Name: the mplex protocol for multi-omic analyses of soil samples
Uploaded: 2018-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples at JoVE.com

著者らは、彼について数字を準備ネイサン ジョンソンを感謝したいです。この研究は、米国エネルギー省のオフィスの生物学・環境研究 (ゲノム科学プログラム)、移行 (ミント) 研究室研究開発の内細菌叢解析によって資金を供給されるパン オミックス プログラムによって支えられました。イニシアチブは、国家機関の健康国立環境衛生研究所 (R01 ES022190) と同様、太平洋の北西国立研究所で、NIH (P42 ES027704)。KEBJ は、R21 HD084788 新規マルチ弔抽出技術開発する金融支援を感謝したいです。この作品で、w. r. ワイリー環境分子科学研究所 (EMSL)、DOE 国立科学ユーザー施設で太平洋の北西国立研究所 (なり) を行った。なり、マルチ プログラム国立研究所契約 DE AC06 76RL01830 下 DOE のバテルが運営。

注: 非常にウェット土壌は抽出の有効性を損なうことがなく抽出前に凍結乾燥することができます。湿った土も使用できますが、特定の比率で試薬を追加する場合に考慮すべき。
注: 2 つの 50 mL チューブ (最大 50 mL チューブあたり 10 g 土) 間で分割する必要があります抽出あたりの乾燥した土壌重量の 20 g を使用することをお勧めします。抽出は、使用可能なサンプルに依存する上下に拡張できます。
注: 乾燥した土壌サンプルは均質化し、小さな根や岩を削除するために 3 mm のスクリーンを通してふるわれたことができます。サンプル画面でスタックを取得しますと、ウェット土壌試料をふるいないか。
1. 土壌のセル換散と代謝、蛋白質および脂質 (タイミング 〜 1 d) の抽出
<ol><li>20 g の土壌サンプルあたりメタノール/クロロホルム互換性のあるは、2 つの別の 50 mL チューブに 10 g の重量を量る。クロロホルムはほとんどのプラスチック、サンプルの汚染を溶出するように選択すると、チューブに非常に注意をします。ポリプロピレンまたはポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) から可能なまたはプラスチック管が行われるたびに、ガラスを使用します。 : 注意氷、クールな土壌初期の重量を量ると均質化の手順中に可能な限り。</li>
	<li>各管に 10 mL のクロロホルム洗浄ステンレスとガーネットのビーズを追加します。氷の上を追加 4 mL 冷たい超純水の各管 (2 つの管の間の 1 つのサンプル分割) に (浄化システムの材料の表を参照) を水し、ヒューム フードに氷バケットにサンプルを転送。</li>
	<li>25 mL ガラス製血清ピペットを使用して、簡単に 20 mL の冷たい 2:1 クロロホルム: メタノール (v/v) を追加します。 注意: クロロホルム: メタノールは潜在的な健康への急性影響: 皮膚刺激、可能な化学熱傷および呼吸器系への刺激。腎臓、肝臓、心臓に影響を与える可能性があります。適切な保護眼鏡、衣類、手袋を着用し、発煙のフードとは限りません。</li>
	<li>ソリューションには、蓋と渦を締めます。2:1 choloroform:methanol は原核生物の細胞壁を破ることができます、また酵素を不活性化します。</li>
	<li>可能であれば 50 mL チューブ渦添付ファイルと水平方向に冷蔵庫内の 4 ° C で 10 分間の渦にチューブを接続します。その後、完全にそれらを冷却するために 〜 15 分-80 ° C のフリーザーの中サンプルを置きます。</li>
	<li>30 に対する振幅 60% で 6 mm (1/4") プローブを各サンプルを超音波ヒューム フード内プローブ超音波発生装置を使用して s の各氷の上。 注意: sonicating ながら筐体と耳の保護を和らいでサウンドを使用することをお勧めします。高電圧は電源の供給と高周波ケーブルであります。アクティブ ・ プローブ; と下部またはサンプル容器の側面に触れないようにそれは亀裂、プラスチックを溶かします。</li>
	<li>多くの熱を生成することができます sonicating として 〜 15 分-80 ° C のフリーザーにサンプルを配置します。</li>
	<li>1.5 1.7 の手順を繰り返します。 注: サンプルは換散プロシージャ全体で寒い日になっていることを確認します。</li>
	<li>遠心分離機の 4 ° C、5 分間 4,000 x g でサンプルこの時点で、サンプルは上部の代謝物層、蛋白質中間層と下層脂質 (および残りの破片ペレット) に分離されます。図 1を参照してください。</li>
	<li>アイスバ ケットに氷のサンプルを場所外し、ヒューム フード、10 mL のガラス製血清ピペットを使用して、内部上部代謝物層 2 つの 50 mL チューブから 1 つの大きなガラスの瓶に。 注: を避ける; ピペットに蛋白質のレイヤーのいずれかを吸引必要な場合は、代謝物の小さな層をままにします。</li>
	<li>低脂質層に浮遊して蛋白質中間膜をリリースする 50 mL のチューブに少しだけ傾けます。きれいなステンレス フラット ヘッド ラボへらを使用して、慎重に蛋白質の中間層の両方をスクープ、一緒に 1 つの新しい 50 mL のチューブにそれらを置きます。</li>
	<li>25 mL ガラス製血清ピペットを使用して、1 つの大きなガラス瓶に下位の脂質層を削除します。 注: 意欲的な土壌粒子を回避しようとしてください。ただし、いくつかの土の破片や粒子を一緒に志しました脂質は後で削除されます。</li>
	<li>代謝と脂質の上に通気性膜ガラス瓶と真空濃縮乾燥まで乾燥 (脂質 4 〜 5 h、代謝産物の一夜)。</li>
	<li>タンパク質サンプル チューブおよび残りの破片ペレット チューブ、それぞれに冷たいメタノール 20 mL、渦を追加します。これは、それを投げる前に残骸から任意の可能な残りのタンパク質を可溶化する前に、クロロホルムを洗い流す破片ペレットのため。</li>
	<li>破片ペレットし蛋白質 4 ° C、5 分間 4,000 x g で層間、ヒューム フード内有害廃棄物コンテナーにメタノールをデカントを遠心します。</li>
	<li>蛋白質および残骸のペレットを液体窒素で凍結し、乾 (-105 ° C メタノール-98 ° C の凍結ポイントを非常に低いことが原因のことができるコレクター温度) とエアカーテン 〜 2 時間。 注: は過剰の可溶化が難しくなるために、ペレットを乾燥します。</li>
	<li>蛋白質中間チューブおよび破片ペレットのそれぞれに 20 mL にタンパク質の可溶化バッファー (4 %sds、100 mM DTT (DL ジチオトレイトール) 50 mM tris バッファー、pH 8.0; 参照補助試薬セットアップ) の 10 mL を追加します。 注意: SDS により、急性毒性、可燃性です。それは、皮膚、眼、気道刺激性です。手袋と安全メガネを着用してください。</li>
	<li>発煙のフード プローブ超音波 30 20% 振幅のサンプル ソリューションに持参する s。2 分の渦。</li>
	<li>300 rpm、50 ° C で 30 分間ラボ チューブ回転子にタンパク質の可溶化蛋白質の層間サンプルを配置します。</li>
	<li>水平渦任意の残りのままの細胞を溶解にさらに 10 分間破片サンプルと共に回転して残り 20 分間蛋白質層間のサンプル。</li>
	<li>すべての 10 分間、室温 (RT)、4,500 x g でサンプルを遠心し、サンプルあたり各管から 2 つの 50 mL チューブに上清を収集します。</li>
	<li>10 mL の可溶化バッファー蛋白質層間ペレットを超音波し、渦戻るソリューション、遠心分離前に追加します。</li>
	<li>固定角バケット ローター内の 4 ° C, 10 分間 8,000 × g で遠心分離機し、均等に 2 つの 50 mL チューブに培養上清を組み合わせます。 メモ: 最終的なの遠心分離は過度の汚染フミン物質を除去する必要が。</li>
	<li>これが各 30 mL がある 2 つの 50 mL チューブに培養上清をデカントします。その後、10 mL のガラス製血清ピペットを使用して、各管に TCA (トリクロロ酸) 7.5 mL を追加します。ソリューションに渦。これにより、20% 各 30 mL サンプルの TCA (調整) 注意: TCA は腐食性、有毒であり 5 月皮膚のやけどを引き起こします。手袋と安全メガネを着用してください。</li>
	<li>一夜にして 2 時間-20 ° C のフリーザーにサンプルを配置します。 注意: 蛋白質 1 h 以内通常沈殿させるが左一晩 (18 h まで) することができます。 注意: 蛋白質の酸加水分解可能なため 18 h より長く行く TCA 抽出てはいけないです。サンプルは凍結されている場合は; 氷の上それを解凍します。過去の雪解けのウォーム アップのサンプルを聞かせてはいけません。</li>
	<li>沈殿したタンパク質を餌に 4 ° C, 10 分間 4,500 x g でサンプルを遠心し、廃棄物に上清をデカントします。</li>
	<li>各蛋白ペレット、渦とペレットのような結合する 1 つの管に 100% 氷冷アセトン 10 mL を追加します。</li>
	<li>(バランスを使用)、結合された餌を含んでいる管を遠心し、廃棄物に上清をデカントします。 注意: アセトン気道や皮膚や目の炎症の原因し、は、可燃性の液体および蒸気。手袋・保護メガネと白衣を着用、ヒューム フードの仕事します。</li>
	<li>2 回 1.5 mL のアセトンおよび最終的に 5 分 10,000 x g で最後のスピンの 2 mL チューブへの転送を使用してペレットを洗浄します。</li>
	<li>廃棄物に上清をデカント乾燥ペレットを発煙のフードの 〜 20 分または窒素気流下における紙ワイプ倒立ペレットは少し亀裂を開始するまで許可する.</li>
