המחברים רוצים להכיר בפרסים / subawards הבא NIH לתמיכה של מחקר זה: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124 -08, וP51OD011104.

1. כיול Mesodissection כלי עם 2iD תוכנת הדמיה תוכנת ההדמיה 2iD תהיה המכונה גם את התוכנה או התכנית לשארית של מאמר זה. יש צורך בצעד זה כדי לעקוב בצורה נכונה את התמונה, כמו גם ליישר מסגרות שקופיות מרובות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מכשיר ומחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנה פתוחה ולבחור באפשרות &quot;מכשיר כיול&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל נסיעות שלב על ידי השימוש בג&#39;ויסטיק. הזז במה לעמדה השמאלית עליונה. &quot;סט&quot; עיתונות תחת שלב 1 בתכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז במה כדי להוריד את מיקום נכון. &quot;סט&quot; עיתונות תחת שלב 2 בתכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל את השאיפה על ידי הלחיצה הראשונה &quot;Z-כפתור&quot; להעלות מכלול ראש. לחץ על לחצן &quot;דופק לשאוב&quot; וכפתור &quot;נתיחה&quot; בג&#39;ויסטיק עד מוט שליטת הבוכנה מגיעים למיקום עליון. &quot;סט&quot; עיתונות תחת שלב 3 של תכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;איפוס ולשאוב8221 #; כפתור. ברגע שהבוכנה עוצרת ב&quot; הסט &quot;התחתון תפקיד העיתונות בשלב 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכרטיסייה &quot;הסולם&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שליט כיול בצד ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס מיקרוסקופ במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר קו בין שני הברים בקנה מידה באמצעות עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את מרחק תיבה שהכותרת לחץ על כפתור שלב 2. &quot;מחשוב&quot; ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כרטיסיית &quot;כוונת&quot;. הפעל מהירות מנוע ל1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס xScisor להרכבת ראש. הרכבה נמוכה ראש למצב מוכן Z-ציר על ידי לחיצה על כפתור &quot;Z-ציר&quot;. הערה: מכלול הראש הוא המבנה הגדול בחלק העליון של המכשיר לנתיחה. XScisor יהיה מכונה קצת טחנה מתכלה לשארית של מאמר זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;נתיחה לעסוק&quot; כפתור בג&#39;ויסטיק. הערה: לחצן זה ממוקם בחלק העליון של הג&#39;ויסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מרכז הסיבוב מבחינה ויזואלית. כדי לעשות זאת, להעביר את מרכז הכוונת על מרכז הסיבוב באמצעות מגדירפרמטר ד בשלב 1 של תכנית. השתמש בחצים מעלה ומטה ב&quot; x &quot;וברים&quot; ציר y &quot;כדי להתאים את הפיקסלים כדי ליישר כוונת. לחץ על הכרטיסייה &quot;נעשתה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על סמל &quot;בית&quot;. הערה: זה מיוצג על ידי תמונת בית ממוקמת בפינה הימנית העליונה. </li></ol> 2. יצירת תמונת סימוכין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות H &amp; E על במה. הנח כיסוי אטום על גבי שקופיות. כונן את המכשיר על ידי הזזת הג&#39;ויסטיק לאזור הרצוי של שקופית H &amp; E. שמור את התמונה שנוצרה. הערה: או כרטיסיית &quot;ללכוד התייחסות&quot; או הכרטיסייה &quot;לנתח&quot; יכולה לשמש כדי להשלים שלב זה. </li></ol> 3. יישר רקמות לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על האפשרות &quot;לנתח רקמות&quot; במסך הבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את &quot;המפעיל&quot;, &quot;מספר לנתיחה הצטרפות&quot;, &quot;מספר הצטרפות התייחסות&quot;, &quot;מספר ברקוד xScisor,&quot; &amp; #8220; מספר הרבה נוזל לנתיחה &quot;,&quot; גודל xScisor &quot;ו&quot; תיאור &quot;בכרטיסייה&quot; הגדרות &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלשונית &quot;מוצא רקמות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היבוא שנשמר בעבר תמונת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שקף FFPE בלא כתם של 5 עובי מיקרון על הבמה. הזז במה לאותו אזור כאחד מתואר בתמונה הייחוס. לחץ על כרטיסייה &quot;הכנס תמונה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כרטיסייה &quot;ליישר&quot;. השתמש בעכבר והחצים הקשורים כדי ליישר את תמונת התייחסות לתמונה ללא רבב. </li></ol> 4. סמן בשקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלשונית &quot;ביאורים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעכבר כדי לצייר עיגול מסביב לאזור הרצוי של השקופית שיהיה microdissected. </li></ol> 5. טען Bit מתכלים מיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא קצת טחנה מתכלה עם חיץ רצוי, כאן חיץ PKD, על ידי משיכת הבוכנה מעלה ומטה בתנועת נוזל מספר פעמים. הקפד להוציא אווירבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את ציר Z-על ידי לחיצה על &quot;כפתור Z-ציר&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען קצת טחנה מתכלה למכונה. עושה זאת על ידי הזזה קצת הטחנה מתכלה לתוך החלק העליון של המכונה, כך שהקו הלבן על קווי מכשיר עם הקו השחור על קצת הטחנה מתכלה. לחץ על לחצן &quot;איפוס שאיפה&quot; לאפשר לבוכנה שהורידה למיקום הנכון. הערה: זה צריך להיות קל להחליק קצת הטחנה מתכלה. אם זה לא, ודא שהחריצים מיושרים כהלכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Z-ציר נמוך יותר על ידי שוב לחיצה על כפתור &quot;ציר ה-Z&quot;. </li></ol> 6. לנתח רקמות (איור 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח כרטיסייה &quot;לנתח&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מהירויות מנוע ושאיפה ל1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן תיבה &quot;מעקב מופע&quot;. שים לב: זה מאפשר למשתמש לדמיין את האזור גזור בתהליך לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע מוכן לנתח, תמשיך להחזיק &quot;לעסוק&quot; כפתור, כמו גם &quot;לשאוב &amp; #8221; כפתור בעת הזזת הג&#39;ויסטיק בכיוון השעון כדי לנתח רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך לנתח בכיוון השעון עד לשאוב הוא כרטיסייה &quot;מלאה&quot; הופכת לאדומה. </li></ol> 7. ריק והסר Bit מתכלים מיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינור microfuge 0.5 μl תחת קצה קצת הטחנה מתכלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוט שליטה &quot;שאיפה&quot; הקש במהירות כדי להוציא דגימה לתוך צינור microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ עם כוח מוגבר כדי להוציא קצת טחנה מתכלה משומשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף בר רקמה על ידי משיכת בוכנה בחזרה. לדחוף את הבוכנה קדימה להביע את המדגם שנותר לקצת טחנה מתכלה. שבר הרקמה עכשיו יהיה כלול בתוך צינור microfuge. </li></ol> 8. דוגמא Lyse עם proteinase K עיכול ואחרי טיפול בחום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 70 pH TE μl 8.5 המכיל 5 מיקרוגרם של proteinase K להתאושש דגימת רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מדגם לתוך תנור-ייקר לתכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול מלא באמצעות מחמם שייקר לתכנות בהגדרה הבאה: 60 ˚ C למשך 30 דקות ב 1,500 סל&quot;ד; 82 ˚ C ל15 דקות ב 1,500 סל&quot;ד; ו25 ˚ C 1 דקות ב450 סל&quot;ד. המדגם הוא מוכן ליישומים במורד הזרם עכשיו. </li></ol>

