この作品は、BMBF Forschungsinitiativeによってサポートされていました」BioEnergie 2021 - Forschung毛皮はNutzungフォンBiomasseダイ」と科学を推進するため、ドイツ連邦政府と州政府によってエクセレンス·イニシアチブを通じて資金を供給されている優秀「バイオマスからのオーダーメイド燃料」、のクラスターをとドイツの大学での研究。

野生型のN.タバコ植物の 1。成長<ol><li> Nを成長させるタバコ L. CV。土壌へのプチハバナSR1植物は、発芽のための通常のポッティング土壌を充填適切なポットにタバコ種子を置く。 2週間後、個々のポットに苗を移す。定数22℃（暗期）または25℃（明期）および70％の相対湿度で温室で植物を培養する。 8分の16時間明/暗サイクルで照明を提供（ 例えばフィリップスIP65 400Wのランプ、180マイクロモル·秒-1·メートル-2;λ= 400〜700 nm）で毎日水。 </li></ol> TrCel5AとTrCel5A-mCherryタンパク質の2。一過性発現<ol><li>無菌条件下で、pTRAkc-ER-TrCel5AまたはpTRAkc-ER-TrCel5A-mCherryのいずれかを含むAgarobacterium tumefaciensの単一のコロニー（GV3101 :: pMP90RK GMR、KMR、RifR）をピックアップし、10ミリリットルの酵母抽出物を含有する三角フラスコに移すブロス（YEB、製造業者の仕様書に従って調製）培地およびカナマイシン（50 mg / ml）を、リファンピシン（50 mg / ml）を、および選択のためのカルベニシリン（100 mg / mlで）。 26℃、180rpmで36〜40時間インキュベートする。注意：タンパク質発現のための適切な構築体のデザインは、本稿の範囲外ですが、指導のため、マクリーンら 13とマンローとPellham 14の方法には、構造物の設計のために続けることができます。 </li><li>上記の抗生物質濃度をYEBの20ミリリットルを接種し、前と同じ条件でインキュベートする各培養液200μlを取る。 </li><li> 36-40時間後、2μlのアセトシリンゴン（200μM最終濃度）、100μLの40％（w / v）のグルコース溶液と1 M MES緩衝液（pH5.6）を200μl。を添加することによって培養物をpreinduce一晩インキュベートする。 </li><li> 2×浸潤緩衝液（100 g / Lのスクロース、3.6グラム/ Lのグルコース、8.6グラム/ Lムラシゲ·スクーグ基本塩を100mlを調製、）、水酸化カリウムを使用して5.6にpHを調整する。 </li><li>それは、OD 5-6の600に到達するまで1時05希釈液との文化のOD 600を測定します。 OD 600で30ミリリットル浸潤培地に必要な培養液量を計算します。 2X浸潤バッファの15ミリリットルを追加し、30ミリリットルまでのバッファを作るために、脱イオンH 2 Oを加える。 </li><li>温室から植物を取り出し、浸透を容易にするために、上から5 番目の葉に、ニックに3 回目の背軸側をピペットチップを使用しています。 </li><li>侵入を容易にするために、ニックに葉の背軸側をピペットチップを使用してください。 </li><li>浸透培地で注射器を記入し、以前に作らニックの1に（針なしで）それを置く。向軸、葉側の指で注射器をサポートしています。 interveinal葉ゾーンの組織の中に慎重に培地を押してください。注意：浸透後、上記と同様の条件で、温室内の植物を栽培しています。また、untrの同じ割合を維持浸透させた植物と同じ条件下で、コントロールとしてeated、非一過性発現植物（NTEPs）。 </li></ol>植物の葉におけるTrCel5A-mCherry発現の3。評価<ol><li> 4-6日後、Aに浸透させた植物を取る温室からpTRAkc-ER-TrCel5A-mCherryを含有し、蛍光分析のために、暗い部屋の中に置いツメファシエンス 。 </li><li>赤色フィルター（620から750ナノメートル）と515 nmの緑色の光を発する携帯用光源を用いTrCel5A-mCherry、光の植物を表す葉の切片の蛍光を可視化した。