	<li>ペレットのサイズによって、タンパク質の可溶化バッファーの 100-200 μ L を追加します。 注意: 可能な限り低くサンプルに追加可溶化バッファーのボリューム。その後フィルター支援サンプル準備 (FASP) のみ列ごとに可溶化されたサンプルの 50 μ L まで使用できます。いずれかはより複数の FASP 列に分割する必要があります。</li>
	<li>超音波および渦のソリューションにペレット。サンプルはその後遠心分離と削除されるタンパク質と共に沈降腐植物質による粘性かもしれないことに注意してください。</li>
	<li>ソリューションにタンパク質を可溶化し、タンパク質の消化に進む 300 rpm、40 ° C で 30 分間、インキュベーター/シェーカーでサンプルを振る。</li>
	<li>スナップは、タンパク質消化の準備ができるまで液体窒素、-80 ° C のフリーザーの店でサンプルを凍結します。</li>
</ol>2. 脂質準備 (タイミング 〜 20 分)
<ol><li>脂質サンプルは乾燥、バイアル、ソリューションに渦と 1.5 mL ポリプロピレン チューブに転送する 2:1 クロロホルム: メタノール 200 μ L を加えるガラス追加 200 μ L を追加バイアル、渦とピペットの残りの脂質とチューブに転送します。</li>
	<li>遠心分離機の 4 ° C で 5 分間、12,000 × g でサンプルから破片</li>
	<li>クロマトグラフィー-タンデム質量分析 (LC ・ MS/MS補正方法の詳細) まで脂質バイアル、-20 ° C でストアに上澄みを転送します。</li>
	<li>作製直後にサンプルを分析することはできません、する場合、脂質は酸化・劣化を防ぐために-20 ° C で溶剤に格納される必要があります。</li>
</ol>3. 代謝物の調製及び誘導体化 (タイミング 〜 5 h)
<ol><li>抽出の翌日には、速度 Vac から代謝物サンプルを削除し、GC での誘導体化と分析準備が整うまで-20 ° C で乾燥保存します。そうでない場合は楽器のための適切なプロトコルを使用してそれらを準備して GC での代謝産物を実行しています。</li>
	<li>前処理の直前に GC の分析のための代謝物はメタノール、ボルテックス、1.5 mL ポリプロピレン チューブに追加の 200 μ L の追加によって大規模なガラスの瓶からそれらを転送します。もう一度繰り返します。</li>
	<li>4 ° C、10 分間 12,000 × g でチューブを遠心分離します。小さなガラスの瓶に上清を移す、追加通気性膜上に速度 Vac で完全に乾燥します。</li>
	<li>サンプルバイアルと 30 の渦に methoxyamine 溶液 20 μ L を追加することによって、代謝を derivatize 上の中程度の速度で vortexer 秒。 注意: Methoxyamine 塩酸塩は重度の火傷や目に深刻な被害が発生、皮膚への接触により感作性を引き起こす可能性があります。安全眼鏡、手袋、白衣を着るとヒューム フード。</li>
	<li>風呂超音波発生装置を使用すると、サンプルを完全に溶解します。</li>
	<li>揺れ 1,000 rpm で 1 時間 30 分の 37 ° C で維持結露防止ふた付けインキュベーターでサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>キャップ表面に凝縮滴とサンプルを混合する 1 回のバイアルを反転します。1 分、右の 1,000 x g でサンプルをスピンダウンします。</li>
	<li>シリル化を実行 80 μ (注射器を使用して) N を追加-メチル - N-(トリメチルシリル) トリフルオロアセトアミド 1% トリメチルクロロシランと。10 秒のための渦。 注意: MSTFA + 1 %tmcs 皮膚腐食性、眼に対する重篤な損傷および特定標的臓器毒性を引き起こす可能性が、可燃性の液体および蒸気。安全眼鏡、手袋、白衣を着るとヒューム フード。</li>
	<li>揺れ 1,000 rpm で 30 分の 37 ° C で維持結露防止ふた付けインキュベーターでサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>キャップ表面に凝縮滴とサンプルを混合する 1 回のバイアルを反転します。</li>
	<li>スピン ・ ダウンした 2,000 x g で 5 分サンプル</li>
	<li>ガスクロマトグラフィー質量分析に適したバイアルに反応液を転送します。</li>
</ol>4. 蛋白質消化 (タイミング 〜 1 d)
<ol><li>5 分、任意の残骸をペレットに RT 15,000 × g のサンプルを遠心します。</li>
	<li>FASP を使用して消化キット (材料の表を参照してください) のフィルター支援サンプル準備 (FASP) を実行する次の製造元の手順31,32を変更します。<ol>
<li>FASP 列 (500 μ L 30 K MWCO スピン フィルター) に 8 M 尿素バッファーの 400 μ L を追加します。</li>
		<li>サンプルの遠心分離が終了すると、ピペットの上澄み (廃棄ペレット) を離れて、最大 50 μ L のサンプルを列で 8 M 尿素の 400 μ L に追加します。 注: は、列ごとにサンプルののみ最大 50 μ L を追加します。以上 50 μ L のサンプルの場合、複数の列を使用し、消化後、ペプチドを結合します。それは最高のこのボリュームを可能な限り低く残して (30 μ L が理想的です)、FASP を確保するために列が削除されます大量スペック解析を妨げることができます劇的に SDS のすべて。</li>
		<li>付属の 1.5 mL のチューブに列を置き、RT。 30 分 14,000 x g でサンプルを遠心分離</li>
		<li>廃棄物に流れを削除列に 8 M 尿素の 400 μ L を追加し、再び遠心分離します。</li>
		<li>3 尿素リンスの合計は 1 つのより多くの時間前の手順を繰り返します。 注: サンプル行く確認乾燥に近い列のいずれかがある場合以上 〜 30 μ L フィルターの各回転後、残り続ける遠心分離します。</li>
		<li>20 分間 14,000 x g で 50 mM NH4HCO3および遠心分離機の 400 μ L を追加、廃棄物を破棄、もう一度繰り返します。</li>
		<li>きれいな 1.5 mL 遠心チューブに列を転送します。</li>
		<li>列にトリプシン消化バッファーの 75 μ L を追加し、750 rpm で結露防止ふた付けインキュベーターで 3 h の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>50 mM NH4HCO3の 40 μ L を列に追加します。</li>
		<li>列の上に高分子量の汚染物質を保ちながらチューブにペプチドを収集するために 15 分間 14,000 x g でサンプルを遠心します。</li>
		<li>再度列と遠心分離機に 50 mM NH4HCO3の 40 μ L を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>列を捨てて、乾燥速度 Vac 〜 30 μ L と BCA 法 (ビシンコニン酸タンパク質アッセイ キット; 参照テーブルの材料) が管内にペプチドをペプチド。</li>
	<li>SDS の汚染は (目に見える泡)33を疑いがある場合、必要に応じて、クリーンアップ手順を実行します。このオプションを選択する場合、固相抽出法はその後行う必要があります。このクリーンアップ メソッドの詳細については、補助的な手段で利用可能です。</li>
	<li>MS 分析用サンプルを希釈または必要に応じて HPLC 分画 (次の 2 つの手順) に進みます.
</li>
	<li>分別、10 mM アンモニウム ギ酸緩衝 (pH 10.0) 400 μ L のボリュームにサンプルを希釈します。</li>
	<li>C18 カラムで解決 (材料の表を参照してください) pH 10.0/アセトニ トリル (10: 90) 10 mM ギ酸アンモニウムを 0.5 mL/分移動相 (A) 10 mM ギ酸アンモニウム, pH 10.0 および (B) を用いた高速液体クロマトグラフィー システムで区切ります。<ol>
<li>最小 10 を 70 分 85 に 70、85、95 分以上 30 %a で維持を 30%、65%、100%、95% は最初の 10 分、95% の上でから 65 %a へのグラデーションを調整します。</li>
		<li>100 パーセント分 95 に 105 以上で再平衡し、100% A 120 分まで押し続けます。</li>
		<li>分数 1.25 分毎に (全体のグラデーションの上 96 分数) を収集し、最後に 12 のサンプルまたは 24 サンプルの各行の合計のすべての行を組み合わせる (各 n = 8 または n = プール 4 分画)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>真空下ですべての画分を乾燥し、クロマトグラフィー-タンデム質量分析までそれぞれ-20 ° C で保存用に 15 μ L の純水を追加します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hultman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omics+of+permafrost,+active+layer+and+thermokarst+bog+soil+microbiomes.">Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes.</a> Nature. 521, 208-212 (2015).</li><li>White, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moleculo+long-read+sequencing+facilitates+assembly+and+genomic+binning+from+complex+soil+metagenomes.">Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes.</a> mSystems. 1, (2016).</li><li>White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past,+present+and+future+of+microbiome+analyses.">The past, present and future of microbiome analyses.</a> Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).</li><li>Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+integrating+data+to+uncover+genotype-phenotype+interactions.">Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions.</a> Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).</li><li>Jansson, J. K., Baker, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-omic+future+for+microbiome+studies.">A multi-omic future for microbiome studies.</a> Nat Microbiol. 1, (2016).</li><li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+and+considerations+when+selecting+a+quantitative+proteomics+strategy.">Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy.</a> Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).</li><li>Marx, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+proteomics.">Targeted proteomics.</a> Nat Methods. 10, 19-22 (2013).</li><li>Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics.">Targeted metabolomics.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2012).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).</li><li>Nakayasu, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MPLEx:+a+Robust+and+Universal+Protocol+for+Single-Sample+Integrative+Proteomic,+Metabolomic,+and+Lipidomic+Analyses.">MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses.</a> mSystems. 1, (2016).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).</li><li>Pomraning, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omics+analysis+reveals+regulators+of+the+response+to+nitrogen+limitation+in+Yarrowia+lipolytica.">Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica.</a> BMC Genomics. 17, 138 (2016).</li><li>Tisoncik-Go, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Omics+Analysis+of+Pathogenic+Host+Responses+during+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus+Infection:+The+Crucial+Role+of+Lipid+Metabolism.">Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism.</a> Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).</li><li>Kyle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+biologically+significant+lipid+isomers+with+liquid+chromatography,+ion+mobility+spectrometry+and+mass+spectrometry.">Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry.</a> Analyst. 141, 1649-1659 (2016).</li><li>Lovelace, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silymarin+Suppresses+Cellular+inflammation+by+inducing+reparative+stress+signaling.">Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling.</a> J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).</li><li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diel+metabolomics+analysis+of+a+hot+spring+chlorophototrophic+microbial+mat+leads+to+new+hypotheses+of+community+member+metabolisms.">Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms.</a> Front Microbiol. 6, 209 (2015).</li><li>Pomraning, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Metabolomic,+Lipidomic+and+microscopic+profiling+of+Yarrowia+lipolytica+during+lipid+accumulation+identifies+targets+for+increased+lipogenesis.">Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis.</a> PLoS One. 10, e0123188 (2015).</li><li>Huang, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fungus+gardens+of+leaf-cutter+ants+undergo+a+distinct+physiological+transition+during+biomass+degradation.">The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation.</a> Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).</li><li>Deatherage Kaiser, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Omic+View+of+Host-Pathogen-Commensal+Interplay+in+Salmonella-Mediated+Intestinal+Infection.">A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection.</a> PLoS One. 8, e67155 (2013).</li><li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+modulates+metabolism+during+growth+under+conditions+that+induce+expression+of+virulence+genes.">Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes.</a> Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).</li><li>Ansong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-omic+systems+approach+to+elucidating+Yersinia+virulence+mechanisms.">A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms.</a> Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).