עבודה זו נתמכה על ידי קרן לאומית למדע קאס והרפואה גרנט; (MB); מועצה לאומית לבריאות ומחקר הרפואי של אוסטרליה פרויקט גרנט (KLS, 338,516); ועל ידי תכנית תמיכת תשתיות התפעולית של הממשלה ויקטוריאני (אוסטרליה).

1. הכנת התאים, מדיה, וריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת בינונית המכיל Methylcellulose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 1.5 גרם של methylcellulose בשל הנשר בינוני של Dulbecco סטרילי השונה (DMEM) (ללא תוספים) 100 מיליליטר בבקבוק 250 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הפתרון על נמוך במיקרוגל במשך 5 דקות; לטפל כדי למנוע רותח מעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאבקת methylcellulose היא חצי מומסת, להוסיף בוחש נקי מגנטי ותקשורת לקחת את עוצמת הקול ל125 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב, להפוך, ומערבבים בטמפרטורת חדר למשך 1.5 שעות, ואחריו על ידי ערבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את הפתרון באופן שווה לארבעה 50 צינורות מיליליטר ו צנטריפוגות במשך 1.5 שעות ב2,300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את supernatant ברור, צמיג מאוד (כ 90-95% ממניות), aliquot לתוך 50 צינורות מיליליטר סטרילי, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות וסימון של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על שורות תאי סרטן השחלה בmonolayer בtiחממת תרבות ssue על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתקשורת צמיחה המתאימה (DMEM לתאי KGN 17 וMCBD110: M199 לקווי OVCA429 וOVCA433 תא 18) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ&quot;מ L -גלוטמין, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים אנושיים mesothelial LP9 בM199: תקשורת F12 כרעיים המכילה FBS 15%, 10 ng / ml עוריות Growth Factor (EGF) ו400 הידרוקורטיזון מיליליטר / ng, בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע בגודל הבקבוק הרצוי ולגדול לכ confluency 75%. קציר תאים על ידי trypsinization באמצעות 0.05% טריפסין / EDTA, ספין ב186 XG במשך 5 דקות, ולשטוף את התא גלולה פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטת תיוג תא פלורסנט אופציונלית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים סרטניים resuspend בריכוז סופי של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר ב 1 מיליליטר של BSA% PBS/0.1 prewarmed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl 5 תא מניית Tr מ&quot;מפתרון אס CSFE (או תווית תא מועדפת אחרת הנשמרת לטווח ארוך) לתאים בריכוז סופי של 10 מיקרומטר ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות בwaterbath. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את התגובה עם 1 מיליליטר של מדיום קר כקרח מכיל 10% FBS מחדש גלולה ידי צנטריפוגה. Resuspend ב 10 מיליליטר של מדיום גידול prewarmed המתאים (ראה שלב 1.2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע ל2 בקבוק 75 סנטימטר הכתיר מסנן ותרבות על 37 מעלות צלזיוס, CO 2 של 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו תאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לוודא שרמת הקרינה של תיוג היא נאותה לצורך זיהוי. ברגע שהתאים מגיעים כ 75% confluency, קציר ולספור כמו ב1.2.3 צעדים ו1.2.4 לעיל. </li></ol></li></ol> 2. דור של spheroids בMethylcellulose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הנפח של תאי סרטן שחלות מסעיף 1 הנחוץ לדור אליפטית (כולל של 300,000 תאים נדרשים לכל ניסוי 96 גם צלחת מלאה). לאטה: אם באמצעות שורות תאים שונות מכפי שהוצג כאן, צפיפות תאים לדור אליפטית אחיד ייתכן שתצטרך להיות מותאמת לכל שורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב דילול של תאים בתקשורת methylcellulose, ראשית לחסר התא הנדרש (שלב 2.1) מ15 מיליליטר הנפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר של פתרון מניות methylcellulose (כדי להפוך 20% methylcellulose סופיים) להיקף מתאים מדיום תרבות עבור כל קו תא, שווה ל15 מיליליטר מינוס נפח התא ומערבבים היטב על ידי היפוך עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300,000 תאים למדיום methylcellulose המכיל ומעורב באופן יסודי על ידי היפוך עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 150 μl של תמהיל תא / methylcellulose / מדיה (עבור סכום כולל של 3,000 תאים / טוב) לתוך באר כל צלחת 96 היטב קעורה תחתונה תרבות ותרבות ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 1-4 ימים או עד הספרואידים אחידים יוצרים (אליפטית 1 / גם הוא ציין בדרך כלל). </li></ol> 3. נייד RTCA מבחני פלישה איןTE: קריאות עכבה באות לידי ביטוי כתא מדד (CI), פרמטר חסר ממדים המהווה שינוי יחסי בעכבת תא נמדד מייצגת את מצב התא. לצורך הניתוח, לייבא נתונים לגיליון אלקטרוני, כגון Microsoft Excel. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת צלחת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה בקבוצות של 4 בארות בכל פעם, להוסיף מטריצת 50 μl (בדילול מלא 1:10 ב תקשורת ותרבות בסרום ללא) היטב בכל החדר העליון של צלחת 16 היטב RTCA CIM כדי להבטיח שסך שטח הפנים מכוסה . הסר 30 μl של מטריקס באופן מיידי, אבל לאט לאט, כדי להיפטר מכל נוזלים עודפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת ב37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפני השימוש בתרבית רקמת חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של מדיום הסרום ללא (SFM) מתאים לכל שורת תאי סרטן לחדר העליון ו160 μl של תקשורת עם או בלי סרום (כמו לכל עיצוב ניסיוני שלך) לתא התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את צלחת CIM על ידי לחיצה על התא התחתון לתא וequilibr העליוניםאכלתי ב37 ° C חממה במשך שעה 1 בתרבית רקמת חממה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנות מכשיר RTCA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תכנית RTCA ובחר בכרטיסייה &#39;הפריסה&#39;. סמן את כל הבארות הניסיוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לחיצה ימנית על בארות ובחר &#39;הפעל בארות&#39;; לאחר מכן למלא בתנאי ניסוי ותא שמות כרצונכם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוסיף שלבים או צעדי ביניים לתכנית, בחר בכרטיסייה &#39;לוח זמנים&#39; ולחץ לחיצה ימנית על &#39;הוסף שלב&#39;. הצעד הראשון הוא לטאטא רקע מתוכן מראש, אשר שולב באופן אוטומטי לתכנית פעם אחת &#39;להוסיף צעד&#39; נבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את פרטי תכנית הרצויים עבור שלב 2 של תכנית RTCA, אשר תתעד קריאות במהלך הקמת monolayer LP9. מוסיף את מרווחי הזמן בין קריאות עכבה על ידי בחירת הכרטיסייה &#39;המרווח &quot;והזנת &#39;15 דקה&#39;. הוספת משך ניסוי על ידי בחירת הכרטיסייה &#39;משך&#39;נכנסים ד זמן בין 12-24 לשעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוסיף שלבים שלאחר מכן, בחר בכרטיסייה &#39;לוח זמנים&#39; ולחץ לחיצה ימנית על &#39;הוסף שלב&#39; והזן את הפרטים של צעדים נוספים, כאמור לעיל. שלב 3 של תכנית RTCA ינחה את המכשיר כדי לקחת קריאות במהלך פלישת אליפטית; הכנס דקות &#39;5 &#39;תחת&#39; שעה הכרטיסייה ו&#39;48 &#39;המרווח תחת לשונית&#39; משך &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;פלייט&quot; בשורת התפריטים ולשמור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דור של LP9 חד שכבתי ומדידה של אליפטית פלישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת CIM במכשיר RTCA ותכנית פתוחה משלב 3.2 לעיל. לפני הוספת תאים, בחר &#39;ביצוע&#39; בשורת תפריטים ולאחר מכן על &quot;התחל&quot;. לטאטא רקע באופן אוטומטי שבוצע (שלב 1 בהוראות תוכנת RTCA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת CIM מהמכשיר הבא לטאטא רקע והמקום במכסת מנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50,0 פלייט00 LP9 תאים תלויים ב160 μl SFM לתוך התא העליון של כל צלחת CIM כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת במכשיר RTCA ולקחת קריאות כל 15 דקות תוך monolayer LP9 מקים לילה (שלב 2 של תכנית RTCA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספרואידים סרטן קציר שנוצרו תחת שלב 2 &#39;דור של הספרואידים בmethylcellulose&#39;, לעיל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סביבה נקיה מחיידקים, לחתוך 1 מ&quot;מ את החלק העליון של קצה פיפטה 1 מ&quot;ל ולהשתמש בו כדי לאחזר בעדינות את תוכנו של כל אחד. מעביר צינור סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה spheroids ב120 XG במשך 8 דקות, ולהסיר בינוני methylcellulose המכיל על ידי שאיפה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף הספרואידים עוד פעמיים עם PBS, צנטריפוגה ב120 XG במשך 8 דקות עד גלולה הספרואידים לאחר כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל אחד גם ניסיוני, resuspend כולל של 10 הספרואידים ב160 μl של מדיום בלי FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשהות את ניסוי RTCA על ידי בחירה &quot;הפעל&quot; משורת התפריטים ובדיקה &amp;# 8216; השהה &#39;. הסר את צלחת CIM מהמכשיר, ואת המקום במכסת מנוע בתרבית רקמה. לשאוב את התקשורת מכל טוב ולהחליף עם תקשורת המכיל אליפטית (10 תחומים 160 μl) או תקשורת טרי לבארות שליטה LP9 בלבד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את הצלחת למכשיר RTCA. בחר &#39;הפעלה&#39; משורת התפריטים ולבדוק &#39;בטל צעד&#39;. התכנית תעבור לצעד הבא באופן אוטומטי. כדי לחדש את הניסוי, בחר &#39;ביצוע&#39; משורת התפריטים ולבדוק &quot;התחל / המשך &#39;. שלב 3 בתכנית RTCA ייזום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את רמת הפולשנות של תאים אליפטית, לחסר הערכים שהתקבלו עבור monolayer LP9 רק מהקריאות בודדות שהתקבלו לשורות תאי סרטן השחלות בכל timepoint. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתוות &#39;פלישה אליפטית&#39;, לנרמל את כל הערכים עד לנקודת הזמן שבי הספרואידים נוספו לצלחת, על ידי יםetting שנקודת הזמן &#39;0 &#39;. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+worldwide+burden+of+cancer+in+2008:+GLOBOCAN.">Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN.</a> Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).</li><li>Ahmed, N., Stenvers, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+ovarian+cancer+ascites:+opportunities+for+targeted+therapy-+based+translational+research.">Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li><li>Karst, A. M., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+pathogenesis:+a+model+in+evolution.">Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution.</a> J Oncol. 2010, (2010).</li><li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+development+and+metastasis.">Ovarian cancer development and metastasis.</a> Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).</li><li>Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroids+in+ovarian+cancer+metastases:+Biology+and+pathology.">Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology.</a> Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).</li><li>Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+plasticity+of+neoplastic+ovarian+epithelium:+unique+cadherin+profiles+in+tumor+progression.">Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).</li><li>Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disaggregation+and+invasion+of+ovarian+carcinoma+ascites+spheroids.">Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids.</a> J Transl Med. 4, 6 (2006).</li><li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).</li><li>Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+spheroids+disaggregate+on+type+I+collagen+and+invade+live+human+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers.</a> Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).</li><li>Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+ovarian+cancer+cell+metastasis+are+mediated+by+MMP-2+cleavage+of+vitronectin+and+fibronectin.">The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin.</a> J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).</li><li>Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Line+of+Abdominal+Metastatic+Attack:+Breaching+the+Mesothelial+Cell+Layer.">The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer.</a> Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).</li><li>Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+confrontation+assay:+a+simple+method+to+monitor+the+three-dimensional+migration+of+different+cell+types+in+vitro.">Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro.</a> Ann Anat. 193, 181-184 (2011).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).</li><li>Latifi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumor+cells+from+the+ascites+of+ovarian+cancer+patients:+molecular+phenotype+of+chemoresistant+ovarian+tumors.">Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+mesothelial+clearance+assay+that+models+the+early+steps+of+ovarian+cancer+metastasis.">In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium.">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).</li><li>Nishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+steroidogenic+human+granulosa-like+tumor+cell+line,+KGN,+that+expresses+functional+follicle-stimulating+hormone+receptor.">Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor.</a> Endocrinology. 142, 437-445 (2001).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outcome+of+heregulin-induced+activation+of+ovarian+cancer+cells+depends+on+the+relative+levels+of+HER-2+and+HER-3+expression.">The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression.</a> Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).</li></ol>