注：深さは、植物の葉におけるタンパク質発現の特徴付けは、光及び蛍光顕微鏡下で検査し、ビブラトームで薄切片の葉によって達成することができる。このために、以下の手順に従います。 <ol><li>浸潤葉から約5×5mmの大きさの小さな部分をカットし、アガロース50 mMリン酸緩衝液（pH 5.7）に溶解し、4％に埋め込む。 </li><li>カットビブラトームを使用して埋め込まれた葉から、80〜90ミクロンの大きさの部分。バッファまたはカバースリップで覆い、上述と同じ波長フィルタを用いて、蛍光検出器を用いて10倍の倍率で顕微鏡を使用して調べ、顕微鏡スライド上に置きます。 </li></ol></li></ol>タバコ葉から4。TrCel5A抽出<ol><li> A.に感染した植物から1グラムのおおよそのウェイトにタバコの葉から作品をカット液体窒素で予冷し乳鉢でpTRAkc-ER-TrCel5Aと場所を含むツメファシエンス 。サンプルに液体窒素を適量入れる。グラインドは予備冷却乳棒を使用して粉末に残します。 </li><li>接地葉印刷物に1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）2 mlを加え、葉状物質の大部分が懸濁液中になるまで混合する。 4℃で20分間15,000 xgで遠心抽出物およびタンパク質を含む上清を取る。 </li><li>セントリフーガ4℃で20分間15,000×gでの抽出物とは、ペレットを破壊しないように注意しながら、タンパク質を含む上清を取る。ペレットを捨てます。 </li><li>部分的に10分間55℃でタンパク質含有上清をインキュベートすることによってTrCel5Aを精製する。 RTで10分間15,000 xgで遠心分離し、次いで、さらに10分間室温で休息できるようにする。対照サンプルを得るために、非浸潤植物のための部分的な精製プロセスを繰り返します。以下のすべての実験のために、これらのサンプルを使用してください。注：タンパク質溶液は、1週間まで、または最大3ヶ月間、-20℃で、4℃で保存することができる。 </li><li>対照サンプルを得るために、非浸潤植物のための部分的な精製プロセスを繰り返します。以下のすべての実験のために、これらのサンプルを使用してください。注：タンパク質溶液は、1週間まで、または最大3ヶ月間、-20℃で、4℃で保存することができる。 </li></ol> 5。、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、およびTrCel5A-mCherry &lt;アゾ-CMCザイモ/ pの&gt; <ol><li>購入または確立された方法15に従って（w / v）のSDS-PAGEゲル12％を準備。 </li><li> 1.5％（w / v）の溶液を得、水にCMCを溶解する。 CMC-SDS-PAGEゲルを作るために、0.1％（w / v）のCMC + 12％（重量/体積をもたらすを10mlのSDS-PAGEゲル混合液に1mlの水1.5％CMC 1mlの置き換え）SDS-PAGEゲルミックス。通常のゲルを注ぐ。注意：元の溶液中のCMCが完全に40℃（前ゲル溶液を調製する直接繰り返す）に攪拌および加熱の組み合わせにより溶解していることを確認してください。 </li><li>確立された方法12に従って、SDSの存在下で沸騰させることにより、サンプルを変性させる。陽性対照として、T.から市販のセルラーゼ混合物の1:500希釈を使用このようなTとしてデルマレー 、 デルマレー ATCC 26921。ネガティブコントロールとして非浸潤葉（NTEPs）から同様に調製したタンパク質溶液を使用しています。 </li><li>通常のプロトコル15に従って電気泳動を行って、例えば色素の先端がゲルの底に達すると停止し、電気泳動で〜50分間、200Vを使用しています。 </li><li> 0.1％を用いたものSDS-PAGEゲルを染色（w / v）のクーマシーブリリアントブルー、メタノール/氷酢酸混合物を用いて脱色。注：ラピッド染色及び脱色を穏やかな染色を加熱し、10分後、脱色液を変え、温め（ただし沸騰）第染色をした後、脱色溶液で15秒〜マイクロ波を用いて、すなわち溶液を脱色することにより行うことができるとき、または冷却し、新たな脱色液を繰り返します。 </li><li>確立されたプロトコル16,17を使用して1 SDS-PAGEゲルのウェスタンブロッティングを行う。 （二）アルカリホスファターゼに結合されたHisタグ（プライマリ）とポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体Fc領域に対するポリクローナルウサギ抗体：以下の抗体を使用してください。注：二次抗体は、ニトロブルーテトラゾールを用いて可視化を可能にするために選択されるべきであるイウムchloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39; - indolyphosphateのp-トルイジン塩（NBT / BCIP）、18に記載されているよう。 </li><li> 1.5％ゲルをインキュベートすることによって0.15％（w / v）のCMC SDS-PAGEゲル上でリフォールディングゲル内のタンパク質を用いて室温でβ-シクロデキストリン、20mMのリン酸 - クエン酸緩衝液、pH 6.5（w / v）の実行穏やかな15分19振とう。 </li><li> β-シクロデキストリンのソリューションを捨て、簡単に、H 2 Oでゲルを洗うさらに15分間50mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.8）中で、室温でインキュベートする。 50℃で20分間、30 mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.8の中でゲルをインキュベートすることによってリフォールディング0.15％CMC SDS-PAGEゲルを用いてCMCザイモグラフィーを行う</li><li> 50℃で20分間、30 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.8）中でゲルをインキュベートすることによってリフォールディングし、0.15％（w / v）のCMC SDS-PAGEゲルを用いてCMCザイモグラフィーを行う</li><li> 30分間、またはクリアバンドが1 MのNaを使用して観察されるまで、0.1％w / vコンゴーレッド溶液及び脱染を用いて10分間ゲルを染色CL。明確に画像化のための0.3％（v / v）の酢酸でゲルを洗浄する。 </li></ol> TrCel5Aの6。4-MUC活性アッセイ<ol><li> 50％（v / v）メタノール中の10mM 4-MUCのストック溶液を調製し、RTで暗所に保管して</li><li>アッセイの直前に、1 mMの4-MUCさ60mm酢酸ナトリウム、pH 4.8で構成される4-MUC 2X作業溶液を、準備します。 </li><li> （誘導的に発現の有無TrCel5Aなし）葉タンパク質100μlを、Tから100μlの市販のセルラーゼ混合物を含む試料に、このテストを実行するレセイ 1:1,000、および純粋なH 2 Oであった。三重に各サンプルを実行します。 </li><li>ピペット96ウェルプレートの各ウェルに4-MUC作業溶液100μlを、各試料100μlを加える。 </li><li> 360nmの励起波長および465 nmの発光波長を用いて、蛍光分光法によって4-MU蛍光の0分の時点を決定します。 </li><li> 20プレートをインキュベート50℃分間、蒸発を防ぐために接着剤の蓋で覆った。凍結（またはμlの0.15 Mグリシン、pHは10.0と、別々のプレートの試料100μlを100とを組み合わせることにより）により反応を停止します。 </li><li> 360nmの励起波長および465 nmの発光波長を用いて、蛍光分光法によって4-MU蛍光のエンドポイントを決定します。蛍光値の変化を得るために、エンドポイント（20分）の時点から0分を差し引く。 </li></ol> TrCel5Aの7。アゾキシメチルセルロース活性アッセイ<ol><li> 0.5 M、RTで保存する1.5％のストック（w / v）のアゾ-CMC、および18mMの酢酸亜鉛を含有する沈殿溶液を調製酢酸ナトリウム、pH 5〜80％エタノール（v / v）で、室温で保存温度。 </li><li>アッセイの直前に、1％（H 2 O中）（w / v）のアゾ-CMCおよび60mMの酢酸ナトリウム、pH 4.8からなるアゾ-CMC倍ワーキング溶液を調製。 </li><li> 50μlのサンプルと仕事の50μLを組み合わせる1.5ミリリットルのチューブでソリューションをING。 </li><li> （一時的に発現したかTrCel5Aなし）葉タンパク質の50μLを含有する試験サンプル; T.から市販のセルラーゼ混合物100μl デルマレーは 1:1,000に希釈した。そして、純粋なH 2 O三重でサンプルおよび標準を実行します。 </li><li> 50℃で20分間、サンプルをインキュベート沈殿溶液を250μlを添加して反応を停止させます。溶液が完全に混合したことを確認するために10秒間激しくボルテックス各サンプルを。 </li><li>室温で10分間サンプルをインキュベートし、再度ボルテックスする。 10分間1,000×gでの遠心分離のサンプル。ペレットを破壊しないように注意しながら、96ウェルプレートに各サンプルの上清を200μlを削除します。 </li><li> 590nmの波長で吸光度分光法を用いてアッセイ。 </li></ol> TrCel5Aの8。PAHBAHアッセイ<ol><li>ろ紙円（〜5.5ミリメートル径）をカットして穴パンチを使用してください。 100μlの60 mMののNaAc、pHは4.8、および1を追加サンプル（誘導的に発現の有無TrCel5Aなしで）の葉のタンパク質を含むいずれか、または商業Tの00μL リーゼイのセルラーゼ混合物は、1:1,000に希釈し、300rpmで振盪しながら50℃で20時間濾紙丸でインキュベートする。濾紙とインキュベートし、各試料について、個々のサンプルを対照として濾紙なし重複溶液をインキュベートする。 </li><li> RTで5 100mlの溶液を、合計濃HCl溶液、およびストアを添加してH 2 Oに溶解することによってPAHBAH 330 mMのパラヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（PAHBAH）溶液Aを調製。注：最良の結果は、H 2 Oで100mlとする量を加える前に、溶解を助けるために温度下で撹拌PAHBAHスラリー、 すなわち 30ミリリットル、より小さな体積にHClを添加することによって達成される</li><li> RTでの50 mMクエン酸ナトリウム、10mMの塩化カルシウム、および500mM NaOHおよびストアを含む、PAHBAH溶液Bを調製する。 </li><li> IMMEDiatelyアッセイの前に、使用するまで（4時間以内に使用する）氷上9ミリリットルの緩衝溶液、ストアに1ミリリットルのPAHBAH試薬の1.5倍の作業溶液を調製する。 </li><li>耐熱性0.2または0.5 mlチューブ内のサンプルを準備します。フィルターペーパー（ステップ8.1）、H 2 Oを45μLとPAHBAH作業溶液100μlとインキュベートし、各溶液5μlを兼ね備えています。サンプルコントロール（フィルターペーパーなしでインキュベートしたサンプル）は、同じ濃度（5μlのサンプル、45μlのH 2 O、100μlのPAHBAH使用液）の下で実行する必要があります。また、0〜0.2gのグルコース/ Lを含有する5規格（5μl）を、純H 2 Oをテストする三重でサンプルおよび標準を実行します。 </li><li>正確に10分間RTで冷却し、次いで、100℃で正確に10分間、サンプルをインキュベートする。波長410nmで96ウェルプレートおよびアッセイ分光ピペットソリューションを提供しています。最終的な取得するためのサンプルから（フィルターペーパーなしでインキュベート）個々のサンプル·コントロールを引く値。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

セルラーゼの組換え発現は、より効率的なバイオ燃料生産システム1のための欲求に、大きな関心の分野である。植物は、このような経済的な収穫技術や、大規模なバイオ燃料生産のための非常に望ましい特性であること自己加水分解法などの機能により、成功したセルラーゼの生産のための多くの可能性を提供します。また、タンパク質を産生するための別のローカリゼーションを?...