</li><li>Bordbar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-driven+multi-omic+data+analysis+elucidates+metabolic+immunomodulators+of+macrophage+activation.">Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation.</a> Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).</li><li>Hu, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+response+of+human+skin+tissue+to+low+dose+ionizing+radiation.">Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation.</a> Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).</li><li>Perera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+virus+infection+perturbs+lipid+homeostasis+in+infected+mosquito+cells.">Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells.</a> PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversed-phase+capillary+ultra-performance+liquid+chromatography-mass+spectrometry+(UPLC-MS)+method+for+comprehensive+top-down/bottom-up+lipid+profiling.">A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling.</a> Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).</li><li>Sorensen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbations+in+the+lipid+profile+of+individuals+with+newly+diagnosed+type+1+diabetes+mellitus:+Lipidomics+analysis+of+a+Diabetes+Antibody+Standardization+Program+sample+subset.">Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset.</a> Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).</li><li>Diamond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+proteome+and+lipidome+profiles+reveal+hepatitis+C+virus-associated+reprogramming+of+hepatocellular+metabolism+and+bioenergetics.">Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).</li><li>Alquier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+GPR40+impairs+glucose-induced+insulin+secretion+in+vivo+in+mice+without+affecting+intracellular+fuel+metabolism+in+islets.">Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets.</a> Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+accurate+mass+and+time+tag+approach+in+studies+of+the+human+blood+lipidome.">Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).</li><li>Rasmussen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+virology+identifies+a+mitochondrial+fatty+acid+oxidation+enzyme,+dodecenoyl+coenzyme+A+delta+isomerase,+required+for+hepatitis+C+virus+replication+and+likely+pathogenesis.">Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis.</a> J Virol. 85, 11646-11654 (2011).</li><li>Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+and+digestion+for+proteomic+analyses+using+spin+filters.">Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters.</a> Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat Methods. 6, 359-362 (2009).</li><li>Zhou, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+sodium+dodecyl+sulfate-assisted+sample+preparation+method+for+LC-MS-based+proteomics+applications.">Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications.</a> Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).</li><li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+abundance+of+type+III+secretion+system-inducing+signals+in+Arabidopsis+mkp1+enhances+resistance+against+Pseudomonas+syringae.">Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).</li><li>Chourey, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cellular+lysis/protein+extraction+protocol+for+soil+metaproteomics.">Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics.</a> J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).</li><li>Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+probabilities+and+generating+functions+of+tandem+mass+spectra:+a+strike+against+decoy+databases.">Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases.</a> J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).</li><li>Kim, S., Pevzner, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS-GF++makes+progress+towards+a+universal+database+search+tool+for+proteomics.">MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics.</a> Nat Commun. 5, 5277 (2014).</li><li>Cole, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototrophic+biofilm+assembly+in+microbial-mat-derived+unicyanobacterial+consortia:+Model+systems+for+the+study+of+autotroph-heterotroph+interactions.">Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions.</a> Front Microbiol. 5, (2014).</li><li>Isaacson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+extraction+techniques+for+enhanced+proteomic+analysis+of+plant+tissues.">Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues.</a> Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

