この作品は、CASS財団科学と医学の助成金によって支えられて; （MB）;オーストラリアプロジェクト無償の国民の健康と医療研究評議会（KLS、338516）;とビクトリア州政府の業務インフラ支援プログラム（オーストラリア）。

1。細胞、培地、および試薬の調製を<ol><li>メチルセルロース含有培地の調製<ol><li> 250mlフラスコ中の滅菌ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（無添加）100mlに1.5gのメチルセルロースを溶解する。 </li><li> 5分間電子レンジで低い上に溶液を加熱し;吹きこぼれないように注意してください。 </li><li>メチルセルロース粉末が半溶解された後、125ミリリットルにボリュームを取るためにきれいな磁気攪拌機やメディアを追加します。 </li><li>ミックス、反転、および4℃で一晩撹拌し、1.5時間、室温で撹拌する。 </li><li> 2,300×gで均等に4 50mlチューブと1.5時間の遠心に溶液を分割します。 </li><li>最大3ヶ月間、4℃で透明、高粘性の滅菌50mlチューブに上清（株式の約百分の90から95まで）、分量、店舗を収集します。 </li></ol></li><li>文化や細胞の標識<ol><li> TIの中で単層での卵巣癌細胞株を維持する10％ウシ胎児血清（FBS）、2mMのLを補充した：37°C、（OVCA429とOVCA433細胞株18 M199 KGNセル17とMCBD110ためDMEM）適切な増殖培地中、5％CO 2でssue培養インキュベーター-グルタミン、および1％ペニシリン - ストレプトマイシン。 </li><li> M199でLP9ヒト中皮細胞を維持する：ハムのF12培地、15％FBS、10 ng / mlの上皮成長因子（EGF）を含有し、400 ng / mlのヒドロコルチゾン、37℃、5％CO 2インキュベーター中。 </li><li>希望のフラスコの大きさの種細胞と約75％の集密度まで成長する。 0.05％トリプシン/ EDTA、5分間、186×gでスピンコートを用いてトリプシン処理により細胞を回収し、PBSで2回細胞ペレットを洗浄する。 </li><li>血球計数器を用いて細胞を数える。 </li></ol></li><li>オプションの蛍光細胞標識法<ol><li>予め温めたPBS/0.1％のBSAを1ml中、1×10 6細胞/ mlの最終濃度で再懸濁し、癌細胞。 </li><li> 5 mMストックセルTrの2μl加えエースCSFE溶液（または長期に保持されている他の好ましい細胞ラベル）、10μMの最終濃度で細胞にし、水浴中で10〜15分間37℃でインキュベートする。 </li><li>遠心分離により、10％FBSおよび再ペレットを含む氷冷培地1mlで反応をクエンチした。適切な予め温めた成長培地10mlに再懸濁する（ステップ1.2.1を参照）。 </li><li> 37℃、5％CO 2で75cm 2のフィルターでキャップされたフラスコ培養に種子細胞。 </li><li>蛍光標識のレベルは検出のために適切であることを確認するために、蛍光顕微鏡下で細胞を確認してください。細胞は、約75％の密集度、収穫に達し、ステップ1.2.3および上記の1.2.4のように数えたら。 </li></ol></li></ol>メチルセルロース中スフェロイドの2。世代<ol><li>スフェロイドの生成に必要な第1の卵巣癌細胞の体積を計算し（300,000細胞の総数は、それぞれ完全な96ウェルプレート実験のために必要とされる）。いいえテ：ここで提示異なる細胞株を用いた場合、均一な球状体の生成のための細胞密度は、各ラインのために最適化される必要があり得る。 </li><li>メチルセルロース培地中の細胞の希釈を計算するには、まず、15ミリリットルから（ステップ2.1）に必要な細胞量を減算する。 </li><li>メチルセルロースの株式各細胞株の培養培地に適切な量の解（最終20％メチルセルロースにするために）、15ミリリットルに等しいマイナス細胞容積の3ミリリットルを加え、穏やかに反転させることによって十分に混和する。 </li><li>メチルセルロースを含む培地に300,000細胞を加え、穏やかに反転させることによって十分に混合した。 </li><li> 37℃で96ウェル凹の底培養プレートと文化の各ウェルに（3000細胞/ウェルの合計）セル/メチルセルロース/メディアミックスのピペット150μL、5％のCO 2 1-4日間か均一な球状体が形成されるまで（1回転楕円体/ウェルは、一般的に観察される）。 </li></ol> 3。RTCAの細胞浸潤アッセイ NOTE：インピーダンス測定値はセルインデックス（CI）、細胞状態を表す測定されたセルのインピーダンスの相対的な変化である無次元パラメータとして表現さ​​れる。 Microsoft Excelなどのスプレッドシートに分析のために、データをインポートし、。 <ol><li>プレートの準備<ol><li>一度に4ウェルの基で働く、全表面積を覆うことを保証するために、16ウェルRTCA CIMプレートの上部チャンバーの各ウェルに50μlの基質（無血清培地中で1:10希釈）を追加。任意の余分な水分を取り除くために、ゆっくりと、すぐに行列の30μLを削除しますが、。 </li><li>組織培養インキュベーターで使用する前に4時間、37℃でプレートをインキュベートする。 </li><li>下部チャンバーに（あなたの実験計画どおり）は、血清の有無にかかわらず、上室に各がん細胞株に対して適切な無血清培地（SFM）を30μlとメディアの160を添加する。 </li><li>上室とequilibrに下室をクリックして、CIMプレートを組み立てる組織培養インキュベーター中で1時間、37℃のインキュベーター中で食べた。 </li></ol></li><li> RTCAインストゥルメントのプログラミング<ol><li> RTCAを開き、「レイアウト」タブを選択します。