提示チュートリアルは、国立ユダヤ人の健康の質量分析基盤施設内で実行し、開発されました。 NJH MS施設はCCSTI UL1 TR000154によって部分的にサポートされています。 NIHの助成金からの資金P20は、HL-113445とR01 HL-095432も、この作品を支持した。

1。初期の考慮事項、楽器の準備と規格<ol><li>常に（ガラス培養管、ガラスオートサンプラーバイアル）を格納するか、（ガラスピペット）脂質および有機溶剤を転送するためのガラスを使用しています。 </li><li>空気にすべての脂質サンプルおよび標準の露出を最小限に抑えることができます。シール、ポリテトラフルオロエチレン（PFTE）は、空気曝露と蒸発を避けるために、しっかりとキャップ。すぐに次の溶媒中で乾燥させ、脂質を再懸濁または窒素の安定した流れに保管してください。 </li><li>試料100μlを使用してください。より多くの（またはそれ以下）のサンプルが利用可能である場合では、それに応じてボリュームを調整します。しかし、NH 2 SPEカラム上の脂質分画中に、示されているようにボリュームがでなければなりませんと述べた。 </li><li>遠心機の電源をオンにして、サンプルの準備を開始する前0℃に設定してください。 </li><li>この手法は、多くの揮発性溶剤を使用していますので、試料調製中キャップすべての溶媒を保持します。 </li><li>勧告ごとの基準の2種類を用意。 </li><li>一定濃度でスパイクイン規格のすべてで構成される陰性コントロールを準備します。これは、すべてのサンプルだけでなく、バ​​ッチQC（別の日にサンプル調製の再現性を監視するために使用スパイクプールされたサンプル）とインストゥルメントとして使用されているプールしたサンプルにスパイクされたQC（プールされたサンプルは、以前に、用意したサブ等分し、またそこに使用されるスパイク分析中の別々の日に機器条件/変動）を監視します。 <ol><li> 1倍、2倍、4倍の標準スパイクで陽性対照を準備します。陽性対照は、全てのサンプル、ならびにプールされた血漿サンプルに添加されると、そのすべての側面を実現するために、データの分析中に変化倍率の違いを分析し、同定するための試料調製工程及び機器分析工程の両方のための品質制御化合物として使用されている準備や機器分析が正しく行われた。 </li></ol></li><li> -80℃で-20℃や店舗のサンプルで保存基準特定の内部のスタンド長期保存以下の分解を受けやすいARDSは、-80℃で保存すべきである</li><li>この手順では、MTBEなど、危険な可燃性または揮発性の溶剤を使用する必要があります。ヒュームフード内のすべての手順を実行します。 </li></ol> 2。内部標準<ol><li>個々のプロジェクトとその具体的な実験計画に基づいて、内部標準（ISTD）を選択します。血漿、BALF、または尿などの生体液の場合は、これらのサンプル中の生物学的に見られるものと本質的に似ている同位体標識のISTDが理想的である。これらには、アミノ酸、ホルモンまた​​は脂質に限定されるものではないであろう。植物メタボロームサンプルについては、このようなフラボノイド、カロチノイドやなどのラベルされた基準を適用することができた。同じことが、研究者が分析されているサンプルタイプを代表するものであり、内部標準を選択する必要があり、それによって他のメタボロミクスの研究に適用されます。 </li><li>選ばれたISTDのクロマトグラムの広い範囲をカバーしていることを確認してください。トンたとえば彼は取得時間は5分ごとに溶出する標準が使用され得る、20分である。 </li><li> 2ミリグラムに親水性の原液を作成/分析されているサンプルに対して外因性である同位体標識された基準および/または他の極性化合物のさまざまな方法を使ってミリリットル。各ストック溶液から、1:1のメタノールで1ソリューションを作成：25μg/ mlのクレアチニン-D 3、100μg/ mlのリジン-d 4、および200μg/ mlのバリン-D 8の最終濃度まで、すべての規格に水を。 </li><li>同位体標識された基準および/または分析されているサンプルに対して外因性である他の非極性化合物のさまざまな方法を使って、疎水性の原液を作成します。 17：00脂肪酸（4 mg / ml）を19:1脂肪酸（4 mg / ml）を、午前17時00分セラミド（2 mg / ml）で、17：00 PE（1.75 mg / ml）を、15のストック濃度：0 PC（2 mg / ml）で、およびテストステロン-D 2（1 mg / mlで）。各在庫から1:1クロロホルム中1のソリューションを作成します。50の最終濃度までのすべての基準にメタノールμg/ mlの午後05時セラミド、100μg/ mlの15：00、PC、100μg/ mlのテストステロン-D 2、200μg/ mlの17時00脂肪酸、200μg/ mlの19時01分脂肪酸、および200μgの/標準ミックスのミリリットル17時のPE。 </li><li>これらの化合物の器具の検出及び線形性の限界を決定するために、各標準について少なくとも5つの異なる濃度を用いて事前に各標準のイオン化の程度を試験する。それぞれの個々の標準原液の濃度は、実験設計に応じて変化するであろうし、合わせたスパイク標準の各標準液の濃度は、それらがイオン化どれだけに依存して、20μgの個/ ml〜2 mg / mlの範囲であり得る。 </li><li>陽性対照のスパイクミックスを作成し、定量的にサンプル調製や楽器のデータの正確性の強さを監視するために1倍、2倍、または4倍の濃度レベルでのサンプルに追加します。陽性対照の最終濃度は、CANも：2 mg / mlのD-グルコース、100μg/ mlのアラニン-D 3、200μg/ mlのメチルマロン酸-D 3、20μg/ mlのトリグリセリド-D 5、および/ ​​または他の疎水性と親水性の規格。分析に使用MSおよびHPLC器具の感度に基づいて標準濃度を調整します。 </li></ol> 3。タンパク質沈殿<ol><li>雪解けのRTにサンプルと、以下に説明するように、各サンプルにISTD10μlのスパイク。 </li><li>各サンプルに（ステップ2.3および2.4での在庫から作成された）の両方に親水性と疎水性の標準液10μlのスパイク。分析に使用MSおよびHPLC器具の感度に基づいて、必要に応じて標準濃度を調整<ol><li>各サンプルに1倍、2倍、または4倍の陽性対照溶液（ステップ2.6の株式から作成された）のいずれかの10μlのスパイク。 MSとHPの感度に基づいて、必要に応じて標準濃度を調整分析に使用LC機器</li><li>従来タンパク質沈殿工程に10秒間ボルテックスし、各サンプル</li></ol></li><li>各サンプルに（-20℃で保存）の氷冷メタノール400μLを加える。 </li><li>チューブあたり10秒間ボルテックスする。 </li><li> 18,000 X gで15分間、0℃で遠心分離する。 </li><li>新しいガラス培養管にすべての上清を移し、N 2下で乾いた。 </li><li>タンパク質ペレット画分を分析する場合は、手順3.8から3.11に進みます。タンパク質ペレットを分析していない場合は、第4節に進んでください。 注意：タンパク質ペレットが薬物の研究を行う際に有用である疎水性の高い化合物を含有することができる18、食品は、神経細胞のセロイドリポ-ノーシス20とリソソーム脂質貯蔵などの非常に疎水性の化合物が蓄積疾患に関連する疎水性フラボノイド19やメタボロミクス研究に関わる分析する疾患21。 </li><li> TへのMTBEの1ミリリットルを追加彼白（オフホワイト）タンパク質ペレット、チューブあたり30秒間ボルテックスし、18,000 X gで15分間0℃で遠心する。新しいガラス培養管に、MTBE層をデカント。 ここでエラーが劇的に結果に影響しますので、これは（代表的な結果の図5を参照）重要なステップです。 <ol><li>ペレットの大きさは試料間で変化するので、常にALL試料について同じ量のMTBEを吸引する。そのため、場合にのみ900μlの全サンプル900μLをデカントして、上澄みの最低額とサンプルについては、デカントすることができます。 </li></ol></li><li>ステップ3.9を繰り返し、ステップ3.7で作成同じガラス培養管に有機層を兼ね備えています。 </li><li>メタノール1:1クロロホルム200μl中のN 2の流れを再懸濁することにより乾燥試料。簡単に渦。 </li><li>遠心チューブに移します。 18,000×gで15分間、0℃で遠心し、その後、ガラスを使用したスクリューキャップバイアルをオートサンプラに上清を移すピペット。 </li></ol> 4。液液抽出<ol><li>ガラスピペットを使用して、（第3のステップ6から）残留乾燥したメタノールに3ミリリットルのMTBEを追加、ボルテックス30秒、水750μLを加え、チューブ当たり、その後ボルテックス10秒。 </li><li>室温で遠心機で10分間〜200 XGを紡ぐ。 </li><li>を吸引したMTBE（水を得ることなく）層ときれいなガラス培養管への転送2.5ミリリットル。 注意：これはここでの違いが結果に影響するような重要なステップです。それは一定のボリュームが下の水層をピペットずにデカントすることができるため、MTBEの2.5ミリリットルを慎重にトップ層からデカントされるべきである。実験開始時の試料の体積はこの方法のために指示された100μlの未満であった場合、比例的にこの開始サンプル量を反映するためにMTBEの体積を縮小。 </li><li>サンプルの残りの水部分に3ミリリットルのMTBEを追加し、チューブあたりボルテックス10秒。 </li><li>スピン〜200室温で遠心機で10分間XG。 </li><li> （水を得ることなく）のMTBEを吸引し3ミリリットルとのMTBE管を兼ね備えています。 </li><li> N 2下で乾燥させることによって残った水層を集中。 </li><li> 100μlの水に残留を再懸濁。 </li><li>簡単にガラス培養管、渦に氷冷MeOH400μlのを追加し、マイクロ遠心チューブに移す。 </li><li> 20から30分間-80℃でのままにしておきます。 18,000 X gで15分間、0℃でスピン。 メモ：これは、残りのタンパク質はメタノール中で沈殿させるためにできるようになりますように-80℃の冷凍庫で全体のサンプルラックを配置することをお勧めします。 -80℃の冷凍庫を使用できない場合は、他のオプションは次のとおりです。、-20℃で保存するドライアイス上のサンプルを配置するか、氷のバケツにそれらを維持。これは、一貫して沈殿を可能にするために低温環境下と同じ温度でサンプルを記憶することが重要である。 </li><li>吸引物450の上清液と転送するきれいな微量遠心チューブ。完全に超えない45℃の真空遠心濃縮機の乾燥（約1〜2時間かかります）。 </li><li> 5％アセトニトリル/水200μl中で乾燥させ、上清を再懸濁する。簡単に渦。 -80℃で凍結</li></ol> 5。固相抽出<ol><li>窒素の良好な流れ（約10〜15分かかります）で、35℃で窒素下でのMTBE留分を乾燥させます。 </li><li>ときは完全に乾燥し、窒素の流れを停止し、すぐにガラスピペットを使用して1ミリリットルのクロロホルム（ クロロホルム ）に懸濁します。簡単に渦。 注：このようなクロロホルムなどの溶媒は低粘度である。ピペット操作の間に、低表面張力をピペットからの溶媒の損失を引き起こす。これは、ピペットチップをピペットでされている溶剤やピペットのスペースの間の平衡を可能にするために少なくとも二回濡らすことをお勧めします。可能な場合、ガスタイトシリンジを使用することもできる。 </li><li>のSPE吸引マニホールドを設定し、NH 2 </サブ&gt;分別のためのSPEカラム。 </li><li>暖かい室温にサンプルと、常に、N 2の安定した流れの下に吊り下げておく。室温に加温しこと脂質再懸濁および窒素は、脂質の酸化や重合を防ぐことができますようになります。 </li><li> 400μlのヘキサンで洗浄し、条件SPEカートリッジ2倍。廃棄物を廃棄し、新しいガラスコレクションチューブと交換してください。 </li><li> SPEカラムにサンプルを追加し、ガラス管に貫流集める。 </li><li>ガラスピペットで2:1 1ミリリットルのCHCl 3追加：IPAが、（これは中性画分である）、同じガラス管に貫流集める。 </li><li> （約10〜15分かかります）の酸化を最小限にするために、N 2下で中性画分を乾燥させます。 </li><li>ガラスピペットを用いて、ジエチルエーテル中の5％酢酸を1ml加える（これは脂肪酸画分である）新たなガラス管中を通って流れる集める。 </li><li> （約10〜15分かかります）の酸化を最小限にするためにN 2下で脂肪酸画分を乾燥させる。 </li><li> 800を追加するには、プラスチック製のヒントを参考にしてください＆＃181; SPEカートリッジにメタノールをL、および（これはリン脂質画分である）15ミリリットルプラスチックコニカルチューブを、フロースルーを収集する。 </li><li> 1.5ミリリットル遠心管にリン脂質画分を転送します。 45℃（約1〜1.5時間かかります）で真空遠心濃縮した試料を乾燥させる。 </li><li>再懸濁100％メタノール200μlの渦にある3つの画分からの試料の各々、およびバイアルをオートサンプラへの転送は、ストレージ用のキャップをねじ込みます。 </li></ol> 6。保管条件サンプル<ol><li>機器の分析の準備ができるまで-80℃ですべてのサンプルを保管してください。 注：有機溶媒中で再構成抽出サンプルは、-20℃で保存することができる興味のある潜在的な代謝物は、この温度で​​劣化しますしかし、これはお勧めしません。液体窒素貯蔵はまた、研究者は汚染問題、特別な保存バイアルが必要であると報告しているとして推奨され、チャンバCAUにおける均一性の欠如が存在していません広い温度変動を歌う。 </li><li>サンプル量が（&lt;100μL）小さい場合、保存中にヘッドスペース中の溶剤の蒸発を防ぐために、バイアル内のインサートを使用しています。 </li><li>サンプルの凍結融解は避けてください。右の機器分析の前に、一度だけのサンプルを解凍する。反復凍結 - 解凍は、試料の劣化をもたらす。 </li></ol> 7。液体クロマトグラフィーの条件<ol><li>疎水性の割合を分析するために、C-18 2.1ミリメートルX 12.5ミリメートル（5μm）のガードカラムと、C-18 2.1ミリメートル×50ミリメートル（1.8μm）の分析カラムを使用してください。 </li><li> 4にオートサンプラー温度を設定&#160; 60 C、カラム温度を° &#160; °C、0.25mL /分の2μlの流量に対する噴射量。 </li><li> B.移動相、水（60:36:4）を移動相A、水中の0.1％ギ酸を使用し、イソプロパノール中の0.1％ギ酸：アセトニトリル</li><li>以下の勾配溶出プロファイルを実行します。開始トン30％B、次いで15分間、1から100％Bに増加し、5分間、10％B洗浄し、5分後の実行に続いて、5分間保持し、1分0から70％Bまで増加。 </li><li>親水性部分を分析するためにガードカラムをHILIC 2.1ミリメートル×50ミリメートル（2.6μm）の分析カラムを使用してください。 </li><li> 4にオートサンプラー温度を設定&#160; 20 Cに、カラム温度を° &#160; °C、0.5ml /分の2μlの流量に対する噴射量。 </li><li> 10mM酢酸アンモニウム、移動相AのためのpH 5.8、および移動相Bの10mMの酢酸アンモニウムpH5.8の90％アセトニトリル中の50％アセトニトリルを使用し</li><li>次いで、5分間0％B洗浄、10分後の実行に続いて、15​​分間、2から50％Bまで減少し、0〜2分で100％Bで開始し、以下の勾配溶出プロファイルを実行する。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

臨床メタボロミクス研究の一つの目標は、疾患又は治療に関連したメタボロームの変化を同定することである。そのためのサンプル調製技術は、堅牢で一貫性があり、技術者からの技術者や研究室から研究室22に転送しておく必要があります。得られたデータは、試料の代表である必要があり、識別された変化ではなく、試料調製の誤差よりもサンプルセットを反映する必要がある。そのため、正確なピペッティング、正しい温度、非混和性層の効率的なデカン、窒素下で乾燥させ、ガラス製品やヒントの同じブランドとサイズの使用が必要である。 タンパク質沈殿工程の間に、溶液の同量の各ペレットからデカントされていることが重要です。これは、体積のばらつきを低減し、そのようなものとしてサンプルデータのばらつきを低減する。このタンパク質沈殿工程は、メタボロミクス研究のために必要であり、それはからタンパク質を除去するため、スキップできない前の小分子のサンプルは、質量分析計で分析プロファイリング。これは、病原体や大きな高分子がなくなり、リリースはタンパク質7から代謝物を結合した。試料中のタンパク質の蓄積の欠如は、HPLCカラムの寿命を拡張し、結果の精度と品質を増大させる。 図5は、血漿サンプルでこの技術を実行するときに形成されるタンパク質ペレットの描写である。これは、小分子の検出を可能にするイオン存在量を増強し、試料中のタンパク質からのマトリックス効果を低減する。それはすべてのタンパク質がこの工程で除去されているものとするため、また、LC-MS分析中に検出されたアミノ酸は、代謝変化からではなく、タンパク質分解を起源であろう。 は、2つの不混和性層に親水性と疎水性の代謝産物を分離するため、液-液抽出工程は重要である。 図6は、LLE手順と担当者を示すLLE層のresentation。二つの層の不適切な分離が失われる代謝産物又は両方の画分中に溶出することのいずれかをもたらす。このステップの注意深い適用は疎水性画分に出現する親水性化合物の数を減らすことができます。それは代表的な結果が含まれている割合を判断できないため、これらの化合物についての結果は信頼できなくなる。正しく行われると、代謝物の重なりが減少する。 特に脂質ではなく、例えば、チオール基を含有することができる小分子は、酸化劣化を防止するために、酸素への曝露を最小限に抑える必要がある。したがって、この手順は常に、脂質またはチオール含有化合物の酸化を防止/低減するために、窒素下で行われる。また、検体および/または溶液の移動が迅速にダウンサンプルは乾燥窒素の安定した流れの下に配置され、次いで、酸素曝露を低減するために（第一分以内）、迅速である。乾燥したら、それらを直ちにあるately上述の理由のために100％メタノール中に再懸濁した。 研究所は、さまざまな方法でこの包括的な方法から利益を得ることができる。化合物の一つのクラスを分離するために探している研究者は、最高の自分のニーズに合った方法の一部を選択することができます。唯一の代謝物のプールを得るために、タンパク質沈殿を実行しようとする者は、そうするかもしれません。親水性代謝産物はそのような多くの医薬品、アミノ酸、糖、又は唯一の疎水性代謝物は、トリグリセリド、エポキシド、脂溶性ビタミン、例えば、リン脂質として、所望される場合、研究者は、液 - 液抽出を行うことができるように、所望される場合タンパク質沈殿次のステップ、不要分を捨てる。疎水性化合物（中性脂質、脂肪酸、及びリン脂質）をさらに細分類を必要とする研究者らは、分画工程に進むことができる。 ストレージに関する考慮事項がmaintainiに重要である後の分析のためのサンプルの実行可能性をngの。サンプルが間違って格納されている場合は、劣化や分解が発生する可能性があります。理想的には、サンプルは、光に敏感な種の劣化を防止するために、離れて光からスクリューキャップアンバーバイアルに格納する必要があります。試料は、代謝物の劣化を防止するために23-25 ​​-80℃で凍結保存されるべきである。ここでは詳細に説明していないが、サンプルは常にLC-MS分析中にオートサンプラートレイ中で4℃に保持されている。これは、全ての試料を一定温度及び周囲温度の変化は、試料の粘度、溶解性、または安定性に影響を及ぼさないことに保たれることを保証する。このようなLLEおよびSPEとして、この手順のマニュアル側面は、関連する手順と自信と快適さを得るために実施することが推奨されます。 いくつかの制限は、この技法のために存在する。特定の化合物が備わっておりますように、疎水性と親水性代謝物の控えめな分離が保証されていません本来的、それらの化学組成および充電状態の両方の画分に分割する。 図4に示すように、また、タンパク質ペレット抽出工程中の不適切な技法は、サンプルおよび品質管理の両方に乏しい代謝産物再現性をもたらすことができる。統計的検出力が利用できないため、これは特に小さなデータセットで、統計に影響を与えます。したがって、この工程は、正確に各試料について同じたびに実行されることが重要である。他の制限は、時間である。ストップポイントはサンプルを凍結することができ、分取翌日続け、このプロトコルを通してありますが、一日は、この手順を実行するために取っておく必要があります。第三に、生物学的サンプル内のすべての化合物は、イオン抑制について評価することができるわけではありません。それは、マトリックスは、個々の代謝産物にどのように影響するかを識別することはできないので、現在のオプションは、理論的にendogenouのいくつかのクラスを模倣する内部標準を評価することであるS代謝物。最後に、絶対的な識別は、この方法でのみで実行することはできません。データベース検索や基準とのコラボレーションでタンデムMSは絶対代謝物同定のために必要とされる。 メタボロミクスの重要な部分は、化合物の同定である。ここでは詳細に説明しないが、品質管理サンプルを、LC-MSを用いて分析した。複数の試料調製ブランクおよび器具ブランクは、それによってより信頼性の代謝産物のヒットを生じ、汚染物質から偽陽性率を低減するために背景減算として使用するために調製した。このステップに続いて、「分子機能」の数は、のm / z、保持時間、同位体比、および実際の化合物のリストを生成するために付加物に基づいて、一緒にグループ化した。化合物のリストを大幅に低減したが、それらが同一の化合物からの複数の付加物に基づいていないしたように、結果は、より信頼性であった。フル方法は包括的でisolatioができます例えば、中性脂質、リン脂質、脂肪酸、トリグリセリド、およびステロイドのような疎水性代謝物のnは、水性画分中の親水性のクラスを隔離しつつ、エイコサノイドの、糖類、フラボノイド、及びアミノ酸12、26は同定されている。

