダー幹細胞培養培地0.5mlを加える。マトリックスでコーティングしたプレートを使用する準備ができている。 </li></ol></li><li> DMEM / F12の2ミリリットルで、各ウェルをすすぐことによって、マイクロウェルプレートを準備します。 DMEM / F12を除去し、各ウェルにROCK阻害剤を補充したEB形成培地の0.5ミリリットルを追加します。 5分間の気泡を除去するために2,000×gでプレートを遠心する。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中でアジ化ナトリウムを2％FBSを混合することによって、FACS染色緩衝液を調製し、0.09％。 pH7.4にバッファを調整します。 </li><li> DMEM / F12に10％FBSを添加することによりトリプシン中和溶液を調製する。 </li></ol> 2.のiPS文化<ol><li> iPS細胞播種、3​​7°C​​まで暖かい無フィーダー幹細胞培地に先立ち、及びミリアンペアを持つ準備がコーティングされたプレートをTRIX。 </li><li>すぐに37℃の水浴中でIMR90-1 iPS細胞を解凍する。水浴からクリオバイアルを除去し、70％エタノールでバイアルを拭く。細胞塊の破壊を最小限にするために2ミリリットルピペットを用いて15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す。 </li><li>滴下細胞に暖かい無フィーダー幹細胞培養培地5mlを加え、穏やかに混合する。 RTで5分間300×gで細胞を遠心し、上清を除去します。 </li><li>慎重に無フィーダー幹細胞培地2mlの細胞塊を再懸濁し、基質でコーティングされたプレートのウェル中の細胞塊をシード。 5％CO 2、湿度95％で37℃のインキュベーターにプレートを置きます。 </li><li>毎日のiPS細胞培養培地を変更します。五から七日播種後の未分化コロニーを観察します。光学顕微鏡下で通過させるための準備ができている未分化コロニー（密集中心としたコロニー）を確認してください。 </li></ol> iPS細胞の3継代<ol><li>通路の開始前に、iPS細胞、ディスパーゼ溶液を、DMEM / F12、水浴中で37℃に無フィーダー幹細胞培養培地を温める。 </li><li> iPS細胞を継代する前に、領域をこすると培地を吸引することによって分化のいずれかの領域を除去する。慎重に2ミリリットルのDMEM / F12でiPS細胞をすすいでください。 </li><li> / mlのディスパーゼ各ウェルに1 MGの1ミリリットルを加え、7分間37℃でインキュベートする。吸引しディスパーゼ、ゆっくりとDMEM / F12の2ミリリットルで2回細胞コロニーをすすぐ。すすいだ後、各ウェルに無フィーダー幹細胞培養培地2mlを加える。 </li><li>を5mlのピペットを使用して、穏やかに細胞塊を形成するために、プレートのコロニーをこすり。 15ミリリットルコニカルチューブに取り外した細胞塊を転送します。細胞の次の継代をシードするのに十分な無フィーダー幹細胞培養培地を加える。 </li></ol>マイクロウェルプレートを使用したEBの4世代<ol><li> iPS細胞の単一細胞懸濁液の調製<ol><li> mediuを削除iPS細胞からmおよびDMEM / F12の2mlでiPS細胞をすすぐ。 6ウェルプレートの各ウェルでのiPS細胞にACCUTASE750μlのを追加します。細胞がプレート（約5〜10分）から分離することを可能にするために37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートする。 </li><li>優しく残りの細胞を解離するために、プレート表面に残った細胞を剥離するためにピペットを使用してください。 50ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す。 DMEM / F12の5ミリリットルでプレートをすすぎ、コニカルチューブ内の細胞ですすぎDMEM / F12を兼ね備えています。すべての可能な残余の細胞塊を除去するために40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を渡します。 </li><li> ACCUTASEを削除するには、室温で5分間300×gで細胞を遠心します。細胞濃度が約0.5〜1.0×10 7細胞/ mlになるようにEB形成培地中で細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li>トリパンブルーと血球計数器を用いて細胞を計数することにより生存細胞の数を決定します。 </li></ol></li><li> Adjustin整粒したEBを形成するためのマイクロウェル内gの細胞密度<ol><li>所望のEBのサイズを生成するためにマイクロウェルプレートの各ウェルに細胞数を調整する。均等に優しく細胞を数回ピペッティングして細胞を配布、ステップ1.9で作成プレートのマイクロウェルに細胞を追加します。 注：ウェル当たりマイクロウェルのEBのx個当たりのセルのウェルあたり必要な細胞の数=所望の数。 </li><li> 2.0ミリリットルの最終容量にウェル中のROCK阻害剤を補充したEB形成培地を調整します。静かに各ウェルにピペッティングして細胞を再配布。遠心分離機3分間100×gでマイクロウェルプレートは24時間、5％CO 2、95％湿度で37℃のインキュベーターでプレートを置きます。 </li></ol></li><li>マイクロウェルプレートから収穫したEB <ol><li>よくEBの大部分を除去するための1ミリリットルピペットで上下に培地をピペットによってマイクロウェルから収穫したEB。反転した40μmのセルを介してのEBサスペンションを渡す単一細胞を除去するために50mlコニカルチューブの上にストレーナー。 </li><li>すべてのEBを削除するにはDMEM / F12 1mlのマイクロウェルプレートを5回洗浄する。回の洗浄を収集し、反転したセルストレーナーを通過。新しい50ミリリットルコニカルチューブにアップセルストレーナー右サイドに回します。 EB形成培地で洗浄することによりEBを収集します。収量を決定するために、EBをカウント。 </li></ol></li></ol> 5.めっきしたEBと開始分化<ol><li>タンパク質マトリックス上にプレートEBは、EB形成培地+10μMのROCK阻害剤で千のEB /ウェル&lt;の密度で（ステップ1.8.1のように）6ウェルプレートをコーティングした。 24時間、5％CO 2、95％湿度、37℃でのEBをインキュベートする。 </li><li> 24時間のEBめっき後、分化を開始するために分化培地と交換してください。細胞は、さらなる分析のために収集されるまで、一日おきに分化培地の半分を変更します。 </li><li> RT-PCR、immにを実施する日にサンプル6、17、29及び60を収集特徴的なRPE遺伝子およびタンパク質の発現を検証するunocytochemistryおよびFACS。 </li></ol> 6. RNA抽出およびPCR <ol><li>市販のキットで提供される指示に従って、EBサンプルからRNAを抽出します。分光光度計を使用してRNA濃度を決定します。 </li><li> cDNAを逆転写キットに市販のRNAによると、全RNA 100ngのに逆転写を行います。 </li><li> cDNAの10マイクロモル/ 10 NGの濃度でのcDNAの10 ngの以下のプライマーを用いた（ 表1）を用いてPCRを行います。次のようにPCRを設定：72℃での最終サイクルに続いて、1分間、30秒間、72℃で、5分間、95℃でDNAを変性15秒間95℃、35サイクルで増幅し、60°C 10分間、C。 1％アガロースゲルでPCR産物を実行します。 </li></ol> 7.免疫細胞化学<ol><li> RTでPBSで2回のEBを洗ってください。 4％paraformaldにRTでのEBを修正10分間ehyde。 RTでPBSで一度すすぐ。 PBSで保管してサンプルを4℃で染色に使用するまで。 </li><li>染色日には、固定および透過試薬で固定した細胞を扱う。 RTで1時間（透過処理溶液中の10％ヤギ血清）をブロッキング溶液でサンプルをインキュベートする。 </li><li>抗Pax6の（1:10）、抗RX（1：200）で示される希釈度以下の一次抗体を使用して透過処理溶液中の10％ヤギ血清で免疫化学を実行し、抗MITF（1:30）、および抗ZO1（1：100）。 4℃で対応する抗体O / Nを有するサンプルをインキュベートする。 </li><li>翌日、細胞からの一次抗体を除去し、PBSでサンプルを3回すすいでください。 RTで1時間フォア結合二次抗体とサンプルをインキュベートする。 </li><li>細胞から二次抗体を除去し、PBS中のサンプルを3回すすいでください。カバーが封入剤を含むDAPIをガラススライド上にスリップマウントサンプルは暗室でO / Nを設定することを可能にする。染色を可視化する蛍光顕微鏡を使用してください。 </li></ol> FACS分析のために8染色<ol><li> PBS中で培養したEBを2回洗浄します。単一細胞懸濁液を作製するために5〜10分間0.25％トリプシンを0.5mlとしたEBをインキュベートする。トリプシン中和溶液（1ml /ウェル）でトリプシンを中和する。 </li><li> 10分間、600×gでの15mlコニカルチューブと遠心分離機に単一細胞懸濁液を移す。 </li><li>上清を捨て、チューブ中の細胞にDMEM / F12の10ミリリットルを追加します。穏やかに細胞を混合することが反転。 600×gで遠心分離する。遠心分離後、上清を廃棄し、FACS染色緩衝液中で細胞を再懸濁する。 </li><li>細胞の総数を数えます。 10分間600×gで遠心分離する。遠心分離廃棄上清の後。すぐに4％パラホルムアルデヒドの0.5ミリリットルを添加して細胞を固定します。穏やかにボルテックスでよく混ぜる。 20分間、4℃で細胞をインキュベート。 </li><li> 10分間600×gで遠心分離し、削除する上清。渦穏やかに細胞ペレットを破壊する。冷却された透過化溶液1mlを添加して細胞を透過性。ボルテックスは穏やかに混合し、30分間氷上でインキュベートする。 </li><li> 10分間600×gで遠心分離し、上清を除去します。 FACS染色バッファーに再懸濁の3ミリリットルを追加します。 1より多くの時間のために、この手順を繰り返します。 5×10 6細胞/ mlの最終濃度でFACS染色緩衝液中で細胞を再懸濁。 </li><li>各マイクロチューブに100μlの細胞懸濁液（0.5×10 6細胞）を転送し、一次抗体の推奨されるボリュームを追加。 Pax6のために、細胞懸濁液を100μlのPE抗Pax6のの5μlを添加する。 MITFのために、細胞懸濁液を100μlの抗MITFの5μlを添加する。 </li><li>混合し、60分間RTでインキュベートする。 FACS染色バッファーの3ミリリットルを追加します。 10分間600×gで混合し、遠心。上清を除去し、さらに2回のために8.16を繰り返します。 </li><li> MITF染色のために、二次antiboで細胞をインキュベートdyは、1の希釈でヤギ抗マウスアレクサフルオロ488：4°Cで1時間、2000。 Pax6の染色のために、このステップを回避する。 </li><li> 10分間600×gでのFACS染色バッファーと遠心機の5ミリリットルで細胞を洗浄。 2回以上のプロセスを繰り返します。 </li><li>細胞ペレットを破壊する優しくFACS染色バッファーと渦の500μlの細胞を再懸濁。サンプルは、フローサイトメトリー分析のために準備ができている。 </li></ol> 9. IPS-RPEの単離および培養<ol><li> 29日目に、慎重に200μlのピペットチップを用いて培養プレートから選択着色されたコロニーの周囲に切断した。 15ミリリットルコニカルチューブに浮動コロニーを転送します。 RTで10分間600×gでコロニーを遠心し、上清を除去します。 </li><li> 10分間600×gでDMEM / F12と遠心機の10ミリリットルで細胞コロニーを懸濁します。上清を取り除きます。 </li><li> 7-10分間37℃で0.25％トリプシン2mlを有するコロニーをインキュベートすることによって、単一細胞懸濁液を調製。穏やかにコロニーを解離細胞懸濁液をボルテックス。 </li><li>のiPS-RPE培地2mlを添加することによりトリプシンを中和する。 10分間600×gで遠心分離し、上清を捨てる。のiPS-RPE培地2ml中で単一細胞を再懸濁する。 37℃、5％CO 2および湿度95％のインキュベーター内タンパク質マトリックスコートした6ウェルプレートを所定の位置に細胞を移す。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