Open access fee paid for by ACEA Biosciences, Inc. and MIMR-PHI Institute of Medical Research.

תאי סרטן השחלות פולשים אינטראקציה עם מגוון רחב של סוגי תאים על פני השטח של הצפק, כוללים fibroblasts, adipocytes, ותאי mesothelial, והוא חשב שתקשורת דו כיוונית בין התאים הסרטניים ותאי הצפק כדי לשחק תפקיד מפתח בהנעת התהליך גרורתי 2. ברגע שמשתלט עליו, הפרוטוקול המתואר במסמך זה הוא בקלות להתאמה לחקר האינטראקציות הללו בתוך microenvironment הצפק, למשל, באמצעות התוספת של ציטוקינים אקסוגניים, גורמי גדילה, או מעכבים ספציפיים לתאי העליונים או תחתון של צלחת CIM טובה או מניפולציה גנטית של הסרטן או שורות תאי הצפק. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להשתמש בתאים סרטניים בשחלות עיקריות שנקטפו זה עתה ממיימת הממארת ו / או תאים ראשוניים של הצפק כדי לקבל תובנות ישירות לאותות רגולציה ואינטראקציות הסלולר המסדירות את הקמתה של נגע גרורתי בחלל הצפק <sעד&gt; 2. שימוש במכשיר RTCA כדי למדוד את הקיבולת פולשני של תאים או הספרואידים אחד מציע מספר יתרונות על פני מבחני קונבנציונליים אחת נקודות קצה וזמן לשגות תמונת מנתח. המכשיר מודד RTCA פלישה סלולרית במרווחי זמן מוגדרים ברציפות במהלך assay, אשר יכולות להיות שעות או ימים. זה מאפשר קביעת שינויים בשער של פלישה לאורך זמן, שמתגבר על המגבלות של מבחני נקודת סיום אחת. כך, למשל, בוחן את נתוני פלישה משורות תאי הסרטן השונים בנקודתי קצה אחד (איור 2), למשל, 3 שעות, היה עשויים להוביל למסקנה המוטעית כי KGN וOVCA433 תאים היו הרבה יותר פולשנית מאשר OVCA429 תאים. יתרון נוסף של טכנולוגיה זו הוא כי מכשיר RTCA מודד את השינויים בעכבה חשמלית. משמעות דבר היא כי מבחני ניתן להפעיל ללא תיוג תאים עם סוכן חיצוני, אשר עשוי להיות השפעות בלתי צפויות על פן תאotype או פונקציה. זה הופך להיות חשוב במיוחד כאשר לומדים תאי סרטן השחלות עיקריים הנגזרים ממיימת הממארת, שבה היא הכרחי כדי לשמור על מניפולציות למינימום כדי למנוע החדרת שינויים מולקולריים ופנוטיפי שאינם משקפים את האופי שלהם in vivo 2. יתר על כן, שימוש במכשיר RTCA מאפשר האיסוף של נתונים כמותיים בזמן אמת, שלא רק ימנע את הזמן רב ניתוחים הקשורים למיקרוסקופיה זמן לשגות, אלא גם מאפשר הקביעה המהירה של חלונות הניסיונית מפתח עבור assay אופטימיזציה. התכונה זו שימושית במיוחד כאשר משווה את ההשפעות של מגוון גורמים בפלישת אליפטית, גורמים שונים כיכולים להפעיל את ההשפעה המקסימלי שלהם בנקודות זמן שונים, או עם פרופילים שונים באופן משמעותי לאורך זמן. למרות שפרוטוקול זה ניתן לשינויים (לדוגמא, שימוש במטריצה ​​שונה ECM, שורות תאי הסרטן שונות, או cel היעד שונהls), אם כך, חשוב לציין כי תנאי ניסוי שונים צריכים קודם להיות מותאמים. לדוגמא, לפני תחילת לימודים של פלישת אליפטית, המספר האופטימלי של תאים סרטניים / צלחת CIM גם צריך קודם כל שייקבע על ידי assay של titrations מספר התא בתרבות שכבה. המספר האופטימלי של הספרואידים להשתמש לכל טוב אז המבוסס על ניתוח זה. לדוגמא, בשיטה הנוכחית, הספרואידים מהווים כ 3,000 תאים כל אחד כאשר נוצרו ראשון. אם titrations מספר התא הראשוני עולה כי 30,000 תאים בmonolayer הם אופטימליים לזיהוי בפלישת מנתח, אז 10 הספרואידים מתווספים לכל צלחת CIM כן. יתר על כן, בעת ביצוע ניסויי תרבות משותפת, חשוב ללמוד את ההתנהגויות של monolayer התא &#39;היעד&#39; בנפרד על מנת לקבוע אם תאים אלה מטבעם פולשניים, כמו זה יכול לבלבל את התוצאות. בדוגמא שהפגינה, הספרואידים סרטן הם מצופים בחלקו העליון של תא monola LP9yer, עם ובלי FBS מתווסף לתחתית גם chemoattractant. במקביל, תאים בתרבית LP9 לבד, מתחת לכל מצב טיפול. באופן דומה, כאשר לומדים את הקיבולת פולשני של תאים והספרואידים, חשוב גם לבחון את יכולות הנדידה שלהם, כמו גם על מנת להבחין בין שתי ההתנהגויות (כלומר פלישה דורשת עיכול מפרקי החלבונים של מחסום ECM תוך הגירה לא). כדי לעשות זאת, ישמיט את מחסום ECM (שלבי 3.1.1 - 3.1.3) ולנהל את assay במקביל למחסום ECM במקום. המדד &#39;הפלישה&#39; האחרון יכול להיות מתוקן למידה &#39;הנדידה&#39; לשעבר, אם תרצה בכך. לבסוף, חשוב לציין כי המידע שנצבר מאמצעים של עכבה חשמלית הוא מוגבל בהיקפה: ברגע שהתאים פלשו לתוך התא התחתון, שינויים בהתקשרות שלהם, מתפשט, והתפשטות בחלק התחתון של הקרום עשויים לתרום לשינויים ב ריאה עכבה<html> dings. לכן, במתודולוגיה זו היא אינפורמטיבי ביותר הפועל בשיתוף עם מבחני אחרים של כדאיות אליפטית תא, הדבקה, הגירה, ומורפולוגיה על מנת להעריך באופן מקיף התנהגויות תא אליפטית. לדוגמא, באופן אידיאלי, על מנת להבין באופן מלא אינטראקציות אליפטית-mesothelial, צריכים גם להיות צילמו שיתוף תרבויות נפרדות מעת לעת תחת מיקרוסקופ שלב הסטנדרטי, כך שהערכות איכותיות של מורפולוגיה אליפטית ובריאות יכולות להתבצע במקביל למבחני RTCA כמותית של פלישה. אם שלב התיוג האופציונלי מתבצע, אז ההתנהגויות של תאים סרטניים בודדים ניתן לקבוע תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כפי שהם disaggregate מאליפטית ואינטראקציה עם תאי mesothelial ללא תווית. יתרון נוסף של fluorescently תיוג תאי הסרטן כאשר שיתוף culturing עם סוג תא שני הוא שאז זה אפשרי כדי לוודא שרק תאי הסרטן פלשו דרך המחסומים הניידים וECM. &gt; לסיכום, שיטה זו מייצגת ניתוח כמות תפוקה גבוהה של פלישה אליפטית סרטן השחלות של מחסומי mesothelial וECM. באמצעות התוספת של ציטוקינים אקסוגניים, גורמי גדילה, או מעכבים ספציפיים לתאי העליונים או תחתון של צלחת CIM גם, שיטה זו מאפשרת מהירה, קביעת גורמים המסדירים את יחסי הגומלין בין התאים אליפטית סרטן השחלות הפולשים דרך mesothelial ומחסומי מטריצה ​​מעל זמן.