それは、すべてではない所が同じ利用可能な機器特定のメソッドは、たとえば散のステップを合わせることができるので注意してください。ここで我々 はボルテックスと sonicating、ただし 50 mL の大きいビード ビーターの使用動作を使用します。-105 ° C のコレクターの温度とエアカーテンを使用できない場合は、窒素気流下におけるサンプルを乾かすことができます。また土壌の種類が大き?...

炭素循環と気候変動を理解するための重要な含意がある土壌微生物の評価最近の研究はしかし各種土壌中の細菌のゲノムをシーケンスの欠如など検出される蛋白質の多くの未知関数の難しさを強調しています。これらの課題は、1,2,3これまで知られている最も複雑な微生物群集をされている土壌から起因します。メタゲノム、metatranscriptomic、metaproteomic、メタボローム、リピドミクス研究からの結果を組み合わせると、マルチ弔分析は存在中の微生物により深い理解を得るために多数の土壌調査で最近実装されています。環境変動1,4、5のため起きている分子変化について包括的な情報を取得します。マルチ本腰を入れて研究課題の 1 つは質量分析法 (MS)-ベース metaproteomic、メタボローム、リピドミクスの測定通常各 MS の互換性6,7に本腰を入れての特定抽出処理が必要,8,9. これらの正確な手順を作るその実装非常に困難または不可能なときだけのサンプルの数量限定。これらの課題は、方法の検討を同時代謝・蛋白質・脂質抽出 (MPLEx) 小さいサンプル ボリュームまたは固まりを使用して、精度、およびすべての 3 つの解析の高速サンプル準備を提供することができる私たちを求めています。10. までに、これらの目標をすべて達成することができます代替土壌抽出手順がないです。
グローバル マルチ弔単一の土壌サンプルの分析を有効にするには、クロロホルム、メタノール、水分離に基づく有機溶媒抽出プロトコルは利用10だったこのメソッドは総脂質抽出9,11のために開発、最近では単一のサンプル12,13 代謝、蛋白質および脂質の同時抽出のため改正されました。、14,15,16,17,18,19,20,21,22、 23,24,25,26,27,28,29,30より少ないサンプル量を有効にして実験的変動10。MPLEx プロトコルでクロロホルムは異なる画分にサンプル成分の三相の化学分離のための基礎を提供する水と混和性ではありません。トップの水相にはしたがって蛋白質ディスクおよび脂質層の順下クロロホルム段階 (図 1) で親水性の代謝物が含まれます。ほとんどの土に MPLEx を適用すると、微粒子の残骸はサンプリング チューブの一番下で蓄積し、すべてのレイヤーが収集された後に破棄することができます。各土壌の種類が異なる、ただし、泥炭などの高有機質土、土の破片中間層にとどまり、サンプリング チューブの底にも該当しません。MPLEx マルチ弔解析で同じサンプル低下 2) マルチ弔抽出 1) サンプルの少量を使用できるよう、同じサンプルから型複数分子を分離するときにいくつかの利点を提供します全体的に実験的変動と3) より多くのサンプルは、高スループット研究10はるかに速く準備できます。一緒にこれらの利点が評価土壌試料および彼らの複雑な微生物群集のより優れた計測機能を提供するために不可欠です。

<table><tbody><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td>Stored at -20&amp;deg;C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Stored at -20&amp;deg;C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.</td></tr><tr><td>Purified water from Millipore</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>Water purification system.</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6026</td><td>!Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses.</td></tr><tr><td>Soil protein extraction kit</td><td>MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen</td><td>30000-20</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>1M Trizma HCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2694</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td>!Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses.</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>Stored at -20&amp;deg;C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood.</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208884</td><td>!Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses</td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V528A</td><td>20&amp;micro;g vials</td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid protein assay kit</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Formate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09735</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td>!Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood.</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>!Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood.</td></tr><tr><td>Methoxyamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>226904</td><td>!Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.</td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>!Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.</td></tr><tr><td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69478</td><td>!Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water purification system</td><td>Millipore</td><td></td><td>model MPGP04001</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex Genie 2</td></tr><tr><td>Probe sonicator</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>model FB505</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>model 5810R</td></tr><tr><td>50mL tube swinging bucket rotor</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td>50mL fixed angle rotor</td><td>Eppendorf</td><td>FA-45-6-30</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>OHAUS</td><td></td><td>model V22PWE150IT</td></tr><tr><td>Serological pipette controller</td><td>Eppendorf</td><td>12-654-100</td><td></td></tr><tr><td>10mL, 25mL glass serological pipettes</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-27F, 13-678-36D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer with Thermotop</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015, 5308000003</td><td></td></tr><tr><td>0.9 &amp;ndash; 2.0 mm blend stainless steel beads</td><td>NextAdvance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>0.15 mm garnet beads</td><td>MoBio</td><td>13122-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stir plate</td><td>FisherBrand</td><td>11-100-16SH</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stir bar</td><td>FisherBrand</td><td>14512130</td><td></td></tr><tr><td>pH paper strips, pH range 0&amp;ndash;14</td><td>FisherBrand</td><td>M95903</td><td></td></tr><tr><td>15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103 21-108</td><td>chloroform compatible</td></tr><tr><td>50mL vortex attachment</td><td>MoBio</td><td>13000-V1-50</td><td></td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>FisherBrand</td><td>02-591-44</td><td></td></tr><tr><td>27.25x70mm glass vials</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>Breathe Easier plate membranes</td><td>Midwest Scientific</td><td>BERM-2000</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol wipes</td><td>Diversified Biotech</td><td>BPWP-1000</td><td></td></tr><tr><td>Heater shaker incubator</td><td>Benchmark, Incu-Shaker Mini</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analog rotisserie tube rotator</td><td>SoCal BioMed, LLC</td><td>82422001</td><td></td></tr><tr><td>Filter-Aided-Sample-Prep kit</td><td>FASP; Expedeon</td><td>44250</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Biotek, EPOCH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 Degree Celsius Freezer</td><td>Fisher</td><td>13986149</td><td></td></tr><tr><td>-80 Degree Celsius Freezer</td><td>Stirling Ultracold</td><td>SU78OUE</td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive ion trap mass spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velo</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters NanoEquityTM UPLC system</td><td>Millford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250mL media bottle</td><td>FisherBrand</td><td>1395-250</td><td></td></tr><tr><td>Waters vial</td><td>Waters</td><td>186002805</td><td></td></tr><tr><td>Glass MS sample vial and inserts</td><td>MicroSolv</td><td>9502S-WCV, 9502S-02ND</td><td></td></tr><tr><td>Glass HPLC vial and snap caps</td><td>MicroSolv</td><td>9512C-0DCV, 9502C-10C-B</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 96-well plate</td><td>Agilent</td><td>5042-6454</td><td></td></tr><tr><td>Large glass vial 27.25x70mm</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td>7934021</td><td></td></tr><tr><td>Polished stainless steel flat head spatula</td><td>Spoonula; FisherBrand</td><td>14-375-10</td><td></td></tr><tr><td>Kim wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34721</td><td></td></tr><tr><td>XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 &amp;mu;M with 4.6x20 mm guard column</td><td>Waters</td><td>186003117, 186003064</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1100 series HPLC system</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1380-90000</td><td></td></tr><tr><td>1.7mL centrifuge tube</td><td>Sorenson</td><td>11700</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50&amp;micro;L and 250&amp;micro;L</td><td>Hamilton</td><td>81517, 80975, 81175</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette Bulbs</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z111597</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Branson 1800 Ultrasonic Cleaner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Centrifuge</td><td>Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin Columns, C18 Silica</td><td>The Nest Group</td><td>SEM SS18V</td><td></td></tr></tbody></table>

the mplex protocol for multi-omic analyses of soil samples

質量分析法 (MS)-ベースの統合された metaproteomic、メタボローム、リピドミクス (マルチ弔) 研究私たちの能力を理解し、環境および生物学的システムにおける微生物群集の特性を変形させています。これらの測定は、最も複雑な土壌微生物の有効な解析結果を有効にしても複雑な微生物システムの日付に知られています。別々 に抽出は通常準備時間と必要なサンプル量を大幅増幅の本腰を入れて研究に必要なのでマルチ弔解析では、ただし、サンプル準備課題を必要は。この制限に対処するため、同じ土壌サンプルから代謝、蛋白質および脂質 (MPLEx) の同時抽出法 3-1 では、溶剤ベースのアプローチの適応によって作成されました。この MPLEx プロトコルは、複雑な土壌サンプルの数量限定に利用する場合も簡単でかつ多くのサンプルの種類、強健をあると証明しました。MPLEx メソッドには、生物的および環境の摂動に起きている変化を評価しながらそれぞれの微生物のコミュニティのメンバーのより良い理解を得るために必要な高速マルチ本腰を入れて測定も大きく有効になります。

カンザス ネイティブ草原土壌 (Mollisol 土) から分子を抽出する MPLEx プロトコルを使用すると、帳票分析結果 3376 ペプチド、105 の脂質および提供 102 代謝物 (すべての一意の識別子)。MPLEx プロトコルは脂質代謝12,13,14,15,16,17</su...

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The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

同時に単一の土壌サンプルからの代謝、蛋白質および脂質の抽出、低下したサンプル準備時間を許して、数量限定でサンプルのマルチ弔質量分析を有効にするプロトコルが表示されます。

マルチ弔土壌試料の分析のための MPLEx プロトコル

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

the-mplex-protocol-for-multi-omic-analyses-of-soil-samples

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.9K ビュー.  Pacific Northwest National Laboratory. 同時に単一の土壌サンプルからの代謝、蛋白質および脂質の抽出、低下したサンプル準備時間を許して、数量限定でサンプルのマルチ弔質量分析を有効にするプロトコルが表示されます。

ビデオ: The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

遺伝学

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

免疫・感染学

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA sequences identified using computer software. Nanopore DNA sequencing is a flexible technique that allows for rapid microbial genome sequencing to identify bacterial and viral species, to characterize bacterial strains, and to detect genetic mutations that confer resistance to antibiotics. The advantages of nanopore sequencing (NS) for life sciences include its low complexity, reduced cost, and rapid real-time sequencing of purified genomic DNA, PCR amplicons, cDNA samples, or RNA. NS is an example of "strand sequencing" which involves sequencing DNA by guiding a single stranded DNA molecule through a nanopore that is inserted into a synthetic polymer membrane. The membrane has an electrical current applied across it, so as the individual bases pass through the nanopore the electrical current is disrupted to varying degrees by the four nucleotide bases. The identification of each nucleotide occurs by detecting the characteristic modulation of the electrical current by the different bases as they pass through the nanopore. The NS system consists of a handheld, USB powered portable device and a disposable flow cell that contains a nanopore array. The portable device plugs into a standard laptop computer that reads and records the DNA sequence using computer software.

Nanopore technology for sequencing biomolecules has wide applications in the life sciences, including identification of pathogens, food safety monitoring, genomic analysis, metagenomic environmental monitoring, and characterization of bacterial antibiotic resistance. In this article, the procedure for metagenomic soil DNA sequencing for species identification using the nanopore sequencing technology is demonstrated.

ナノポア DNA シーケンス メタゲノム土壌分析用

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

環境学

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

実験で多年生の草の根、根、土壌微生物の分離と解析

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

シングル スループット複雑な天然有機物の混合物の評価の補完的な高解像度分析の手法

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable photosynthetic models facilitating the understanding of the basic cellular processes. System wide studies enable comprehensive and in-depth understanding of molecular functions of the organisms. However, multiple independent samples and protocols are required for proteomics, lipidomics and metabolomics studies introducing higher error and variability. A robust high throughput extraction method for the simultaneous extraction of chlorophyll, lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample of the green alga Chlamydomonas reinhardtii is presented here. The illustrated experimental setup is for Chlamydomonas cultures synchronized using 12 h/12 h light/dark conditions. Samples were collected over a 24 h cell cycle to demonstrate that the metabolites, lipids and starch data obtained using various analytical platforms are well conformed. Furthermore, protein samples collected using the same extraction protocol were used to conduct detailed proteomics analysis to evaluate their quality and reproducibility. Based on the data, it can be inferred that the illustrated method provides a robust and reproducible approach to advance understanding of various biochemical pathways and their functions with greater confidence for both basic and applied research.

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

System-wide analysis of multiple biomolecules is crucial to gain functional and mechanistic insights into biological processes. Hereby, an extensive protocol is described for high throughput extraction of lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample harvested from synchronized Chlamydomonas culture.