<ol>
	<li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+pathology.">Laser capture microdissection in pathology.</a> J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).</li><li>Esposito, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques:+laser+capture+microdissection--increasing+specificity+of+gene+expression+profiling+of+cancer+specimens.">Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens.</a> Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).</li><li>Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesodissection+of+Paraffin+Embedded+Slide+Mounted+Tissue+Sections.">Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).</li><li>Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Mycobacterium+tuberculosis+clinical+and+laboratory+strains.">Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains.</a> J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).</li><li>Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculosis:+what+we+don't+know+can,+and+does,+hurt+us.">Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us.</a> Science. 328 (5980), 852-856 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesodissection+of+fibrous+tissue.">Mesodissection of fibrous tissue.</a> AvanSciBio. , (2013).</li><li>Paige, C., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penitentiary+or+penthouse+condo:+the+tuberculous+granuloma+from+the+microbe's+point+of+view.">Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view.</a> Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).</li><li>Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granuloma+correlates+of+protection+against+tuberculosis+and+mechanisms+of+immune+modulation+by+Mycobacterium+tuberculosis.">Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis.</a> J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).</li><li>Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+immunopathology+and+mortality+despite+tissue+persistence+in+a+Mycobacterium+tuberculosis+mutant+lacking+alternative+sigma+factor,+SigH.">Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).</li><li>Mehra, S., Kaushal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+reveals+extended+roles+of+the+Mycobacterium+tuberculosis+stress+response+factor+sigmaH.">Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH.</a> J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).</li><li>Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+the+transcriptional+profiles+and+the+physiological+states+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+an+extended+intracellular+infection.">Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection.</a> PLoS Pathog. 8 (6), (2012).</li><li>Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mycobacterium+tuberculosis+sigma+factor+sigmaB+is+required+for+full+response+to+cell+envelope+stress+and+hypoxia+in+vitro,+but+it+is+dispensable+for+in+vivo+growth.">The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth.</a> J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).</li><li>Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enduring+hypoxic+response+of+Mycobacterium+tuberculosis.">The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li></ol>

המחברים לחשוף שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Mesodissection היא טכניקה שניתן ליישם למיצוי RNA משקופיות נגע פתולוגיים נגרמות על ידי מגוון רחב של פתוגנים. זה הוא הכרח שהמשתמש עוקב אחר הדמות ומיישר את התמונה בצורה נכונה. כדי להשיג זאת, המכשיר חייב להיות מכויל בהתאם לכיווני תוכנת ההדמיה. כאשר לנתח, אם השקופית ואת תחומי עניי?...

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>.

Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

דגימות באופן מסורתי microdissected ידני משתי רקמות או שקופיות באמצעות מחט ואזמל כולה. הדבר מחייב הפרדה ברורה בין קטע הרקמה של עניין וחתכים רקמות הסובבים 2. עם ההתקדמות הנוכחית בטכנולוגיית אפיון מולקולרית, יש כבר צורך הולך וגובר להערכת רקמות ברמה התאית. בשל המגבלות של microdissection הידני, טכניקות כולל LCM הוקמו כדי לאפשר דיוק בידוד גדול יותר. טכניקה זו מאפשרת לחוקר לבודד אוכלוסיות תאים ספציפיות מסוגי תאים שונים ושקופיות, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו למבחנים במורד כגון פרופיל ביטוי גנים. למרות שמאוד יעיל למבחנים במורד הזרם, LCM אינו נטול מגבלות. ראשית, LCM הוא תהליך יקר וזמן רב. בנוסף, בשל האופי בלתי יציב של רנ&quot;א, שהוא לעתים קרובות מאתגר להשיג RNA איכות גבוהה מדגימות LCM 2. בשל disadvantages של LCM, התפתחויות חדשות בתחום טכנולוגית microdissection עדיין דרושים כדי להפוך אותו לנגיש יותר למספר גדול יותר של חוקרים באופן רגיש במחיר סביר ובזמן. כגון קידום אחד בטכנולוגית microdissection זמינה כעת הוא טכניקה המכונה mesodissection. בטכניקה זו מכונה משמשת לטחנת קטע הרקמה המבואר של העניין וaspirates אותו לקצת טחנה מתכלה 3. בשלב בא, מדגם זה יכול להישאף לתוך צינור איסוף ומשמש ליישומים במורד הזרם. יתרונותיה של מערכת זו הם שזה הרבה פחות יקר והזמן רגיש. מניסיוננו, המערכת מאפשרת לנתיחה של קטע רקמת גרנולומה ריאות בעשר דקות. מצד השני, LCM המסורתי עשוי לדרוש שעות כדי להשלים את התהליך. המערכת מאפשרת למפעיל כדי לטעון שקופיות התייחסות לשימוש כהשוואה, כמו גם כלי לביאור. בנוסף דו&quot;ח מופק ה מתווהשטח E של השקופית שהיה גזור. ישנם שני חסרונות עיקריים לmesodissection. למרות יעיל בחילוץ תאים מרובים, זה מאתגר לבודד את תא בודד. בנוסף, הדיוק של התמונה שנוצרה הוא לא ברור כמו אם באמצעות מיקרוסקופים הדמיה אחרים. שחפת (TB) היא רוצח גדול למחל זיהומיות של האנושות ברחבי העולם ותוצאות מזיהום עם MTB. ברוב של אנשים שנחשפו לאירוסולים של MTB, הזיהום מוגבל רדום. בלפחות 10 מיליון אנשים מדי שנה, התוצאה הוא מחלת שחפת פעילה 4. במהלך הזיהום לטנטי, MTB כלול בתוך נגעי ריאות פתולוגיים המכונים גרנולומות. מכאן זה כבר טען כי התוצאה של זיהום MTB יוחלט ברמה של גרנולומה 5. כאן אנו מדגימים כיצד mesodissection יכול לשמש כדי microdissect גרנולומות נגרמת על ידי MTB. השקופיות המשמשותהם מרקמת הריאה FFPE מקופי רזוס נגוע. לצורך הפגנה זו, אנו לנתח גרנולומות בשלמותם. אנחנו גם מדגימים כי RNA יכול להיות מופק מהרקמות התאוששו. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על דגימות רקמה מדגימות שונות אחרות ולאחר מכן משמשת למגוון רחב של מבחני במורד הזרם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">MeSectr</td>
			<td style="width:113px;">AvanSci Bio</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:195px;">Mesodissector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">400 nm xScisors</td>
			<td>AvanSci Bio</td>
			<td></td>
			<td>Other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">THOR</td>
			<td>AvanSci Bio</td>
			<td></td>
			<td>Programmable Heater-Shaker</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NanoDrop2000</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy FFPE extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:108px;">73504</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ovation RNA-Seq FFPE System&#160;</td>
			<td>Nugen</td>
			<td align="right">7150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:108px;">28104</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel microdissection approach to recovering mycobacterium tuberculosis specific transcripts from formalin fixed paraffin embedded lung granulomas