すべての実験ウェルを強調表示します。 </li><li>右ウェル上でクリックして、「井戸をオンにする」を選択します。必要に応じて、その後の実験条件およびセル名を入力します。 </li><li>プログラムにステップまたはサブステップを追加するには、「ステップを追加する「オン」スケジュール]タブを選択し、右クリックし。最初のステップは、「ステップを追加」を選択したら、自動的にプログラムに組み込まれている事前にプログラムされた背景スイープです。 </li><li> LP9単層の確立中に測定値を記録しますRTCAプログラムのステップ2のために、所望の番組の詳細を入力します。 」「間隔」タブを選択し、&#39;15分を入力することにより、インピーダンスの測定値の間の時間間隔を追加します。 「期間」タブANを選択することで、実験期間を追加D 12から24時間の間の時間を入力する。 </li><li>その後の工程を追加するには、「ステップを追加し「オン」スケジュール]タブを選択し、右クリックし、上記のように、追加の手順の詳細を入力します。 RTCAプログラムのステップ3は、回転楕円体の侵略の際に読み取りを行うための道具を指示します。 「時間」タブの下に間隔」タブと&#39;48時間 &#39;の下に&#39; &#39;5分を入力します。 </li><li>メニューバーの「プレート」を選択し、保存します。 </li></ol></li><li>スフェロイド侵略のLP9単層および測定の生成<ol><li>上記の手順3.2からRTCA機器とオープンプログラム中のCIMプレートを置きます。セルを追加する前に、メニューバーの「実行」した後、「スタート」を選択します。背景スイープは自動的に（RTCAソフトウェア命令のステップ1）が実行されます。 </li><li>組織培養フードの背景スイープと場所次の機器からのCIMプレートを取り外します。 </li><li>プレート50,000 LP9細胞が各ウェルのCIMプレートの上部チャンバーに160μlのSFMに懸濁した。 </li><li> RTCAの機器にプレートを置き、LP9単層で一晩（RTCAプログラムのステップ2）を確立している間の測定値ごとに15分を取る。 </li><li>上記の手順2の下で生成された収穫癌スフェロイド」メチルセルロース中スフェロイドの生成 &#39;、。 <ol><li>無菌的に、1ミリリットルピペットチップの上から1ミリメートルをカットし、静かに、各ウェルの内容を取得するために使用する。滅菌チューブに移します。 </li><li>遠心分離機は、8分間120×gで回転楕円体、そし​​て穏やかな吸引によりメチルセルロースを含む培地を除去します。 </li><li>各洗浄後スフェロイドをペレットに8分間120×gで遠心分離し、PBSで2回以上のスフェロイドを洗ってください。 </li><li>各実験ウェルについて、FBSを含まない培地を160μlの10スフェロイドの合計を懸濁します。 </li><li>メニューバーから「実行」を選択し、チェック＆によってRTCA実験を一時停止＃8216; &#39;一時停止します。測定器からのCIMプレートを取り外し、組織培養フード内に配置します。を吸引し、各ウェルからの培地を切り、LP9のみのコントロールウェルのための回転楕円体含有培地（160μL中10球）や新鮮な培地と交換してください。 </li></ol></li><li> RTCA機器にプレートを返します。メニューバーから「実行」と「ステップの中止」にチェックを選択します。プログラムは自動的に次のステップに移動します。実験を再開するには、メニューバーから「実行」と「スタート/続行」をチェック]を選択します。 RTCAプログラムステップ3が開始されます。 </li></ol></li><li>データ解析<ol><li>回転楕円体の細胞浸潤性のレベルを決定するために、唯一の各時点で卵巣癌細胞株について得られた個々の測定値からLP9単層について得られた値を減算します。 </li><li> 「回転楕円体の侵入を &#39;プロットするには、sが、スフェロイドをプレートに添加した時点までのすべての値を正規化する&#39;0 &#39;にその時点をetting。 </li></ol></li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium.">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).</li><li>Nishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+steroidogenic+human+granulosa-like+tumor+cell+line,+KGN,+that+expresses+functional+follicle-stimulating+hormone+receptor.">Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor.</a> Endocrinology. 142, 437-445 (2001).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outcome+of+heregulin-induced+activation+of+ovarian+cancer+cells+depends+on+the+relative+levels+of+HER-2+and+HER-3+expression.">The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression.</a> Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).</li></ol>

Open access fee paid for by ACEA Biosciences, Inc. and MIMR-PHI Institute of Medical Research.

侵入卵巣癌細胞は、線維芽細胞、脂肪細胞及び中皮細胞を含む、腹膜の表面に種々の細胞型と相互作用し、癌細胞と腹腔細胞との間の双方向通信は、転移プロセス2を駆動する際に重要な役割を果たしていると考えられている。一度習得し、本明細書に記載されるプロトコルは、腹膜微小環境内のこれらの相互作用の研究に容易に適応可能である、 例えば 、外因性のサイトカイン、成長因子、またはCIMウェルプレート又は遺伝子操作の上側または下側のチャンバーに特異的阻害剤の添加を介して腹膜癌または細胞株の。さらに、この方法は、腹腔内の転移性病変の確立を支配する調節シグナルおよび細胞間相互作用に直接洞察を得るために、悪性腹水および/または原発性腹膜細胞から新たに採取した原発性卵巣腫瘍細胞を使用することができる<s&gt; 2まで。 単一細胞またはスフェロイドの浸潤能を測定するためのRTCA機器を使用することにより、従来の単一のエンドポイントアッセイおよびタイムラプス画像解析に比べていくつかの利点を提供しています。 RTCA機器は、数時間または数日間ことができるアッセイの過程にわたって連続して定義された間隔で細胞浸潤を測定します。これは、単一のエンドポイントアッセイの限界を克服し、経時的浸潤率の変化の決定を可能にする。例えば、単一のエンドポイント（ 図2）での異なる癌細胞株からの侵略データなどを調べて 、3時間後には、KGNとOVCA433細胞がOVCA429細胞よりもはるかに侵襲的だった、誤った結論につながっている可能性があります。この技術の別の利点は、RTCA器具は電気インピーダンスの変化を測定することである。これは、アッセイは、細胞フェンに対する意図しない影響を与える可能性があり、外因性の薬剤で細胞を標識することなく実行することができることを意味OTYPEまたは関数。それはそれらのインビボ性質上2の反射ではない分子および表現型変化を導入することを避けるように最小限に操作を維持することが不可欠であるとの悪性腹水から誘導された原発性卵巣癌細胞を研究する場合に特に重要になります。さらに、RTC​​A機器の使用は、タイムラプス顕微鏡検査に関連した分析を消費する時間を回避するが、アッセイの最適化のための重要な実験のWindowsの迅速な決定を可能にするだけでなく、リアルタイムで定量的なデータの収集を可能にします。スフェロイド浸潤に対する因子の範囲の効果を比較する際の異なる要因が経時的に異なる時点で、または大幅に異なるプロファイルでその最大の効果を発揮し得るので、これは特に有用である。 このプロトコルは、変更が（ 例えば 、異なるECM行列、異なる癌細胞株、または異なるターゲットセルの使用に適しているものの、そうする場合のls）、様々な実験条件は最初に最適化しなければならないことに留意することが重要である。例えば、回転楕円体侵入の研究を開始する前に、癌細胞/ CIMプレートの最適数は、ウェルまず、単層培養中の細胞数滴定のアッセイによって決定されるべきである。ウェルあたりに使用するスフェロイドの最適数は、この分析に基づいている。最初に生成するとき、例えば、現在の方法では、スフェロイドは、約3,000個の細胞をそれぞれ含む。初期の細胞数滴定が単層中の30,000細胞を分析し、侵入での検出に最適であることを示している場合には、10スフェロイドがよく、CIMプレート当たりに添加されています。共培養実験を行うときは、この結果を混乱させる可能性があるのでさらに、それは、これらの細胞は、本質的に侵襲的であるかどうかを決定するために、別々に「標的」細胞単層の挙動を研究することが重要である。実証例では、癌スフェロイドLP9細胞monolaの上にメッキされるFBSとないヤーは、化学誘引物質としてだけでなく下部に追加。並行して、LP9細胞は、それぞれの処理条件の下で、単独で培養される。 細胞スフェロイドの浸潤能を検討する場合も同様に、それは2つの動作を区別するために、同様に彼らの回遊能力を検討することも重要です（移行はしませんがすなわち侵略は、ECMバリアのタンパク質分解が必要）。これを行うには、ECM関門（ステップ3.1.1 - 3.1.3）を省略し、所定の位置に、ECM障壁と並行して分析を行っています。所望であれば、後者の「侵入」の尺度は、前者の「マイグレーション」の小節に補正することができる。細胞を、底部チャンバ内に侵入した後、それらの付着、拡散、膜の下側増殖の変化は、変化に寄与することができる：最後に、電気インピーダンスの測定値から得られた情報が、範囲が限定されていることに留意することが重要でインピーダンスREAへこみ。スフェロイド包括的に細胞挙動を評価するために、スフェロイド細胞生存率、接着、遊走、および形態の他のアッセイと組み合わせて使用​​するため、この方法が最も有益である。スフェロイドの形態学及び健康の定性的評価は、浸潤の定量的RTCAアッセイと並行して行うことができるように、例えば、理想的には、完全にスフェロイド中皮相互作用を理解するために、別個の共培養物はまた、標準的な位相差顕微鏡下で定期的に画像化されるべきである。任意のラベリングステップが実行される場合、それらは回転楕円体から脱凝集および非標識中皮細胞と相互作用するように、単一の癌細胞の挙動は、蛍光顕微鏡下で測定することができる。第二の細胞型と共培養するとき、蛍光癌細胞を標識するという付加的な利点は、それが癌細胞のみが細胞とECMの障壁を通って侵入したことを確認することが可能であるということである。 <p class="jove_content"&gt;要約すると、この方法では、中皮およびECM障壁の卵巣癌スフェロイド侵略のハイスループット定量分析を表しています。ウェルCIMプレートの上側または下側チャンバーへの外因性サイトカイン、成長因子、または特異的阻害剤の添加により、この方法は、中皮およびマトリックス障壁を超える侵入卵巣癌スフェロイド細胞間の相互作用を調節する因子の迅速な判定を可能にする時間。