細胞療法のための多能性幹細胞の完全な約束を実現するためには、一貫して再現可能な方法でそれらの分化を調節することが必要である。このレポートでは、マイクロウェルプレート技術を使用してサイズ制御したEBを形成RPEに向かって分化を開始し、RPEのタンパク質と遺伝子マーカーを同定するためのプロトコルについて説明します。 インビトロ分化を同期させるために、EBの均一?...

人工多能性幹（iPS）細胞は、外因性因子1成体細胞を再プログラミングすることによって誘導される多能性幹細胞の一種である。対照的に、胚性幹細胞（ESC）、多能性幹細胞の別の型は、胚盤2-3の内部細胞塊から生成される。それらの異なる起源にもかかわらず、iPS細胞およびESCをインビトロおよび任意の細胞型4-5に分化する能力において複製するそれらの無制限の容量が同程度である。 iPS細胞のこれらの特徴は、彼らにパーソナライズされた再生医療への応用のための理想的な候補を作る。最近の研究努力は、網膜色素上皮（RPE）6-11を含む特殊な成体細胞を製造するための堅牢な分化プロトコールを開発することに焦点を当てている。 のiPS由来細胞の潜在的な臨床用途のために、その特定の細胞型に向かう分化が不可欠である。様々な方法があるその効率6-7、12-16で大きく変化したRPEに両方のESCとのiPS細胞の監督分化のために公開。我々はまだ開発または分化中の細胞/組織の運命を支配する分子事象の多くは知らない。近年では、努力は、できる限り胎生発育を模倣することができる分化プロトコルを開発する試みがなされてきた。胚盤胞段階の間に、幹細胞のコミットされていない集団の三次元微小環境で一緒にいる。そのように、様々な戦略を組み立てESC / iPS細胞を作成し、三次元でそれらを成長させるために適用した。これらの幹細胞集合体は、胚様体（EB）と呼ばれている。研究は、幹細胞のEBの分化は胚発生の初期段階を模倣し、自発的にその外面に原始内胚葉を生じ得ることを示した。 EBの開発が進むにつれてその後、3つのすべての生殖系列の分化細胞の表現型は17-18が表示されます。目erefore、EBをベース分化プロトコルは、ESC / iPS細胞のin vitroでの分化のために多くの注目を集め多能性幹細胞13からRPE生成のための良い候補であるしている。 EBは、ESC / iPS細胞からのいくつかの方法を用いて製造することができる。最初に、EBを付着コロニーを掻き非接着懸濁培養でそれらを維持することによって作製した。しかし、このアプローチは、低い再現性を引き起こすEBの不均一な集団を生じる。ハンギングドロップ細胞培養およびマイクロウェルベースの​​EB形成が非常に再現性が定義された大きさの均一なEBをを得たEB形成のための他の一般的な技術である。さらに、マイクロ技術は少ない労力で凝集体の大多数を得ることができる。 のEB内の細胞の分化は、細胞外および細胞内微小環境から形態形成の合図の多重によって調節される。月における分化とは対照的にフォーマットolayer、EBは、17を発生する細胞と細胞間シグナル伝達の複雑なアセンブリのためのプラットフォームを提供する。興味深いことに、個々のEBを作製するために使用される多能性幹細胞の数は、細胞の運命に影響を与えることが観察された。 1000セルEBは赤血球系統20に向けてプッシュされ、一方、例えば、ヒトESCの造血分化の研究では、500セルEBは骨髄系統への分化を促進したことが観察された。別の研究では、より小さなEBは、神経外胚葉分化11、17に向けて推進し、より大きなEBを、一方、内胚葉分化を支持した。 これらの過去の研究は強く個々のEBを作製するために使用されるESC / iPS細胞の数は、任意の細胞型への分化に基づいたEBに影響を与えることを示唆している。しかし、我々の知る限り、RPEに分化するために、その傾向にEBをサイズの影響を解明した電流の研究はありません。本研究の目的は、影響を特徴付けることである網膜色素上皮（のiPS-RPE）分化およびRPE系統に向かって方向付け分化したEBを作るための最適な細胞数を識別するために - 人工多能性幹（iPS）細胞へのEBの大きさ。

