R01HL106790、R01HL106790-S1、R01HL106786、R01AI089323、R21AI091457、R21RR026006、P20RR020159、C06RR017563、8T32OD011124-08、およびP51OD011104：著者らは、この研究のサポートについては、次のNIH賞/ subawardsを承認したいと思います。

2IDイメージングソフトウェアを使用した1。校正Mesodissectionインストゥルメント 2IDイメージングソフトウェアは、この記事の残りの部分のためのソフトウェアまたはプログラムのどちらかと呼ぶことにする。このステップは、画像を正しく追跡するだけでなく、複数のスライドフレームを整列するために必要とされる。 <ol><li>測定器とコンピュータの電源を入れます。 </li><li>オープンなソフトウェアと「校正器」を選択します。 </li><li>ジョイスティックを使用して、ステージの移動を校正します。左上の位置にステージを移動します。プログラムのステップ1の下を押して「S​​ET」。 </li><li>右の位置を下げるために、ステージを移動します。プログラムのステップ2の下を押して「S​​ET」。 </li><li>第1ヘッドアセンブリを上げるために「Zボタン」を押すことにより吸引を校正します。ジョイスティックを押して「吸引パルス」ボタンと「解剖」ボタンを押すと、プランジャー、制御棒までトップの位置に到達する。プログラムのステップ3の下を押して「S​​ET」。 </li><li>を押して「吸引リセット＆＃8221;ボタンを押します。プランジ​​ャーは、ステップ4の一番下の位置を押して「S​​ET」で停止したら。 </li><li> 「スケールタブ」をクリックします。 </li><li>空白の側でキャリブレーション定規を置きます。 </li><li>必要に応じて、顕微鏡の焦点を合わせる。 </li><li>マウスを使用して2のスケールバーの間に線を描画します。 </li><li>ステップ2。を押して「計算」ボタンラベルのボックスに距離を入力します。 </li><li> 「十字線」タブをクリックします。 1にモータ速度をオンにします。 </li><li>ヘッドアセンブリにxScisorを挿入します。 「z軸」ボタンを押すことにより、z軸準備位置に下部ヘッドアセンブリ。注：ヘッドアセンブリは、トップ解剖機器に大きな構造体である。 xScisorは、この記事の残りの部分のための消耗品旋削ビットと呼ぶことにする。 </li><li>ジョイスティックのボタンを「解剖がかみ合う」をクリックしてください。注：このボタンは、ジョイスティックの上に位置しています。 </li><li>視覚的に回転の中心を定義します。これを行うには、定義を用いて、回転の中心に十字の中心を移動するプログラムのステップ1においてdパラメータ。十字線を整列させるためにピクセルを調整するために、「X」と「Y軸」のバーで上下の矢印を使用してください。 「完了」タブをクリックします。 </li><li> 「ホーム」アイコンをクリックしてください。注：これは、右上隅に位置して家の画像で表されます。 </li></ol> 2。参照イメージを作成<ol><li>ステージ上でのH＆Eスライドを置きます。スライドの上に不透明のカバーを置きます。 H＆Eスライドの所望の領域にジョイスティックを移動することで、機器を駆動します。生成された画像を保存します。注：「捕獲リファレンス」タブまたは「解剖」タブのいずれかが、この手順を完了するために使用することができます。 </li></ol> 3。解剖のための組織の位置を合わせます<ol><li>ホーム画面の「組織を切開」オプションをクリックします。 </li><li> 「演算子」「解剖受託番号」「参照アクセッション番号」「xScisorのバーコード番号、「＆＃必要事項を記入8220;解剖流体ロット番号」「xScisorサイズ」と「設定」タブ内の「説明」。 </li><li> 「組織の検索」タブをクリックします。 </li><li>インポートは、以前に参照画像を保存した。 </li><li>ステージ上で5ミクロンの厚さの無染色のFFPEスライドを置きます。基準画像に描かれたものと同じエリアにステージを移動します。 「イメージの挿入」タブをクリックします。 </li><li> 「ALIGN」タブをクリックします。染色されていない画像を参照画像を位置合わせするために、マウスと関連する矢印を使用してください。 </li></ol> 4スライドに注釈を付ける<ol><li> 「注釈」タブをクリックします。 </li><li>顕微解剖され、スライドの所望の領域の周りに円を描くようにマウスを使用しています。 </li></ol> 5。消耗旋削ビットのロード<ol><li>流体の動きで上下に数回、プランジャーを引いて、ここでは必要なバッファー、PKDバッファーで消耗旋削ビットを埋める。空気を除外するようにしてください泡。 </li><li> 「Z軸ボタン」を押すことにより、Z軸を上げます。 </li><li>マシンに消耗旋削ビットをロードします。機械の上部に消耗旋削ビットをスライドさせて、これを行うことにより、消耗品の旋削ビット上の黒線で最大の機器のラインに白いライン。プランジ​​ャが正しい位置に下げることができるように押して、「吸引リセット」ボタンを押します。注：消耗旋削ビットをスライドさせて簡単にする必要があります。そうでない場合は、ノッチが正しく整列していることを確認してください。 </li><li>再度「Z軸」ボタンを押すことによりZ軸低級。 </li></ol> 6。組織を切開します（ 図4） <ol><li> 「解剖」タブを開きます。 </li><li> 1モータ及び吸引速度をオンにします。 </li><li> 「ショーの追跡」チェックボックスをオンにします。注：これは、ユーザが切開プロセス中に解剖領域を可視化することを可能にする。 </li><li>解剖する準備ができたら、ボタンを「従事」だけでなく、「吸引＆＃保持し続け8221;ボタン組織を切開するために反時計方向にジョイスティックを移動しながら。 </li><li>吸引は、「フル」タブが赤くなるまで反時計方向に解剖し続ける。 </li></ol> 7。消耗旋削ビットを空にして削除<ol><li>消耗旋削ビットの先端の下に0.5μlのマイクロチューブを配置します。 </li><li>を押して「吸引」制御棒はすぐにマイクロチューブにサンプルを取り出します。 </li><li>使用済み消耗品の旋削ビットを排出するために増加の力で押します。 </li><li>バックプランジャーを引いて組織片を洗浄します。消耗ミルビットに残りのサンプルを表現するために前方にプランジャーを押してください。組織片は現在、マイクロチューブの中に含まれます。 </li></ol> 8。プロテイナーゼK消化を溶解サンプルは、熱処理が続く<ol><li>組織サンプルを回復するためにプロテイナーゼK5μgのを含む70μlのTE pHが8.5を追加します。 </li><li>プログラム可能なヒーター·シェーカーにサンプルを置き、。 </li><li>以下の設定でプログラム可能なヒーター、振とう機を用いて完全消化：1,500 rpmで30分間60˚C; 1,500 rpmで15分間、82˚C; 450 rpmで1分間25˚C。サンプルは現在、ダウンストリームアプリケーションのための準備ができています。 </li></ol>

<ol>
	<li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+pathology.">Laser capture microdissection in pathology.</a> J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).</li><li>Esposito, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques:+laser+capture+microdissection--increasing+specificity+of+gene+expression+profiling+of+cancer+specimens.">Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens.</a> Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).</li><li>Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesodissection+of+Paraffin+Embedded+Slide+Mounted+Tissue+Sections.">Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).</li><li>Fleischmann, R. 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J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granuloma+correlates+of+protection+against+tuberculosis+and+mechanisms+of+immune+modulation+by+Mycobacterium+tuberculosis.">Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis.</a> J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).</li><li>Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+immunopathology+and+mortality+despite+tissue+persistence+in+a+Mycobacterium+tuberculosis+mutant+lacking+alternative+sigma+factor,+SigH.">Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).</li><li>Mehra, S., Kaushal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+reveals+extended+roles+of+the+Mycobacterium+tuberculosis+stress+response+factor+sigmaH.">Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH.</a> J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).</li><li>Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+the+transcriptional+profiles+and+the+physiological+states+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+an+extended+intracellular+infection.">Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection.</a> PLoS Pathog. 8 (6), (2012).</li><li>Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mycobacterium+tuberculosis+sigma+factor+sigmaB+is+required+for+full+response+to+cell+envelope+stress+and+hypoxia+in+vitro,+but+it+is+dispensable+for+in+vivo+growth.">The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth.</a> J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).</li><li>Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enduring+hypoxic+response+of+Mycobacterium+tuberculosis.">The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li></ol>

著者らは、競合する経済的利益がないことを開示している。

Mesodissectionは、病原体の広大な配列に起因する病理学的病変スライドからRNA抽出にも適用することができる技術である。これは、ユーザが画像を追跡し、画像を正しく整列させる必要があることである。これを達成するために、測定器はイメージングソフトウェアの指示に従って校正する必要があります。解剖すると解剖されている関心のスライドと面積が整列していない場合、ユーザは、?...