卵巣癌は、婦人科の癌のすべての1の最も高い死亡率を有する。世界的に、〜23万例や疾患による10万人以上の死亡者は毎年1があります。癌が既に転移した後の治療は、化学療法に対する耐性の増加によってさらに複雑であり、予後は2悪い場合ほとんどの患者（&gt; 75％）は、診断されている。ステージIII〜IVの転移性疾患の患者だけ30から40パーセント3の5年生存率を持っている。従って、効果的に進行した疾患を治療するために、卵巣癌転移の基礎となる細胞挙動のより良い理解のために緊急の必要性がある。 卵巣癌転移の現在のモデルは、腫瘍の行動への影響の異なる微小環境で発生し、その各々の転移過程でいくつかのステップを提案する。転移性卵巣癌細胞が最初に原発腫瘍部位から脱落し、nonadherで生き残るされる単一細胞または三次元多細胞構造のような腹膜液内のENT状態は、多細胞凝集体またはスフェロイド2,4,5と称される。懸濁液中のスフェロイドを形成しない細胞がアノイキス2,4,5の影響を受けやすくなります。スフェロイドも残存病変やがん2,4,5のその後の再発に貢献し、化学療法への抵抗の増加を示す。卵巣癌転移の第二の重要なステップは、腹膜壁と大網5,6内で確立二次腫瘍に自由に浮遊クラスタから凝集体の遷移である。細胞-細胞および細胞-基質相互作用は凝集体の形成、生存および腹膜4月11日の中皮ライニングによって生成細胞外マトリックス（ECM）への接着に関与している。まだ、これらのプロセスは、ほとんどわかっていない。 卵巣癌の普及に関与するメカニズムを定義するには、スフェロイドはGENERすることができますated培養培地12,13にメチルセルロースを添加することによって、又は低付着性プレート2,14上で細胞を培養することによりいずれかの懸濁液中の細胞を維持し、非接着性の培養方法を用いて確立された癌細胞株から。このようにして培養した場合に、卵巣癌細胞は、 インビボで見出さ2,14腫瘍の凝集体と同様、細胞、分子および生化学的特性を示す多細胞凝集体またはスフェロイドへと集合する。形成された後、回転楕円体は、その後非付着性培地から収穫することができ、更なる機能的研究のための種々の固体表面上に再播種し。これは正確な腹腔内液のような非接着性の環境内転移性卵巣癌細胞の挙動をモデル化していない単層培養でのアッセイ、以上の進歩を表す。 癌スフェロイドの侵入能力は、ボイデンチャンバー2内の伝統的なエンドポイントアッセイで評価することができる</su卵巣癌細胞の浸潤が経時的に動的なプロセスであるように、p&gt;が、このアプローチは、誤解を招くことができる。最近のリアルタイム方法は、卵巣癌スフェロイドを15,16に侵入することにより、中皮細胞クリアランスのタイムラプスビデオ顕微鏡を用いてなされたものであり;しかしながら、時間経過のデータの分析は時間がかかり、主観的であることができる。ここで、実時間における卵巣癌スフェロイドの侵襲的挙動を評価するための迅速で定量的な方法が記載されている。まず、回転楕円体、中皮細胞モデルは、多細胞スフェロイドに接続し、二次腫瘍を形成するために、腹膜ライニングに侵入する際、卵巣がんの転移の段階を表す設立されました。次いで、リアルタイムセルアナライザー（RTCA、会社の詳細については材料の表を参照）のための方法論は、スフェロイドとして増殖させ、異なる卵巣癌細胞株の浸潤能の定量的リアルタイム測定を実施するように適合され、このモデルにおいて試験した。 RTCA中でのインストゥルメント、細胞応答は、電気インピーダンスの変化を測定することによって、外因性の標識を必要とせずに、アッセイの過程にわたって連続的に監視される。特別に設計された培養プレートを2ウェルチャンバー（「CIM」プレート）の上部及び下部チャンバーの間の界面で微多孔膜の下に位置する金被覆の微小電極を有する。細胞は、ECMまたはECM /携帯障壁を侵入するように、下部チャンバー内の電極の位置は、電気インピーダンスの変化を測定することができる。各CIMプレートのウエルの2室間の膜界面は、まず、目的のECM成分でコーティングされている。スフェロイド中皮細胞モデル系において、インターフェースは、「ヒト中皮のコンフルエントな単層を、続いて、腹膜の中皮ライニングの根底にある複雑なECMを模倣するために、（会社の詳細については、材料表を参照）マトリゲルの層で被覆されているターゲット &#39;細胞。最後に、予備形成された卵巣癌スフェロイドは広告ですDED。卵巣癌スフェロイド細胞が活発に下部チャンバーに到達し、電気インピーダンス測定値を変化させるために、標的細胞膜及びマトリックスを介して侵入しなければならない。自分で標的細胞はまた、それらがマトリックス層を通って侵入し、このアッセイにおいて使用するのに適していないことを保証するために評価される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">xCELLigence RTCA DP Analyser</td>
			<td style="width:291px;">ACEA biosciences</td>
			<td style="width:87px;">RTCA DP</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">xCELLigence CIM plates&#160;</td>
			<td>ACEA biosciences</td>
			<td>5665817001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell TraceTM CFSE&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylcellulose (4000 centipose)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:293px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11966-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Medium 199&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:87px;">11150067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ham&#39;s F-12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:87px;">11765062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:291px;">Gibco-Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well concave culture plate&#160;</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>650185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LP9 Human mesothelial cell line</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research&#160;</td>
			<td>AG07086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Growth Factor-reduced Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ovarian cancer spheroid attachment and invasion of mesothelial cells in real time