יש לו סרטן השחלות שיעור התמותה הגבוה ביותר מכל סוגי סרטן גינקולוגיות 1. ברחבי העולם, יש ~ 230,000 מקרים ומעל 100,000 מקרי מוות כתוצאה מהמחלה בכל שנה 1. רוב המטופלים (&gt; 75%) מאובחנים לאחר הסרטן כבר שלח גרורות, כאשר הטיפול הוא מסובך עוד יותר על ידי התנגדות מוגברת לכימותרפיה והתחזית היא ענייה 2. יש חולים עם מחלה גרורתית III-IV שלב שיעורי הישרדות לאחר 5 שנים של רק 30-40% 3. לפיכך, יש צורך דחוף בהבנה טובה יותר של ההתנהגויות הסלולר שבבסיס גרורות סרטן השחלות על מנת לטפל במחלה מתקדמת בצורה יעילה. המודל הנוכחי של גרורות סרטן השחלות מציע כמה שלבים בתהליך גרורתי, כל אחד מהם מתרחש בmicroenvironment שונה אשר משפיע על גידול התנהגות. תאי סרטן השחלות גרורות לראשונה להשיל מאתר הגידול הראשוני ולשרוד בnonadherמדינה אף אוזן גרון בתוך נוזל הצפק כתאים בודדים או מבנים תאיים תלת ממדים, המכונה אגרגטים או הספרואידים 2,4,5 רב תאיים. תאים אשר אינו מהווים הספרואידים בהשעיה רגישים יותר לanoikis 2,4,5. Spheroids גם תערוכה עלה התנגדות chemotherapeutics, תורם למחלה שיורית וההישנות הבאה של 2,4,5 הסרטן. שלב קריטי שני בגרורות סרטן השחלות הוא המעבר של אגרגטים מאשכולות חופשיים צף לגידולים משניים שהוקמו בתוך הקיר וomentum 5,6 הצפק. תאי תאי אינטראקציות ותא מצע היו מעורבות בהיווצרות המצרפי, הישרדות, ודבקות במטריצה ​​תאית (ECM) המיוצרת על ידי mesothelial רירית 4-11 הצפק. עדיין, התהליכים האלה הם הבינו היטב. כדי להגדיר את המנגנונים מעורבים בהפצה של סרטן השחלות, הספרואידים יכולים להיות generated משורות תאי הסרטן שהוקמו תוך שימוש בשיטות תרבות nonadherent, שמירה על תאים בתרחיף או על ידי הוספת methylcellulose לתקשורת תרבות 12,13 או על ידי תאי culturing על צלחות נמוכות מצורפים 2,14. כאשר בתרבית באופן זה, תאי סרטן השחלות יותך אגרגטים או spheroids תאיים שתערוכת תכונות סלולריות, מולקולריות, ויוכימיים דומות לאלו של אגרגטים גידול נמצאו בvivo 2,14. לאחר היווצרות, הספרואידים ניתן לקצור מאוחר יותר ממדיום nonadherent וreplated על גבי מגוון רחב של משטחים מוצקים ללימודים תפקודיים נוספים. זה מייצג מראש על מבחני בתרבות monolayer, שלא במדויק מודל ההתנהגויות של תאי סרטן שחלות גרורות בתוך סביבה nonadherent כגון נוזל intraperitoneal. הקיבולת פולשני של הספרואידים סרטן ניתן להעריך במבחני נקודת סיום מסורתיים בבוידן תאים 2 </sup&gt;, אך גישה זו יכול להיות מטעה, שכן פלישת תאי סרטן השחלות היא תהליך דינמי לאורך זמן. שיטה האחרונה בזמן אמת כבר המציאה באמצעות וידאו מיקרוסקופיה זמן לשגות של פינוי תא mesothelial ידי הפולשים spheroids סרטן השחלות 15,16; עם זאת, ניתוח נתוני זמן לשגות זה זמן רב ויכול להיות סובייקטיבית. בזאת, שיטה מהירה, כמותית להערכת ההתנהגויות פולשני של spheroids סרטן השחלות בזמן אמת הוא תאר. ראשית, מודל תא אליפטית-mesothelial הוקם המייצג את השלב של גרורות סרטן השחלות כאשר הספרואידים תאיים לצרף ולפלוש הצפק ליצירת גידולים משניים. אז מתודולוגיה למנתח בזמן אמת נייד (RTCA; ראה טבלת חומרים לפרטים חברה) הותאמה לביצוע מדידות בזמן אמת כמותי של היכולת פולשנית של שורות תאי סרטן השחלות שונות גדלו כמו הספרואידים ונבדקו במודל זה. בRTCA במחוונים, תגובות הסלולר נמצאות תחת פיקוח ברציפות במהלך assay, ללא הצורך בתוויות חיצוניות, על ידי מדידת שינויים בעכבה חשמלית. יש צלחות תרבות שתוכננו במיוחד microelectrodes מצופה זהב שנמצא מתחת קרום microporous בממשק שבין התאים העליונים ותחתונים של 2 (צלחות &#39;CIM&#39;) תאיים כן. המיקום של האלקטרודות בתא התחתון מאפשר מדידה של שינויים בעכבה חשמלית כמו תאים לפלוש דרך ECM או ECM / מחסום סלולארי. ממשק הקרום בין 2 התאים של כל אחד גם צלחת CIM מצופה ראשית עם רכיב ECM של עניין. במערכת המודל של תאים אליפטית-mesothelial, הממשק הוא מצופה בשכבה של Matrigel (ראה טבלת חומרים לפרטים חברה), לחקות את ECM המורכב שבבסיס mesothelial הבטנה של הצפק, ואחריו monolayer מחוברות של mesothelial אדם &quot; תאי יעד &#39;. לבסוף, spheroids סרטן השחלות מראש יצר הם מודעותטוליפ אין. תאים אליפטית סרטן השחלות פעיל חייבים לפלוש דרך שכבת תאי היעד ומטריקס להגיע לחדר התחתון ולשנות קריאות עכבה חשמליות. תאי מטרה בכוחות עצמם גם נבחנים כדי לוודא שהם לא לפלוש דרך שכבת מטריקס ומתאימים לשימוש בassay זה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">xCELLigence RTCA DP Analyser</td>
			<td style="width:291px;">ACEA biosciences</td>
			<td style="width:87px;">RTCA DP</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">xCELLigence CIM plates&#160;</td>
			<td>ACEA biosciences</td>
			<td>5665817001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell TraceTM CFSE&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylcellulose (4000 centipose)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:293px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11966-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Medium 199&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:87px;">11150067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ham&#39;s F-12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:87px;">11765062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:291px;">Gibco-Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well concave culture plate&#160;</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>650185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LP9 Human mesothelial cell line</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research&#160;</td>
			<td>AG07086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Growth Factor-reduced Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ovarian cancer spheroid attachment and invasion of mesothelial cells in real time

סרטן השחלות גרורות על ידי שפיכה לתוך נוזל הצפק ופיזור לאתרי דיסטלי בתוך הצפק. תרבויות חד שכבתי במדויק לא מודל ההתנהגויות של תאי סרטן בתוך סביבת nonadherent, כמו תאי הסרטן לצבור מטבע לתוך מבנים תאיים אשר תורמים לתהליך גרורתי על ידי הצמדת ולפולש הצפק ליצירת גידולים משניים. למודל בשלב חשוב זה של גרורות סרטן שחלות, אגרגטים רב תאיים, או spheroids, יכול להיות שנוצר משורות תאי סרטן השחלות הוקמו נשמרו בתנאי nonadherent. כדי לחקות את microenvironment הצפק נתקל על ידי תאי גידול in vivo, מודל שיתוף תרבות אליפטית-mesothelial הוקם בי preformed הספרואידים הם מצופים על גבי monolayer תא mesothelial אדם, נוצרו מעל מחסום מטריקס. שיטות לאחר מכן פותחו באמצעות נתח סלולרי בזמן אמת לביצוע אמיתי כמותייםמדידות זמן של הקיבולת פולשני של שורות תאי סרטן השחלות שונות גדלו כמו הספרואידים. גישה זו מאפשרת למדידה רציפה של פלישה על פני תקופות זמן, שבו יש מספר יתרונות על פני מבחני נקודת סיום מסורתיים ותמונה מיקרוסקופית זמן אמת מפרכת יותר ניתוחים ארוכות. בקיצור, שיטה זו מאפשרת מהירה, קביעת גורמים המסדירים את יחסי הגומלין בין התאים אליפטית סרטן השחלות הפולשים דרך מחסומי mesothelial ומטריצה ​​לאורך זמן.