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>.

Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

サンプルは、伝統的に手動で針とメスを用いて、全組織またはスライドのいずれかから顕微解剖されています。これは、対象の組織切片と周囲の組織切片2との間に明確な分離を必要とする。分子プロファイリング技術の現在の進歩により、細胞レベルで組織を評価する必要性が高まってきた。により手動マイクロダイセクションの制限のため、LCMを含む技術が高いアイソレーションの精度を可能にするために設立された。この技術は、研究者は、そのような遺伝子発現プロファイリングのような下流アッセイのために使用することができる様々な細胞及びスライド型から特定の細胞集団を単離することができる。ダウンストリームアッセイのために非常に効果的ではあるが、LCMには限界がないわけではない。まず、LCMは、高価で時間のかかるプロセスである。さらに、RNA起因の不安定な性質のために、それは多くの場合、LCM試料2から高品質のRNAを得るために挑戦している。ディによるLCMのsadvantagesは、マイクロダイセクション技術の新たな進歩はまだ手頃な価格と時間に敏感な方法で、研究者がより多くのことをよりアクセシブルにするために必要です。 利用できるようになりまし顕微解剖技術の一つは、このような進歩は、mesodissectionとして知られている技術である。この技術では、機械は工場に関心のある注釈付き組織切片を使用し、消耗品の旋削ビット3にそれを吸引する。次に、このサンプルは、収集チューブ内に吸引し、下流の用途に使用することができる。このシステムの利点は、それが大幅に少ない費用と時間が敏感であることである。我々の経験では、システムは10分で肺肉芽腫組織切片の解剖を可能にします。一方、伝統的なLCM可能性が高いプロセスを完了するために時間が必要となる。このシステムは、オペレータが比較だけでなく、注釈のためのツールと​​して使用するために、参照スライドをロードすることができます。さらに報告書はアウトライン番目に生成されます解剖したスライドのEエリア。 mesodissectionするには2つの主な欠点があります。複数のセルを抽出するのに有効であるが、単一細胞を単離するために挑戦している。また、生成された画像の精度は他のイメージング顕微鏡を使用している場合ほど明確ではありません。 結核（TB）は、世界中の人間性とマウンテンバイクでの感染からの結果の主要な感染症キラーです。 マウンテンバイクのエーロゾルに暴露された個人の大半では、感染は潜伏限られている。毎年少なくとも10万人では、活動性結核4になる。潜伏感染時に、 マウンテンバイクは、肉芽腫として知られている病的な肺病変の中に含まれている。そのためには、 マウンテンバイクの感染の結果は肉芽腫5のレベルで決定されていると主張してきた。 ここでは、mesodissectionはマウンテンバイクに起因する肉芽腫を顕微解剖するために使用することができる方法を示します。スライドを使用感染したアカゲザルからのFFPE肺組織からのものである。このデモの目的のために、我々は、その全体が肉芽腫を分析します。我々はまた、RNAを回収した組織から抽出することができることを実証している。この技術は、様々な他の標本から組織サンプルに適用し、次いで、下流の種々のアッセイのために使用することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">MeSectr</td>
			<td style="width:113px;">AvanSci Bio</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:195px;">Mesodissector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">400 nm xScisors</td>
			<td>AvanSci Bio</td>
			<td></td>
			<td>Other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">THOR</td>
			<td>AvanSci Bio</td>
			<td></td>
			<td>Programmable Heater-Shaker</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NanoDrop2000</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy FFPE extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:108px;">73504</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ovation RNA-Seq FFPE System&#160;</td>
			<td>Nugen</td>
			<td align="right">7150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:108px;">28104</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel microdissection approach to recovering mycobacterium tuberculosis specific transcripts from formalin fixed paraffin embedded lung granulomas