卵巣癌は、腹膜流体中に流しや腹膜内遠位部位に分散させることにより転移する。癌細胞は本質的に付着し、二次腫瘍を形成するために、腹膜内層に侵入することにより、転移過程に寄与する多細胞構造に凝集として単層培養物を正確に、非接着性環境内での癌細胞の挙動をモデル化しない。卵巣癌転移、多細胞凝集物、またはスフェロイドのこの重要な段階をモデル化するために、非付着条件下で維持確立卵巣癌細胞株から生成することができる。 インビボでの腫瘍細胞で検出された腹膜微小環境を模倣するために、回転楕円体、中皮共培養モデルを確立したスフェロイドを予め形成する細胞外マトリックス上に形成されたバリアヒト中皮細胞単層の上にメッキされる。方法は、次いで、定量リアルタイムに行うことリアルタイムの細胞分析装置を使用して開発されたスフェロイドとして増殖させ、異なる卵巣癌細胞株の浸潤能の時間測定値。このアプローチは、従来のエンドポイントアッセイおよび顕微鏡画像解析より面倒即座に勝るいくつかの利点を有する長期間にわたって浸潤の連続測定を可能にする。要するに、この方法は、時間をかけて、中皮およびマトリックスの障壁を通って侵入する卵巣癌細胞スフェロイドとの間の相互作用を調節する因子の迅速な判定を可能にする。