יכול להיות שנוצר מסוגים רבים של שורות תאי סרטן השחלות spheroids ידי culturing אותם בהשעיה או על ידי איסוף תאי גידול ראשוניים ממיימת הממארת 2,14. הנה שני קווי אפיתל השחלות תא סרטני, OVCA433 וOVCA429, ושורת גידול תא granulosa השחלות, KGN, שנוצלו כדי ליצור spheroids (איור 1 א). בשיטה זו, תאים בתרבית בבארות תחתית-U בזמן תלוי בתקשורת המונית שנעשתה צמיג על ידי התוספת של methylcellulose. בתנאים אלה, רבים תאי סרטן השחלות מפגינים יכולת טבועה כדי לצבור כדי ליצור הספרואידים 13. בעקבות תרבות הלילה התלויה בmethylcellulose / תקשורת, כל שלוש שורות התאים שנוצרו מבני אליפטית קומפקטיים של כ 400-500 מיקרומטר קוטר (איור 1 א). בינתיים, צלחת RTCA CIM מוכנה, ראשית על ידי ציפוי ממשק הקרום הנקבובי עם מטריצה ​​ולאחר מכן monolayer מחוברות של mes אדםתאי othelial (איור 1). לאחר מכן יצרו פעם אחת, הספרואידים מועברים לצלחת CIM מוכנה. הספרואידים סרטן נקטפו הם מצופים בחלקו העליון של monolayer LP9 והוערכו כמתואר להלן. תמונות תחת מיקרוסקופ רגיל שלב (או תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אם צעד תיוג תא האופציונלי אחרי) של תרבויות מקבילות נלקחות מעת לעת כדי לסייע בפרשנות של נתוני RTCA (תרשים 1C). זה הוא אינפורמטיבי להעריך גם את רמת הבסיס של פלישה של שורת תאי סרטן, כמו גם פלישה-Induced chemoattractant. בדרך כלל, הפולשנות הבסיסית נמדדת על ידי התוספת של SFM לשני תאים העליונים ותחתונים. תקשורת מלאה (10% FBS), שמכיל הרבה chemoattractants פוטנציאלי, משמש בדוגמא הנוכחית לבחון פלישה &#39;מושרה chemoattractant&#39; (איור 2). מחקרים מקבילים של תאי mesothelial LP9 לבד אישרו כי תאים אלה הם מינימאלי בvasive מעל 2 ימים מתחת או בסל או &#39;chemoattractant&#39; תנאים מושרה ובכך היו סוג תא טוב לשימוש במבחני התרבות משותפת עם תאי סרטן שחלות (2A דמויות ו2B). לעומת זאת, spheroids סרטן השחלות שנוצר תוך שימוש בכל אחת משלוש שורות התאים הציג את היכולת לפלוש לכיוון chemoattractant (איורים 2 א-2C) (FBS). היתרון העיקרי של שימוש במכשירים בזמן אמת RTCA על מבחני נקודת סיום מסורתיים הוא ששינויים בתא / אליפטית התנהגות ניתן לכמת לאורך זמן. במהלך assay 2 היום, כל KGN, OVCA429, ושורות תאי OVCA433 הציגו את היכולת לפלוש לכיוון chemoattractant (מסומן על ידי הגדלת מדדי תא) אך רמות בסיס נמוכות של פלישה (איור 2 ג). שורות התאים הציגו שיעורים דומים של פלישה, כפי שצוין על ידי המדרונות המקבילים של העקומות (איור 2 ג); לעומת זאת, עקום OVCA429 הציג אסימפטוטה העליונה גבוהה יותר,אשר הצביע על רמה מקסימלי גבוהה יותר של פלישה בהשוואה לשורות תאים האחרות. יתר על כן, שורות התאים הציגו הבדלים בזמנים שלהם לתחילתה של פלישה, עם תאי KGN פולשים במהירות את המחסומים הניידים ומטריקס וOVCA433 וOVCA429 תאים לוקחים 3-5x כבר לפלוש, בהתאמה (איור 2 ד). חשוב מכך, ההתנהגות שלהם בתחילת הפלישה לא היתה חזויה של הקיבולת הכוללת שלהם לפלישה (2C דמויות ו2 ד). הדבר מצביע על יכולות הגלומות שונות של שורות תאי הסרטן, אלא גם עשוי להצביע על כך גורמים שונים עשויים לווסת את ההתנהגויות פולשנית מוקדמות ומאוחרות של הספרואידים. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 דור ומודל אליפטית של ניסיון להגדיר:.. אני<html> המגים תחת מיקרוסקופ לעומת שלב של הספרואידים להרכיב בmethylcellulose / תקשורת (למעלה) ושל הקו הסלולרי התואם גדל כמו monolayer (תחתון) B:. סכמטי המציג את RTCA 2 תאיים צלחת CIM להגדיר היטב, שבו נוצרה מראש סרטן השחלות הספרואידים הם מצופים על גבי monolayer של שכבה / מחסום LP9 mesothelial מטריקס בחדר העליון ותקשורת ± FBS כchemoattractant מתווסף לתא התחתון. אלקטרודות מתחת לממשק של מדד 2 תאי הגדלת עכבה חשמלית ככל שיותר תאים לפלוש דרך המחסומים לתא C הנמוך:. תמונות של הספרואידים KGN על גבי monolayer LP9 תחת מיקרוסקופ שלב הניגוד (משמאל) או מיקרוסקופ פלואורסצנטי (מימין). ברים סולם = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> עבור: together.within-לשמור על עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig2highres.jpg" width="500" /> .. איור 2 נתונים פלישה אליפטית סרטן השחלות בזמן אמת - ב &#39;: תוצאות נציג מassay פלישת RTCA שנערך עם וללא FBS בתא התחתון של צלחת CIM כן. פלישת תא KGN היא בהשוואה לתאי mesothelial LP9. תוצאות מוצגות כממוצע ± SD סלולרי אינדקס מבארות בשלושה עותקים בtimepoint שעה 24 () ועל פני תקופה כל assay יומיים (ב &#39;) C - D:. השוואה של הקיבולת פולשני של KGN, OVCA429, ותא OVCA433 קווים מצוירים על פני תקופה hr 24 (C) ובאופן מפורט יותר על פני תקופה 2.5 hr זמן (ד &#39;).

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time at JoVE.com

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

פלישת תאי סרטן השחלות לmesothelial הבטנה של הצפק היא תהליך דינמי לאורך זמן. ניצול מנתח בזמן אמת, את היכולת פולשני של תאי סרטן שחלות במודל תא שיתוף תרבות אליפטית-mesothelial ניתן לכמת על פני תקופות זמן ממושכות, המספקת תובנות גורמים המסדירים את התהליך גרורתי.

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

assessment-ovarian-cancer-spheroid-attachment-invasion-mesothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

17.2K Views.  MIMR-PHI Institute of Medical Research.  פלישת תאי סרטן השחלות לmesothelial הבטנה של הצפק היא תהליך דינמי לאורך זמן. ניצול מנתח בזמן אמת, את היכולת פולשני של תאי סרטן שחלות במודל תא שיתוף תרבות אליפטית-mesothelial ניתן לכמת על פני תקופות זמן ממושכות, המספקת תובנות גורמים המסדירים את התהליך ג?...

Video: Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

טכניקה מבוסס למדוד את הפלישה של monolayer תא האנדותל על ידי תאים סרטניים חשמל התנגדות בזמן אמת

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

שיטה לקבלת תאי סרטן השחלות ראשיים מתוך דגימות מוצקים

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

העשרה לתאי גזע Chemoresistant סרטן השחלות משורות תאים אנושיות

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

בהעשרת מבחנה של תאי ייזום-גידול סרטן השחלות

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...