この技術は、貴重な患者サンプルをマウスに安全に注射して移植し、続いて骨髄を吸引することにより、骨髄の正常な造血と疾患の生物学をよりよく理解することを目的としています。静脈注射による実験のためには、少量の貴重なサンプルをマウスの骨髄に直接移植する方が効率的であることは以前から知られていました。しかし、実際のテクニカルビデオは存在しないため、一般的にはハードルの高いテクニックと考えられていました。
私たちのプロトコールは、貴重なサンプルを少数の細胞でマウスに簡単かつ安全に生着させることができます。この技術には高い需要があり、このビデオの助けを借りて、誰でもすぐにそれを学ぶことができます。この技術を皆さんが習得し、科学の発展に大きく貢献していただけることを願っています。
まず、20マイクロリットルのFACSバッファーまたは解凍培地を使用して、最大300万個のサンプル細胞を含む細胞懸濁液を調製します。注入前にこれらを氷上に保管してください。ポビドンヨードまたはクロルヘキシジンスクラブと70%エタノールに浸したガーゼスポンジのいずれかを使用して、注射する大腿骨を含む脚を3セットの交互のスクラブで消毒します。.
親指と人差し指で大腿骨をつまんで脚を安定させます。薬指または5本目の指で脛骨を押し、脛骨を大腿骨から曲げたままにします。注入を成功させるために、適切な位置決めを確保してください。
空の滅菌27G針の端を使用して、大腿骨の上部にある膝蓋腱をつつきます。最適な挿入ポイントを確保するために、膝蓋腱のすぐ下に付属のシリンジで27G針を挿入します。大腿骨の2つの顆の間にしっかりと固定し、針を外側と上に回転させて、大腿骨の軸と平行に位置合わせします。
針を大腿骨骨髄腔に進めながら、針を円を描くように回転させます。抵抗が著しく減少するまで針を挿入します。横方向の動きで正しい針の位置を確認します。
ニードルプランジャーを後ろに引いて、ニードルを骨髄腔内で動かして負圧を作り出します。注射器に血液または骨髄がないか確認し、針が骨髄腔内にあることを確認します。正しい針の配置を確認した後、ゆっくりと取り外し、同じルートに注射器を含む細胞を挿入します。
新しい針に切り替えるときは、最初の注入のルートと角度を覚えておくことが重要です。細胞が大腿骨に正常に注入されたら、注射器の圧力を維持しながら、針と注射器を慎重に取り外します。次に、マウスをノーズコーンから取り外し、清潔なペーパータオルの上に置いて、寝具の誤嚥を防ぎます。
回復のために、マウスを加熱パッドまたはその他の制御された面に置いてください。マウスラックに戻す前に、麻酔からの回復を確認してください。次の24時間でマウスに苦痛や感染の兆候がないか観察します。
骨髄を吸引する前に手順の準備をすることから始め、0.5ミリリットルの27GシリンジをCSMで濡らし、CSMを2〜3回充填して排出します。次に、麻酔をかけたマウスから骨髄を穏やかに吸引し、20〜50マイクロリットルの骨髄を生成します。次に、大腿骨から針を完全に取り外し、吸引したサンプルを500マイクロリットルのCSMに懸濁します。
マウスをノーズコーンから取り外し、清潔なペーパータオルの上に置いて、回復中の寝具の誤嚥を防ぎます。マウスラックの背面に置く前に、すべてのマウスを監視して麻酔からの回復を確認します。骨髄から細胞をペレット化し、摂氏4度で300Gで5分間回転します。
上清を吸引し、各チューブにACK溶解バッファーを添加します。細胞を再懸濁するために細胞をボルテックスし、氷の上に5〜10分間置きます。細胞懸濁液をナイロンメッシュでろ過して新しいチューブに入れます。
元のチューブをFACSバッファーですすぎ、ナイロンメッシュに通し、摂氏4度で300Gで5分間回転して細胞を再度ペレット化します。ペレット化した細胞から上清を吸引し、目的の抗体を含む染色溶液を添加します。チューブを氷の上に20分間置きます。
細胞を洗浄し、実験設定に従って分析に進みます。移植技術は、生物発光画像を用いて最小限のマウス侵入で容易に評価することができます。ここでは、ヒト由来のK562細胞株のAcalookへの移植が、注入された大腿骨の側面にある異種移植マウスモデルで観察されました。
CD34陽性HSPCの移植は、移植後8週間でヒト細胞の生着の10〜20%以上をもたらしました。同様に、臍帯血由来のHSCを移植すると、移植後8週間で最大10%のヒト生着がもたらされました。この手順を使用して、成人骨髄由来のHSPC、白血病幹細胞、CRISPR Cas9編集臍帯血由来のHSPC、および患者由来のAML iPS細胞の移植をさらに成功させました。