生物学的反応は、細胞プロセスの最終生成物として、代謝産物を生成する。メタボロミクスは、これらのプロセスの結果として、生物に存在するすべての化合物の集合体である。これは、細胞の生理の写真を提供し、外部または内部の刺激1、2に対する生物の応答を反映している。このような刺激は、環境毒物学、薬理、栄養、ホルモン、あるいは疾患に関連している可能性があります。多くの代謝のアプリケーションがあり、現在の研究者によって研究されているバイオマーカーの発見3、栄養学4、食品科学5、および薬物検査6が含まれています。アプリケーションに関係なく、データ、汚染、および偽陽性の存在のばらつきを低減または好ましくは除去する必要がある。バイオマーカーの発見や、生物学的なFを制御し、疾患群間の差を決定する、または対象者に対する薬物の影響を調査する場合にはLUIDは、求められて質問に基づいて選択され、代謝物の種類は7を調査している。例えば、検体を測定する前に、気管支肺胞洗浄液（BALF）中の代謝物を探索し、投与後に、その後、喘息患者の肺に吸入薬の即時効果を研究した場合は、優先となります。違いは、実際の生物学的変動ではなく、不適切なサンプル調製技術によるものであるが観察されるようにするには、標準化された一貫性のある実験室のプロトコルは、8不可欠です。サンプル情報を慎重にそのようないくつか例を挙げると、生体液、動物系統、サンプリング時間、対象年齢、性別などの変数は、すべて考慮し、調査9に織り込まれていることを確認するために文書化されなければならない。また、汚染や偽陽性の可能性を低減するために、溶媒のブランクとインストルメントブランク10を解析することが推奨されます。 このプロトコルでは、用語「代謝LITES」は、同定された実際の化合物を指すために使用される。ベンダソフトウェアを使用して、初期ピーク発見アルゴリズムは、質量スペクトルのピークを検出するために使用される。これらのピークは、質量対電荷（m / z）比および保持時間に基づいて整列される。第2のアルゴリズムは、単一の化合物に複数の機能を組み合わせるために使用される。これは、ナトリウム、カリウム、又はアンモニウム付加物正イオン化モードおよび負イオンモードでの塩化物などの機能を備えている。ソフトウェアの追加オプションは、二量体および他の付加物などの機能が含まれています。 181.0707のm / z（M + H）でのピークを、一例としてグルコースを用いて、198.0972メートル/ zの（M + NH 4）、203.05261メートル/ zの（M + Na）の、同じに対応する3つのピークが存在するであろう最初のアルゴリズムを用いて、化合物。分子式に基づいている第2のアルゴリズムは、適用されたがときに、これら3つの化合物の付加物は、結果としてグループ化さになる。 代謝物は、SAMP内干渉を引き起こす可能性がありますレ存在する化合物の複雑さに起因する。 1サンプル中の代謝物の何千もの存在は、特に低存在量の代謝物の信号抑制の原因となる。複数の画分へのサンプル干渉するタンパク質を除去するためのクリーンアップ、およびその後の分離は、解像度を高めることにより、ピーク分離を向上させる試料の複雑さを低減し、代謝産物の共溶出を低減する。従って、サンプルクリーンアップおよび化合物の改善された分離が必要である。なお、この問題11,12を解決でき、さらに種々の極性溶媒を用いて、単独でそのタンパク質沈殿が示されている。しかし、その後の分別工程で、例えばMTBE等の強い有機溶媒を組み合わせることにより、代謝産物カバレッジが増加する。 Yang ら 12は、合わせたMTBE抽出溶媒を使用して3806の代謝産物に、それぞれ単独で、メタノールまたはメタノール-エタノール沈殿した1851または2073からの代謝産物の増加を報告した固相抽出（SPE）工程が続く。還元代謝産物重なり、改善されたピークの分離および増大した代謝産物の存在量を、この方法で観察した。 このようなポリマーの非代謝産物からの汚染は、サンプル収集、溶剤、または測定器のノイズに起因することができ、潜在的に重要な代謝産物の信号抑制をもたらすことができる。これは、技術者（S）と一貫してサンプル収集バイアル、ピペットチップおよびサンプルの採取と調製時に使用される他の任意のチューブの同じブランド、タイプとサイズを使用する準備をサンプリングする前にサンプルを収集人にすることをお勧めします。これは、データアナリストが観察された変化は本物や他のソースからのバックグラウンドの違いによるものではないという完全な自信を持つことができます。治療効果は、疾患群と対照群、または任意の他の代謝の分析の間の変動は、その後増加安心して調査することができる。 メタここで説明した外径血漿、BALF、または脳脊髄液（CSF）液体クロマトグラフィー-質量分析（LCMS）ベースの分析のための非標的代謝学的プロファイリングのためのサンプルに適用することができる結合されたサンプル調製法13-15に焦点を当てている。液体クロマトグラフィー（LC）および超高性能液体クロマトグラフィー（UPLC）分離技術は、この手順に続いてMSに結合することができる両方。メタボロミクス研究を実施する多くの研究者が、タンパク質沈殿技術および/ ​​または液-液抽出技術16,17のいずれかを使用する。我々の研究では、これは、検出されるより少​​ない代謝物を生じた。 12ここで説明する方法は、メタボロームの広い範囲をカバーする、より多くの代謝産物の検出および同定を可能にする。この増加は、サンプルおよび代謝物クラスの分離前に起因する減少マトリックス効果のより高純度に起因している。 初期PROTアイン沈殿工程は試料からタンパク質を除去し、冷メタノール（MeOH）を用いて行われる。メチルtert-ブチルエーテル（MTBE）および水を用いた液 - 液抽出（LLE）は、親水性および疎水性化合物を分離するために使用される。脂肪酸、中性脂質、及びリン脂質 - 次いで、固相抽出（SPE）は、3つのクラスに疎水性化合物を分離するために疎水性層で行われる。親水性画分は、水中の5％アセトニトリル中で再構成されている間に疎水性の画分を、100％メタノール中で再構成されている。固相抽出（SPE）ステップは、他に存在するであろう共溶出化合物の数を減らすことで、結果の信頼性の追加レベルが分離工程が行われていなかった提供しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="628">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A955-4</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Methanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L-6815</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C606-1</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Hexane</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34859</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">49199-50ML-F</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Methyl tert-butyl ether</td>
			<td style="width:163px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">9042-03</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34965-2.5L</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Water</td>
			<td style="width:163px;">Honeywell Burdick &#38; Jackson</td>
			<td style="width:119px;">365-4</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:167px;">OA-SYS heating system</td>
			<td style="width:163px;">Organomation Associates, Inc</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:183px;">Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">12-position vacuum manifold</td>
			<td style="width:163px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:167px;">Strata NH2 (55&#181;M, 70&#197;) 100mg/mL SPE cartridges</td>
			<td style="width:163px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:119px;">8B-S009-EAK</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Glass pipette tips</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20C</td>
			<td style="width:183px;">Used to transfer sample to SPE column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:167px;">Plastic pipette tips</td>
			<td rowspan="2" style="width:163px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1182-1830</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;">Used when glass tips are not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:119px;">1182-8810</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-681-320</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:167px;">Graduated glass pipets</td>
			<td rowspan="2" style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-678-27B</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;">Used to transfer organic solvents during sample prep</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:119px;">13-678-27E</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">Pyrex glass culture tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">99499-16X</td>
			<td style="width:183px;">Used to store aqueous and lipid fractions until the next step</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5182-0545</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Snap cap vials for autosampler vials</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5182-0541</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Glass inserts</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5183-2085</td>
			<td style="width:183px;">Used for small sample volumes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Mass Hunter Qualitative Analysis software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.06.00</td>
			<td style="width:183px;">Used to monitor retention times and pressure curves</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Mass Hunter Quantitative Analysis software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.05.02</td>
			<td style="width:183px;">Used to analyze quality control and sample data</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">Mass Profiler Professional software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.12.50</td>
			<td style="width:183px;">Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-step preparation technique to recover multiple metabolite compound classes for in-depth and informative metabolomic analysis

メタボロミクスは、生物学的プロセスへの洞察を得るために、生物からのサンプルのプロファイリングを可能にし、新興分野である。メタボロミクスの重要な側面は、一貫性のない技術が信頼できない結果を生成することにより、サンプル調製である。この技術は、4つの別個のクラスに代謝産物を分画するための手段として、タンパク質沈殿、液 - 液抽出、固相抽出を包含する。感度が増加した少量の分子の改善された濃縮が得られ、最終的には分子のより確実なIDになるさ。この技術は、血漿、気管支肺胞洗浄液、および50μlと低い容量で脳脊髄液のサンプルに適用されている。サンプルは、複数のダウンストリームアプリケーションに使用することができ;例えば、タンパク質の沈殿から得られたペレットは、後の分析のために保存することができる。そのステップからの上清を用いた液 - 液抽出を受け水と親水性と疎水性の化合物を分離するための強力な有機溶剤。分画されたら必要でない場合には、親水性層は、後の分析のために処理または廃棄することができる。疎水性の画分をさらに、脂肪酸、中性脂質、及びリン脂質に分離するための3つの固相抽出工程の間に一連の溶媒で処理する。これは、技術者の一群の化合物を分析のために好ましいかを選択する柔軟性を可能にする。化学クラスのいくつかの知識が存在するので、それはまた、より信頼性の高い代謝物同定に役立つ。