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 media + 5x supplement</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>Non essential amino acids</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Knockout serum replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM media</td><td>Life Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>N1 supplement</td><td>Sigma</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Triiodo-L-thyronine sodium&amp;nbsp; salt</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 plate</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27940</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5893</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-PAX6 antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-RX antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab23340</td><td></td></tr><tr><td>Mouse&amp;nbsp; Anti-MITF antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-772-P</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-ZO-1 antibody</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Promega</td><td>M7502</td><td></td></tr><tr><td>High capacity RNA to cDNA kit</td><td>Life Technologies</td><td>4387406</td><td></td></tr></tbody></table>

deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

この実験では、iPS細胞を培養したEBからRPE細胞系統に分化した。制御されたサイズのEBをマイクロウェルプレートを用いて形成された。 図1 EBの形成に見られるように、マイクロウェルプレート中で均質であった。これらのEBは、次いで（ 図2）を回収し、6ウェルプレート上にプレーティングした。 RPEは、古典的な六角形の形態、色素沈着、およ?...

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Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

このレポートの目的は、胚様体の異なるサイズを使用して人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）を導出するためのプロトコルを記述することである。

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

10.5K ビュー.  U.S. Army Institute of Surgical Research. このレポートの目的は、胚様体の異なるサイズを使用して人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）を導出するためのプロトコルを記述することである。 

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Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

発生生物学

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

医学

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative therapies. This protocol describes a simpler, robust, and stepwise method of generating retinal organoids in a hybrid culture system consisting of adherent monolayer cultures during the first 4 weeks of retinal differentiation till the emergence of distinct, self-organized eye field primordial clusters (EFPs). Further, the doughnut-shaped, circular, and translucent neuro-retinal islands within each EFP are manually picked and cultured under suspension using non-adherent culture dishes in a retinal differentiation medium for 1-2 weeks to generate multilayered 3D optic cups (OC-1M). These immature retinal organoids contain PAX6+ and ChX10+ proliferating, multipotent retinal precursors. The precursor cells are linearly self-assembled within the organoids and appear as distinct radial striations. At 4 weeks after suspension culture, the retinal progenitors undergo post-mitotic arrest and lineage differentiation to form mature retinal organoids (OC-2M). The photoreceptor lineage committed precursors develop within the outermost layers of retinal organoids. These CRX+ and RCVRN+ photoreceptor cells morphologically mature to display inner segment-like extensions. This method can be adopted for generating retinal organoids using human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). All steps and procedures are clearly explained and demonstrated to ensure replicability and for wider applications in basic science and translational research.

This protocol describes an efficient method of differentiating hiPSCs into eye field clusters and generating neuro-retinal organoids using simplified culture conditions involving both adherent and suspension culture systems. Other ocular cell types, such as the RPE and corneal epithelium, can also be isolated from mature eye fields in retinal cultures.

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

ヒト胚性幹細胞からの3D神経網膜分化の促進

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of retinopathy. Unfortunately, ethical barriers hinder the collection of evidence from humans. Recently, numerous studies have shown that human pluripotent stem cells (PSCs) can be differentiated into retinal organoids (ROs) using different induction protocols, which have enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies. This study describes an optimized induction protocol to generate neural retina (NR) that significantly reduces the probability of vesiculation and fusion, increasing the success rate of production until day 60. Based on the ability of PSCs to self-reorganize after dissociation, combined with certain complementary factors, this new method can specifically drive NR differentiation. Furthermore, the approach is uncomplicated, cost-effective, exhibits notable repeatability and efficiency, presents encouraging prospects for personalized models of retinal diseases, and supplies a plentiful cell reservoir for applications such as cell therapy, drug screening, and gene therapy testing.

著者スポットライト:疾患モデリングのためのシンプルで効率的な神経網膜オルガノイド生産

The present protocol describes an optimized 3D neural retina induction system that reduces the adhesion and fusion of retinal organoids with high repeatability and efficiency.

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

ヒトiPS細胞のマイクロRNA発現プロファイル、IPから派生網膜色素上皮、および胎児の網膜色素上皮

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

要約

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幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデルフィーダーフリー培養条件

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニアリング

懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

ヒトiPS細胞のマイクロRNA発現プロファイル、IPから派生網膜色素上皮、および胎児の網膜色素上皮

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

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人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

ヒトiPS細胞のマイクロRNA発現プロファイル、IPから派生網膜色素上皮、および胎児の網膜色素上皮

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ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニアリング