より大きな人口を調査するには、機械駆動の変動が伴い、これにより、実際の変動は自然の多様性に由来する。ここでは、ダウンストリーム統合分析の技術的変動を低減する方法を示します。この技術の利点には、顔分離ベースの抽出が含まれ、全身誤差を除去し、生物学的分散を維持しながら、それぞれの分析プラットフォーム上で様々な代謝産物の分析を提供する。
遺伝子型および表現型情報が取得されると、この方法は、あらゆる生命王国のあらゆる多様な自然集団に適用することができる。20ミリリットルの収穫チューブを取り始めるには、均質化のために2つの5ミリメートルの5ミリメートルと2つの8ミリメートルの直径の金属ビーズを追加し、チューブにラベルを付けます。次いで、デュワーを液体窒素で満たし、切り出した直後に新鮮な葉および根組織サンプルを液体窒素で切り取り除き、フラッシュ凍結する。
回収した生物学的サンプルを摂氏80度で保管し、さらに処理します。チューブホルダーを液体窒素で予冷します。次に、組織を25ヘルツで1分間粉砕し、均一な粉末を得る。
凍結を繰り返し、組織が均質に粉砕されていない場合は粉砕する。予め冷却されたラベルの付いた2ミリメートルの安全ロック微量遠心チューブで50ミリグラムの新鮮な植物材料を計量し、計量プロセス中に植物材料が凍結したままになるようにします。予め冷却された抽出混合物1〜50ミリグラムの試料アリコートを1ミリリットル加え、氷上に保つ前にチューブを短時間ボルテックスする。
4°Cで10分間、800倍Gのオービタルシェーカー上でサンプルをインキュベートし、続いて氷冷超音波処理浴中で10分間超音波処理する。マルチチャンネルピペットを使用して、500マイクロリットルの抽出混合物もサンプルに加え、短時間のボルテックスによって抽出物を混合し、混合物を摂氏4度で5分間11,200倍Gで遠心分離する。遠心分離後、分離した上部脂質含有相の500マイクロリットルを予め標識された1.5ミリリットルの安全なロック微量遠心チューブに移し、残りの上部相を除去した。
別の1.5ミリリットルの安全ロックマイクロ遠心管では、150マイクロリットルの下部半極性相4つのGCMSおよび300マイクロリットルの半極性相4つのU-H-P-L-C MS 分析を移送します。溶媒蒸発に真空濃縮器を使用して、抽出されたすべての画分を加熱せずに濃縮し、乾燥した画分を摂氏20度で保存します。超高速用にサンプルを調製するために、液体クロマトグラフィー、質量分析、またはH-P-L-C MS 乾燥半極性画分をメタノールと水の混合物の180マイクロリットルに再懸濁します。
次いで、半極性相を2分間超音波処理し、続いて1分間11,200回Gで遠心分離する。遠心分離後、90マイクロリットルの上清をガラスバイアルに移し、2マイクロリットルの抽出物を注いだLCMSサンプルに注入する。40°Cに保持された逆相C18カラムで代謝産物分画を行い、流出液AおよびBの漸進的な変化を伴う毎分400マイクロリットルの流れを行い、102質量対電荷比の質量範囲を有する負イオン化モードで試験ブランクおよび品質管理サンプルの質量スペクトルを取得する。
半極性代謝産物サンプルについては、プールされたQCサンプルを負イオン化モードおよび正イオン化モードでデータ依存タンデム質量分析で実行します。得られた質量スペクトルをアノテーションに使用します。内部標準の分布を確認することにより、データセットの正規化を実行します。
単一または複数の内部標準の信号を補正して、データを正規化します。次に、クロマトグラムから得られたピーク強度を正確なサンプル重量に対して補正します。マルチバッチ系列全体の強度ドリフトを補正するには、R.ゲノムワイド関連研究またはGWASを実行する前に、タッセルを使用して5%未満のマイナー対立遺伝子頻度および欠損率が10%を超える遺伝子型データをフィルタリングする前に、R.を使用して局所推定散布図平滑化などのQCベースの補正方法を実行します。
これにより、低周波バイアスが回避されます。環境要因に起因するバイアスを排除するには、R パッケージ LME 4 を使用し、実験の繰り返しで正規化された各フィーチャについて、最適な線形で偏りのない予測またはブロップを計算します。R.R.のrMVPパッケージでGWASを実行するには、各機能のブロップを個別に使用して、いくつかの一般的な豆種にわたるリピドミクスデータは、異なるバッチからの2つのQCサンプルの生のベースピーククロマトグラムに基づいて示されています。
シグナル強度の変動が、特定の脂質クラスについて観察された。全身誤差は、主成分分析が生データに対して実行されたときにより明白であった。局所的に推定された散布図平滑化を含む正規化手順は、QCサンプルのクラスタリングにつながった。
個々のクラスターに分析すると、バッチ 7 と 8 のマシン駆動エラーが正規化の前に明らかになり、修正されました。正規化および形質転換後の個々のメタボロミクスクラスターをGWASに使用し、いくつかの形質マーカー関連をもたらした。代表的な解析では、異なる化合物クラスが異なる色で強調表示され、複数の化合物クラスに関連付けられたマーカーが最も近い遺伝子で示されます。
データの正規化と変換は、最も重要な手順の 1 つです。全身誤差を補正するために適切な補正が実行されていることを確認し、分布の正規性を確保します。分析的変動の補正を行うことによって、代謝相関分析および複雑な形質に光を当てるための現象データへの統合など、いくつかの統合アプローチを行うことができる。