全サンプル調製技術は、上述したように実施し、最も重要なおよび/または関連する側面を以下に示す。親水性と疎水性の内部標準は、様々​​な抽出方法を使用して、内部基準や内因性代謝物の存在量の直接的な比較を行うためにプールされた血漿サンプルにスパイクした。液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）データは、定性的および定量的なソフトウェアを用いて分析し、優れた回復および内因性化合物および内部標準の両方の分離をもたらした。 図1は、脂質の基準の両方を抽出するMTBE-SPE法の有効性を実証（A）及び内因性化合物（B）。 全体的に、より良い抽出、代謝物の適用範囲は、メタノール抽出、または「MTBEのみ」の抽出などの他の方法に比べて入手した際に数Ofの特徴は、LC-MS分析は、以下の定性的および定量的なソフトウェアを用いて比較した。例えば、メタノール抽出のみを使用して、クレアチニン3-Dについての変動は15.2％であった。しかし、MTBE LLEと、これは1.04％のCVに減少した。 MTBEを使用して、脂質および水性化合物の再現性脂質および水性化合物についてそれぞれ29％および15％のより大きな変動をもたらした単純メタノール抽出に比べて、&lt;それぞれ8％、&lt;5％であった。内部脂質の回収率を監視するために使用される標準-テストステロン-D 2、C17セラミド、PC午後3時、午前17時00及びPEは、単独で、メタノールを使用する場合と比較してそれぞれ26％、200％、100％、400％増加した。同様の増加は、脂肪酸内部標準およびホスファチジルコリンとphosphotidylethanolamine内因性代謝物が検出された。このようなスフィンゴシン、セラミド、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール、コレステロール、およびスフィンゴミエリンなどの他の内因性代謝物が検出されなかったのどちらかメタノールを使用するか、または無視できるレベルで検出された。しかしながら、これらの内因性脂質​​は、容易にMTBE抽出を用いて検出した。 標準的なプロトコルを比較する我々の分析では、以下の結果が得られた：メタノール沈殿は、単独で1,851代謝産物を生じ、メタノール、エタノール沈殿が2,073代謝産物を与えた、液 - 液抽出によりMTBEを液 - 液と回収固相抽出で3,125、およびMTBEを与え3806代謝物。低下によるイオン抑制前のLC-MSにクリーナーをサンプルに、最も可能性の高い抽出される代謝物の多い数のため、このアプローチは結果。 図2は、より自信を持って代謝物同定のための彼らのそれぞれの化学クラスに疎水性の代謝物を分離する効率を実証している。 SPEを次の3つの脂質画分で同定された化合物の最小限の重複がある。サポートでは、 図3に示す図ISTDのは、それらの化学クラスに関連する画分に溶出したことを証明する内部標準の回収率。 品質管理サンプルは、サンプル調製の品質を評価するための分析の複数の日大きなサンプルセットのために必要とされるときに、バッチ効果を決定するために、機器の再現性をモニターするために使用される。クロマトグラムを、スパイクイン規格は±5％未満の未満±3 ppmおよびリテンションタイムウィンドウの質量誤差で回収、90％以上であることを確認するために検査されています。これらの基準が満たされない場合、結果は破棄され、サンプルが再分析される。保持力のシフトは、1つのバッチについて観察されるバッチ効果の場合には、データ解析ソフトウェアは、これを補正することができる。プールされた血漿試料の予め用意されたバッチは、サンプルの準備を行った。画分をオートサンプラーバイアルにサブ等分し、監視計器条件で使用するために-80℃で保存した。すべてのサンプル分析を通じてtions。 表1に、これらのスパイクにおける標準からの結果を示す。 QC試料のスパイクの基準の％CVが10％よりも大きかったので、脂肪酸負イオン化モード画分（データは表に示されていない）分析のために使用されなかった。その画分についてのデータセットは破棄され、従って、器具を検査し、維持した。 表2は、サンプル調製および三重注射器具の異なる3日以下の試料中の内因性代謝産物の結果を示す。試料調製QC試料中の内因性代謝物は、試料調製物の強度、ならびに器具注入再現性を意味する、すべての再現可能である。 試料調製工程が適切に従わない場合には、しかしながら、信頼性が低く、一貫性のない結果が得られる。 図4に結果を示すときにメソッドのタンパク質沈殿工程概説したように続いていません。 3つの演算子、A、B、およびCは、プールされた血漿サンプルで同じサンプル調製手順を行った。オペレータAは、むしろ実験プロトコルあたりの上清の必要量をピペットではなく、代わりに、ペレットの一部との両方の洗浄のために&gt;を1mlピペットで。これは、その端数のための偽陽性の数が多いとなった。しかし、データのばらつきが増大するだけでなく。 データの再現性クロマトグラフを図7に見ることができる。プールされた血漿サンプルは、このプロトコルに記載のようにタンパク質沈殿、液-液抽出、固相抽出を用いて別の日に三連で調製した。各画分は、プロトコルのセクション7に記載のクロマトグラフ分離を用いて分析した。次いで、試料を器具および試料調製の再現性を評価するために、LC-MSで三重に注入した。この一貫性の重複​​はシュトレングの両方を示しています三つの異なる日に調製した試料調製の再現性、ならびに再現性のある結果を生成するのにクロマトグラフィー法の強さの目。化学的なノイズの増加は、脂肪酸画分の負イオン化モードについて観察される。これは、LC-MSの溶媒中の汚染物質を発生し、一貫性のない定量的メタボロームの結果になることがあります。このため前9分に溶出された唯一の代謝物を分析した。 長いワークリストを実行すると、測定器の感度、緩衝液濃度の変化の損失が減少した信号強度と保持時間のずれが生じる時間の経過とともに発生する可能性があります。保持時間の重なり変動が5％未満であり、信号強度の変動が10％未満である場合、データは標準的な実験限界内である。解析ソフトウェアは、機器および保持時間ドリフトを補正するためにデータを整列し、正規化するために使用することができる。しかし、変化はLARである場合GEは、次いでその理由は、決定されなければならない。これは整流された後、サンプルを再分析することができる。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig1highres.jpg" width="500" /> 図1：抽出及び逆相クロマトグラフィー（RPC）12以下の脂質のISTD（A）および内因性代謝物（B）の存在量 。抽出を行い、得られた試​​料は、RPCを使用して分離し、正および負イオン化モードでLC-MSを用いて分析した。この図は、Yang ら 、 クロマトグラフィAのジャーナル 1300、217-226（2013）から変更されている。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。MTBE-SPE画 12 の比較 。各FRで特定され代謝物アクションは予備校のSPE部分でオーバーラップ量を特定するために比較された。ベン図中の数字は各画分で検出された代謝産物の数を反映している。ここではマイナーなオーバーラップは、SPE工程の間に成功した化合物の抽出と代謝物クラス分離を表す、3つの画分の間で観察されている。この図は、Yang ら 、 クロマトグラフィAのジャーナル 1300、217-226（2013）から変更されている。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。MTBE-SPE法 12を 用いて分画中のISTDの回収 。抽出を行い、得られた試​​料は、RPCを使用して分離し、本文に記載したように、正および負のモードでLCMSを用いて分析した。この図は、Yang ら 、 クロマトグラフィAのジャーナル 1300、217-226（2013）から変更されている。&lt;/ pの&gt; <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig4highres.jpg" width="500" /> 図4。3事業者が用意しペレット画分に起因する。三つの試料調製演算子A、B、およびCは、プールされた血漿試料上の同じタンパク質調製工程を行った。ベン図中の数字は、各オペレータによって検出された代謝物の数を反映している。オペレータAは500以上のより多くの代謝物質、大部分は、その特定の画分についての偽陽性であることで、その結果、全体の上清とペレットの一部をピペットでいる間事業者BとCは、サンプル調製プロトコルごとに、必要なボリュームをピペットで。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig5highres.jpg" width="500" /> 図5タンパク質沈殿工程の間にタンパク質ペレットの形成&lt;。