卵巣癌スフェロイドは、懸濁液中または悪性腹水2,14からの原発性腫瘍細胞を採取することによって、それらを培養することにより細胞株の多くのタイプから生成することができる。ここでは、2つの上皮性卵巣癌細胞株OVCA433とOVCA429、および卵巣顆粒膜細胞腫瘍株、KGNは、回転楕円体（ 図1A）を生成するために使用されている。メチルセルロースの添加により粘性なされた培地中に懸濁しながら、この方法では、細胞をU底ウェル中で培養される。これらの条件下では、多くの卵巣癌細胞スフェロイド13を形成するために凝集する固有の能力を示す。メチルセルロース/培地に懸濁し、一晩培養後、3つ全ての細胞株は、直径が約400-500ミクロン（ 図1A）のコンパクトな回転楕円体構造を形成した。一方、RTCA CIMプレートは、まずマトリックス及びヒトのMES次いで、コンフルエントな単層を有する多孔質膜界面をコーティングすることにより、調製されるothelial細胞（ 図1B）。一旦形成されると、球状体は、その後、準備されたCIMプレートに移す。収穫癌スフェロイドはLP9単層の頂部上に播種し、下記のように評価される。並行培養の標準的な位相差顕微鏡下の画像（または蛍光顕微鏡下で、オプションの細胞標識ステップが続いていた場合）は、RTCAデータ（ 図1C）の解釈を支援するために、定期的に行われている。 これは、癌細胞株の浸潤の基礎レベル、ならびに化学誘引物質誘発性浸潤の両方を評価するために有益である。典型的には、基底侵襲性の両方上部及び下部チャンバーにSFMを添加することによって測定される。多くの潜在的な化学誘引物質を含有する完全培地（10％FBS）は、「化学誘引物質誘発&#39;浸潤（ 図2）を調べるために、現在の例で使用されている。単独LP9中皮細胞の平行研究は、これらの細胞が最小限であることが確認され基礎又は「化学誘引物質」誘導条件下のいずれかで2日間vasive、したがって卵巣癌細胞（ 図2Aおよび2B）と共培養アッセイにおいて使用するための良好な細胞型であった。対照的に、3つの細胞株のいずれかを用いて生成された卵巣癌スフェロイドは化学誘引物質（FBS）（ 図2A〜2C）に向かって侵入する能力を示した。伝統的なエンドポイントアッセイを介しRTCAリアルタイム器具を使用することの主な利点は、細胞/スフェロイド挙動の変化を経時的に定量することができることである。 2日間のアッセイにわたって、KGN、OVCA429、OVCA433および細胞株はすべて、（セルインデックスを増加させることによって示される）化学誘引なく、浸潤の低い基礎レベル（ 図2C）に向かって侵入する能力を示した。曲線（ 図2C）の平行な斜面によって示されるように、細胞株は、浸潤の類似率を示し;しかし、OVCA429曲線が高く、上の漸近線を示し、これは、他の細胞株と比較して侵入の最大レベルより高いことを示した。さらに、細胞株は、KGN細胞が迅速に（ 図2D）は、それぞれ、侵略するより長い3 - 5回取り、細胞およびマトリックスの障壁とOVCA433とOVCA429細胞に侵入して、侵入の発症への時間の差を示した。重要なのは、侵略の開始時に、その行動は侵略のための彼らの全体の容量（ 図2Cおよび2D）の予測ではなかった。これは、癌細胞株の異なる固有の能力を示唆しているだけでなく、別の要因はスフェロイドの初期および後期浸潤性挙動を調節し得ることを示すことができる。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> 図1実験のスフェロイド世代モデルは、Aを設定します。私予め形成された模式RTCA 2を示すことは、CIMプレートがうまくセットアップチャンバー、卵巣がん：メチルセルロース/メディア（ 上 ）にして単層（ 下 ）として成長一致する細胞株の形成スフェロイドの位相差顕微鏡下メイジB。