顕微解剖は、10年以上にわたってDNA、RNA、およびタンパク質レベルでの組織の検査のために使用されている。レーザーキャプチャー顕微鏡（LCM）は本日、使用される最も一般的なマイクロダイセクション法である。この技術では、レーザーは、局所的に脱水された組織部1の上に重なる熱可塑性膜を溶融するために使用される。組織切片複合体は、その後持ち上げられ、膜から分離される。この技術は、組織検査のために首尾よく使用することができるが、それは時間がかかり、高価である。さらに、この技術を用いる手順が正常に完了し、したがって、その使用を制限する、レーザの使用を必要とする。 mesodissectionと呼ばれる新しい、より手頃な価格で実用的な顕微解剖法は、LCMの落とし穴に可能な解決策である。この技術は、ミルに取り付けられたスライド組織試料から所望の組織をMESO-1/MeSectr方式を採用し、同時に中に所望の組織試料を回収するための流体を分配し、吸引しながら消耗旋削ビット。解剖プロセスが始まる前に、ユーザは（FFPE）ホルマリン固定パラフィン包埋染色、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）参照スライド摺動整列する。その後、オペレータは、所望の解剖領域に注釈し、適切なセグメントを解剖に進む。プログラムは、解剖のアーカイブされた画像を生成する。 mesodissectionの主な利点は、この実験で世代をサンプリングするように設定から10分の平均を取って、スライドを分析するのに必要な短い期間です。さらに、システムを大幅に、より効果的なコストで使いやすいです。わずかな欠点は、レーザーキャプチャー顕微鏡法ほど正確ではないことである。この記事では、mesodissectionは、FFPEからのスライドからRNAを抽出するために使用する方法を示し結核菌（MTB）に起因する肉芽腫。

上記のプロトコルは、FFPE組織スライドからRNAを抽出するために、新しいmesodissection技術を使用する方法を示しています。このプロトコルの有効性は、様々な感染段階でマウンテンバイクに感染NHPからの肺肉芽腫のFFPEスライドを通して示されている。1〜3は 、機器のイメージである図 。 図4は、解剖のプロセスがどのように発生するか示しているし...

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A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

顕微解剖は、広範囲の組織内のDNA、RNA、およびタンパク質の試験のために使用されている。レーザーキャプチャー顕微鏡（LCM）は、最も一般的に使用される方法ですが、新しい製粉技術、mesodissectionは、最近になって提供されています。私たちは、 結核菌肉芽腫の組織スライドを組み込みmesodissectedホルマリン固定パラフィンからのRNA抽出を示しています。

回復への新規マイクロダイセクションアプローチ<em&gt;結核菌</em肺肉芽腫、ホルマリン固定パラフィン包埋から&gt;特異的転写

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

a-novel-microdissection-approach-to-recovering-mycobacterium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

7.9K ビュー.  Tulane National Primate Research Center. 顕微解剖は、広範囲の組織内のDNA、RNA、およびタンパク質の試験のために使用されている。レーザーキャプチャー顕微鏡（LCM）は、最も一般的に使用される方法ですが、新しい製粉技術、mesodissectionは、最近になって提供されています。私たちは、 結核菌肉芽腫の組織スライドを組み込みmesodissectedホルマリン固定パラフィンからのRNA抽出を示して?...

ビデオ: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

のサンプル調製<em&gt;結核菌</em核磁気共鳴代謝研究のための&gt;抽出

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

免疫・感染学

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

の成長結核バイオフィルム

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

自然送信時に結核マラリア重複感染を研究する実験モデル結核菌とマラリアベルゲイ</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

多剤耐性を実証<em&gt;結核菌</em&gt;増幅マイクロアレイ

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

16S rRNAのをターゲットジゴキシン標識DNAプローブを用いたパラフィン包埋組織内細菌のその場検出で

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル<em&gt;結核菌</em&gt;感染

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

18FDG PET/CT イメージング勉強結核感染と非ひと霊長類における治療のためのツールとしての解析

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

レポーター酵素蛍光を用いたマウスにおける結核菌をイメージング

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...