/ strong&gt;の（A）ヒト血漿100μlの前に製剤をサンプリングするステップと、（B）プラズマ氷冷メタノールの添加後、18,000 xで15分間、0℃で遠心分離した後、管の底部に形成された（C）タンパク質ペレットグラム。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig6highres.jpg" width="500" /> 図6、液-液抽出（LLE）ステップの間に親水性と疎水性の層の分離 。有機溶媒をメチルtert-ブチルエーテル（MTBE）および水を親水性および疎水性の代謝物を分離するために使用した。 MTBE層は、非極性化合物を溶解し、水層を、極性化合物を溶解する（A）血漿上清タンパク質を除去した後、（B）プラズマを窒素下で乾燥した後、（C）は 、プラズマをMTBEの添加後; <str<html>オング&gt;（D）血漿およびMTBEに水を加え、遠心分離後に形成される（E）MTBEと水の層と、上部MTBE層（F）の除去、（G）MTBEを除去した後に残る主に親水性層。 <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig7highres.jpg" width="500" /> 図7。試料の調製は、3つの別々のプールされた血漿QCサンプルと、各試料で行った選択したデータセットからの画分のクロマトグラムを、LC-MS機器で三重に注入した。方法プロトコルのセクション7に示すLC-MSのパラメータを用いて取得した血漿試料の全イオンクロマトグラムである表される。他の生物学的液体のクロマトグラフ表現は、代謝物組成の違いにより異なります。「K&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="485"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="42"><td height="42" style="height:42px;width:85px;">分数</td><td style="width:72px;">イオン化モード</td><td style="width:127px;">内部標準</td><td style="width:23px;"> N </td><td style="width:103px;">平均ピーク面積</td><td style="width:77px;">ピーク面積％のCV </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">水性</td><td>ポジティブ</td><td>クレアチニン-D 3 </td><td> 31 </td><td> 2217311 </td><td> 3.8％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">中性脂肪</td><td>ポジティブ</td><td>トリグリセリド-D 5 </td><td> 31 </td><td> 4837032 </td><td> 9.9％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></tD&gt; <td></td><td> C17セラミド</td><td> 31 </td><td> 12736707 </td><td> 7.9％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">リン脂質</td><td>ポジティブ</td><td>午前15時のPC </td><td> 32 </td><td> 1248929 </td><td> 9.3％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td>午前17時、PE </td><td> 32 </td><td> 517234 </td><td> 7.9％ </td></tr></tbody></table> スパイク内標準から表1。精度管理の結果 。肺気腫のマウスモデルデータセットからプールした血漿サンプルを、このマルチ週間の研究のために日常的に器具の状態を監視するために分析した。定量分析ソフトウェアは、内部標準のピーク面積を決定するために使用される（nは具QC注入の数=）した。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="555"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="42"><td height="42" style="height:42px;width:85px;">分数</td><td style="width:76px;">イオン化モード</td><td style="width:212px;">内因性の代謝物</td><td style="width:103px;">平均ピーク面積</td><td style="width:80px;">ピーク面積％のCV </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">水性</td><td>ポジティブ</td><td>クレアチニン</td><td> 2554574 </td><td> 2.3％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td>バリン</td><td> 3712151 </td><td> 3.3％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td>グルコース</td><td> 2669190 </td><td> 6.9％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">中性脂肪</td><td>ポジティブ</td><td> 3-Dehydrosphinganine </td><td> 226644 </td><td> 3.9％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><tD&gt; DG（夜4時/ 16時01 / 0:0） </td><td> 11301 </td><td> 8.2％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> DG（P-14：0/18：1） </td><td> 364119 </td><td> 1.9％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">リン脂質</td><td>ポジティブ</td><td> PC（24:0 / 0:0） </td><td> 27599 </td><td> 0.9％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> PC16：0/22：6） </td><td> 2873326 </td><td> 4.5％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> PI（午前16時00分/ 18時01） </td><td> 112998 </td><td> 4.4％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">脂肪酸</td><td>ポジティブ</td><td> -10 - オキソ-5,8 - デカジエン酸</td><td> 1363284 </td><td> 2.3％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 16 - オキソ-ヘプタデカン酸</td><td> 83700 </td><tD&gt; 2.9％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 2 - メチル吉草酸</td><td> 285782 </td><td> 5.7％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">脂肪酸</td><td>負</td><td> 10 - ヒドロキシ-8 - オクタデセン酸</td><td> 10042 </td><td> 4.9％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> （R） - laballenic酸</td><td> 173929 </td><td> 6.5％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 2 - ケト吉草酸</td><td> 35488 </td><td> 6.0％ </td></tr></tbody></table> 内因性の代謝産物から表2の品質管理の結果。ヒト疾患セットからプールされた血漿サンプルを別々の日に試料調製の再現性をモニターするために分析された。サンプルは三日、第（n = 9分取QC注射）を介して連で調製した。

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Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis

メタボロミクス実験の結果の信頼性は、試料調製の有効性及び再現性に依存する。その後、数千の化合物まで分析すること、または関心のあるだけの化合物クラスのオプションを使用して生体液からの代謝物の抽出を可能にし、厳格かつ徹底的な方法について説明する。

綿密かつ有益な代謝解析のための複数の代謝化合物のクラスを回復するために多段階調製技術

Metabolomics is an emerging field which enables profiling of samples from living organisms in order to obtain insight into biological processes. A vital ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

32.2K ビュー.  National Jewish Health. メタボロミクス実験の結果の信頼性は、試料調製の有効性及び再現性に依存する。その後、数千の化合物まで分析すること、または関心のあるだけの化合物クラスのオプションを使用して生体液からの代謝物の抽出を可能にし、厳格かつ徹底的な方法について説明する。 

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Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

ナイフエッジスキャン顕微鏡用試料作製、イメージング、および解析プロトコル

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

生物工学

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

複数の異なった株を勉強するためのマイクロ流体デバイス

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3次元細胞培養のための自己申告足場

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

ゴールドナノロッドを含む細胞車の作製と光音響分析

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant adhesion strength than commercial tissue adhesives. Medical adhesives have attracted great attention as potential alternative tools to sutures and staples due to their convenience in usage with minimal invasiveness. Although there are several protocols for developing tissue adhesives including those commercially available such as fibrin glues and cyanoacrylate-based materials, mostly they require a series of chemical syntheses of organic molecules, or complicated protein-purification methods, in the case of bio-driven materials (i.e., fibrin glue). Also, the development of surgical glues exhibiting high adhesive properties while maintaining biodegradability is still a challenge due to difficulties in achieving good performance in the wet environment of the body. We illustrate a new method to prepare a medical glue, known as TAPE, by the weight-based separation of a water-immiscible supramolecular aggregate formed after a physical mixing of a plant-derived, wet-resistant adhesive molecule,&#160;Tannic Acid (TA), and a well-known biopolymer, Poly(Ethylene) glycol (PEG). With our approach, TAPE shows high adhesion strength, which is 2.5-fold more than commercial fibrin glue in the presence of water. Furthermore, TAPE is biodegradable in physiological conditions and can be used as a potent hemostatic glue against tissue bleeding. We expect the widespread use of TAPE in a variety of medical settings and drug delivery applications, such as polymers for muco-adhesion, drug depots, and others.

We describe the simplest protocol to prepare biodegradable medical glue that has an effective hemostatic ability. TAPE is a water-immiscible supramolecular aggregate prepared by mixing of tannic acid, a ubiquitous compound found in plants, and poly(ethylene) glycol, yielding a 2.5 times greater water-resistant adhesion compared with commercial fibrin glue.

TAPE：手術アプリケーションのための植物でユビキタス化合物に触発された生分解性止血グルー

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

複数の色で高速構造化照明TIRF顕微鏡のガイド

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

バルブ付き多層マイクロ流体デバイスのための多段階可変高さのフォトリソグラフィ

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

キャピラリー配列で複数の核酸の視覚的検出

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...