Microdissection כבר בשימוש לבדיקה של רקמות בDNA, RNA, ורמות חלבון במשך למעלה מעשור. לייזר מיקרוסקופית הלכידה (LCM) היא טכניקת microdissection הנפוצה ביותר בשימוש כיום. בטכניקה זו, לייזר משמש כדי להמס קרום תרמופלסטיים כי overlies קטע רקמה מיובש 1 focally. מרוכבים קטע רקמה אז הרים והפריד מן הקרום. למרות שטכניקה זו יכולה לשמש בהצלחה לבדיקת רקמות, זה זמן רב ויקר. יתר על כן, על סיומו המוצלח של נהלי שימוש בטכניקה זו דורש שימוש בליזר, ובכך להגביל את השימוש בו. גישת microdissection חדשה יותר זולה ומעשית הנקראת mesodissection היא פתרון אפשרי לחסרונות של LCM. טכניקה זו מעסיקה את מערכת MESO-1/MeSectr לטחנת הרקמה הרצויה מדגימת רקמת שקופיות רכובים בזמן במקביל מחלק וaspirating נוזל לשחזר את דגימת הרקמה הרצויה לתוךקצת טחנה מתכלה. לפני תהליך הנתיחה מתחיל, המשתמש מיישר פרפין הקבוע פורמלין המוטבע (FFPE) להחליק עם hematoxylin ו eosin מוכתם שקופיות התייחסות (H &amp; E). לאחר מכן, מפעיל הוספת הערות לאזור הנתיחה הרצויה וממשיך לנתח את הקטע המתאים. התכנית יוצרת תמונת ארכיון של הנתיחה. היתרון העיקרי של mesodissection הוא משך הזמן הקצר הנדרש כדי לנתח שקופיות, לוקח ממוצע של עשר דקות מלהגדיר לדגום דור בניסוי זה. בנוסף, המערכת היא באופן משמעותי יותר חסכונית וידידותי למשתמש. חסרון קל הוא שזה לא מדויק כמו לייזר מיקרוסקופית הלכידה. במאמר זה אנו מדגימים כיצד mesodissection יכול לשמש כדי לחלץ RNA משקופיות מגרנולומות FFPE הנגרמת על ידי שחפת Mycobacterium (MTB).

הפרוטוקול הנ&quot;ל מראה כיצד להשתמש בטכניקת mesodissection חדשה כדי לחלץ RNA משקופיות רקמת FFPE. היעילות של פרוטוקול זה מוצגת באמצעות שקופיות FFPE של גרנולומות ריאות מNHP נגועה בMTB בשלבי התולעת שונים. איורים 1-3 הם תמונות של מכשיר. איור 4 מתאר כיצד תהליך הנתיחה ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas at JoVE.c

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection כבר מועסק באופן נרחב לבדיקה של DNA, RNA וחלבונים בתוך רקמה. לייזר מיקרוסקופית הלכידה (LCM) הוא השיטה הנפוצה ביותר, אך טכניקה חדשה כרסום, mesodissection, זמינה לאחרונה. אנו מדגימים מיצוי RNA מפרפין פורמלין mesodissected הקבוע שקופיות רקמות גלומות של גרנולומות חפת Mycobacterium.

גישה החדשנית Microdissection לשחזור<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; תמלילים ספציפיים מפרפין קבוע פורמלין משובץ ריאות גרנולומות

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

a-novel-microdissection-approach-to-recovering-mycobacterium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

7.9K Views.  Tulane National Primate Research Center.  Microdissection כבר מועסק באופן נרחב לבדיקה של DNA, RNA וחלבונים בתוך רקמה. לייזר מיקרוסקופית הלכידה (LCM) הוא השיטה הנפוצה ביותר, אך טכניקה חדשה כרסום, mesodissection, זמינה לאחרונה. אנו מדגימים מיצוי RNA מפרפין פורמלין mesodissected הקבוע שקופיות רקמות גלומות של גרנ...

Video: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

לדוגמא הכנה של<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; תמציות ללימודי metabolomic תהודה מגנטיים גרעיניים

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

מודל ניסיוני לחקר המלריה שחפת-coinfection על הילוכים טבעיים של חפת Mycobacterium ו Berghei Plasmodium</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

באתרו איתור של חיידקים בתוך רקמות מוטבעות-פרפין באמצעות DNA בדיקה שכותרת Digoxin מיקוד 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

דגם רקמות 3D ריאות אדם ללימודים פונקציונליים ב<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; זיהום

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

ניתוח של 18FDG PET/CT הדמיה ככלי לימודי שחפת Mycobacterium זיהום וטיפול פרימטים לא אנושית

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...