スフェロイドは、化学誘引物質としてFBS±上部チャンバーと培地中のLP9の中皮層/マトリックスバリアの単層の上にメッキされ、下部チャンバーに加える。より多くの細胞が下室への障壁を侵入するなどの電気インピーダンスを高める2室対策のインタフェースの下に電極C：位相差顕微鏡（ 左 ）や蛍光顕微鏡（ 右 ）の下LP9単層の上にKGNスフェロイドのイメージ。スケールバー=100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 図2リアルタイム卵巣癌スフェロイド侵略データA - B：RTCA浸潤アッセイの代表的な結果はよく、CIMプレートの底チャンバーにFBSをしてなくても実施しました。 KGN細胞浸潤はLP9中皮細胞と比較される。結果は、24時間の時点（A）で、全体の2日間のアッセイ期間（B）の上に三連ウェルから平均±SDセルインデックスとして表示され、C - D：KGN、OVCA429の浸潤能の比較、OVCA433細胞24時間の期間（C）を越えて2.5時間の期間（D）をより詳細な形で示されているライン。

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Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

腹膜の中皮ライニングに卵巣癌細胞の浸潤は、時間とともに動的なプロセスである。実時間分析器を利用して、回転楕円体、中皮細胞の共培養モデルにおける卵巣癌細胞の浸潤能は、転移のプロセスを調節する因子への洞察を提供し、長期の期間にわたって定量化することができる。

リアルタイムで中皮細胞の卵巣癌スフェロイドアタッチメントおよび浸潤の評価

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

assessment-ovarian-cancer-spheroid-attachment-invasion-mesothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

17.3K ビュー.  MIMR-PHI Institute of Medical Research. 腹膜の中皮ライニングに卵巣癌細胞の浸潤は、時間とともに動的なプロセスである。実時間分析器を利用して、回転楕円体、中皮細胞の共培養モデルにおける卵巣癌細胞の浸潤能は、転移のプロセスを調節する因子への洞察を提供し、長期の期間にわたって定量化することができる。 

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A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

癌細胞による内皮細胞単層の侵入を測定するリアルタイム電気インピーダンス基づく手法

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

医学

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

in vitroで中皮クリアランスアッセイでそのモデルの卵巣がんの転移の初期段階を

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

ソリッド検体からの原発性卵巣癌細胞を得る方法

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

ヒト細胞株から化学療法抵抗性の卵巣がん幹細胞の濃縮

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

卵巣がんの腫瘍開始細胞の体外富化

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...