緑藻クラミドモナス・ラインハルトティの同期培養物の詳細分析のためのマルチオミクス抽出法

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...

発生生物学

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect and quantify hundreds of thousands of metabolite features. However, the application of these techniques to a large number of samples is subject to more complex interactions, particularly for genome-wide association studies (GWAS). This protocol describes an optimized metabolic workflow, which combines an efficient and fast sample preparation with the analysis of a large number of samples for legume crop species. This slightly modified extraction method was initially developed for the analysis of plant and animal tissues and is based on extraction in methyl tert-butyl ether: methanol solvent to allow the capture of polar and lipid metabolites. In addition, we provide a step-by-step guide for reducing analytical variations, which are essential for the high-throughput evaluation of metabolic variance in GWAS.

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

In this protocol, we present an optimized workflow, which combines an efficient and fast sample preparation of many samples. In addition, we provide a step-by-step guide to reduce analytical variations for high-throughput evaluation of metabolic GWAS studies.

大規模マルチオミクスゲノムワイド関連研究(Mo-GWAS):サンプル調製と正規化のためのガイドライン

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

生化学

Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during development and in disease states. Single-cell RNA sequencing allows us to comprehensively profile gene expression changes observed in retinal development and disease at a cellular level, while single-cell ATAC-Seq allows analysis of chromatin accessibility and transcription factor binding to be profiled at similar resolution. Here the use of these techniques in the developing retina is described, and MULTI-Seq is demonstrated, where individual samples are labeled with a modified oligonucleotide-lipid complex, enabling researchers to both increase the scope of individual experiments and substantially reduce costs.

Here, the authors showcase the utility of MULTI-seq for phenotyping and subsequent paired scRNA-seq and scATAC-seq in characterizing the transcriptomic and chromatin accessibility profiles in retina.

scRNA-SeqおよびscATAC-Seqを用いた網膜遺伝子発現およびクロマチンアクセシビリティの多重化解析

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during ...

神経科学

High-throughput and Deep-proteome Profiling by 16-plex Tandem Mass Tag Labeling Coupled with Two-dimensional Chromatography and Mass Spectrometry

Isobaric tandem mass tag (TMT) labeling is widely used in proteomics because of its high multiplexing capacity and deep proteome coverage. Recently, an expanded 16-plex TMT method has been introduced, which further increases the throughput of proteomic studies. In this manuscript, we present an optimized protocol for 16-plex TMT-based deep-proteome profiling, including protein sample preparation, enzymatic digestion, TMT labeling reaction, two-dimensional reverse-phase liquid chromatography (LC/LC) fractionation, tandem mass spectrometry (MS/MS), and computational data processing. The crucial quality control steps and improvements in the process specific for the 16-plex TMT analysis are highlighted. This multiplexed process offers a powerful tool for profiling a variety of complex samples such as cells, tissues, and clinical specimens. More than 10,000 proteins and posttranslational modifications such as phosphorylation, methylation, acetylation, and ubiquitination in highly complex biological samples from up to 16 different samples can be quantified in a single experiment, providing a potent tool for basic and clinical research.

Presented here is an optimized high-throughput protocol developed with 16-plex tandem mass tag reagents, enabling quantitative proteome profiling of biological samples. Extensive basic pH fractionation and high-resolution LC-MS/MS mitigate ratio compression and provide deep proteome coverage.

Isobaric tandem mass tag (TMT) labeling is widely used in proteomics because of its high multiplexing capacity and deep proteome coverage. Recently, an ...

マルチ弔土壌試料の分析のための MPLEx プロトコル

要約

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探索ルートマイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

ナノポア DNA シーケンスメタゲノム土壌分析用

実験で多年生の草の根、根、土壌微生物の分離と解析

シングルスループット複雑な天然有機物の混合物の評価の補完的な高解像度分析の手法

緑藻クラミドモナス・ラインハルトティの同期培養物の詳細分析のためのマルチオミクス抽出法

大規模マルチオミクスゲノムワイド関連研究(Mo-GWAS):サンプル調製と正規化のためのガイドライン

scRNA-SeqおよびscATAC-Seqを用いた網膜遺伝子発現およびクロマチンアクセシビリティの多重化解析

High-throughput and Deep-proteome Profiling by 16-plex Tandem Mass Tag Labeling Coupled with Two-dimensional Chromatography and Mass Spectrometry

マルチ弔土壌試料の分析のための MPLEx プロトコル

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探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

ナノポア DNA シーケンス メタゲノム土壌分析用

実験で多年生の草の根、根、土壌微生物の分離と解析

シングル スループット複雑な天然有機物の混合物の評価の補完的な高解像度分析の手法

緑藻クラミドモナス・ラインハルトティの同期培養物の詳細分析のためのマルチオミクス抽出法

大規模マルチオミクスゲノムワイド関連研究(Mo-GWAS):サンプル調製と正規化のためのガイドライン

scRNA-SeqおよびscATAC-Seqを用いた網膜遺伝子発現およびクロマチンアクセシビリティの多重化解析

High-throughput and Deep-proteome Profiling by 16-plex Tandem Mass Tag Labeling Coupled with Two-dimensional Chromatography and Mass Spectrometry

探索ルートマイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

ナノポア DNA シーケンスメタゲノム土壌分析用

シングルスループット複雑な天然有機物の混合物の評価の補完的な高解像度分析の手法