<html>リグノセルロース系バイオマスを液体燃料への変換の劣化が化石燃料への依存を低減する方法として想定されている。経済的に実現可能なバイオマス処理システムを確立する上での一つの重要なハードルは、セルロースとヘミセルロース1の酵素分解である。植物発現系は、工業的規模での酵素の産生のための大きな可能性を示している。彼らは何千年もの間あったように収穫植物経済的にもボリューム内の農業システムは、すでに確立されています。植物におけるセルラーゼの生産は、2自己加水分解の容易さ、および植物細胞壁1の消化率を増加させることによって、より低い酵素レベルの使用を最大にするための電位のような要因に望ましい。最後に、植物系は、植物細胞の特定の領域への組換えタンパク質の標的化を可能にし、翻訳後3を必要な酵素を変更することができる。 &quot;ve_content&gt; ニコチアナ·タバコ （タバコ）は非常に一般的に、その急速な成長とバイオマス蓄積機能4に、植物における異種タンパク質発現の研究のためのモデル生物として使用されます。組換えタンパク質の一過性発現が局在化および選択されたタンパク質の翻訳後修飾、したがって、 即ちセルラーゼのような柔軟性を維持しつつ、短時間5におけるタンパク質産生を可能にする技術である。また、植物における発現のさらなる戦略のための基礎を敷設しながら、基本的な分析のためのセルラーゼ（単数または複数）の産生を可能にする。このような一過性発現戦略を用いて、真菌宿主トリコデルマ·リーゼイ （ ハイポクレアジェコリーナ ）由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー5、CEL5A、6からエンドグルカナーゼ（以下TrCel5Aと呼ぶ）が生成される。 TrCel5Aはネイティブにグリコシル化されている42 kDaのタンパク質であり、HYDに高活性であるセルロース鎖7を roylzing。 ここで説明する一過性発現技術は、植物はアグロバクテリウムは 、適切な発現ベクターに目的の遺伝子を保有する葉浸潤、比較的一般的に使用されるシステムに基づいている。 インプランタ発現の成功の迅速な分析を可能にするために、TrCel5AもmCherry、本来ディスコソマ（Discosoma）種に由来する単量体の蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現させることができる。タンパク質DsRedは8、さらに6ヒスチジン残基（Hisタグ）は、に融合してC末端（TrCel5A-mCherry）。異種融合タンパク質、TrCel5A-mCherryの発現は、このようにmCherryの分散を調べるために緑色光を用いて成長した植物内で監視することができる。所望であれば、植物材料の薄い部分は、タンパク質の特異的な局在を確立するために顕微鏡的に緑色光下で検査することができる。この作品、信号TRANのため座るペプチドは、小胞体から9異種タンパク質輸送をローカライズするために、構築物に組み込まれた。 TrCel5Aを含む植物発現セルラーゼの活性を分析するために、セルラーゼ活性試験の数を実行することができる。全可溶性植物タンパク質を抽出した後、TrCel5Aは、部分的に熱インキュベーション法を用いて精製することができる。タンパク質サイズは、ウェスタンブロッティング、続いてSDS-PAGEを使用して確立される。溶解度10：ザイモグラフィーはカルボキシメチル化（CMCカルボキシメチルセルロースの製造）されたセルロース、例えば 、基質に対する活性を分析するために使用することができる。セルラーゼとグルコシダーゼ活性は、（4-MUC合わせた）β-D-セロビオシドに関連付けられたフルオロフォア4 - メチルウンベリフェリル（4-MU）を使用してモニターすることができる。エンドグルカナーゼ活性を評価するための別の方法は、アゾdで関連付けられているCMCの分析を含むあなたがた（RemazolbrilliantブルーR）11。また、エンドグルカナーゼ及びセルラーゼの範囲の両方のタンパク質の活性は、p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（PAHBAH）アッセイ12などの糖分析試験の使用によりモニターすることができる。これらの技術は、目的の発現セルラーゼの活性を解明し、定量することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:308px;">4-methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside</td>
			<td style="width:127px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:156px;">M6018</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringon (concentrated)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - kanamycin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - rifampicin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - carbenicillin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - rabbit anti His(6) pAb</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-401-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb</td>
			<td>DIANOVA</td>
			<td>111-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Azo-carboxymethyl cellulose</td>
			<td>MEGAZYME</td>
			<td>S-ACMC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C4805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carboxymethyl cellulose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3333.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C2730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Congo red</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>75768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coomasie brilliant blue G 250</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>9598.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D(+)-glucose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter paper - Rotilabo blotting paper</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>CL67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NBT/BCIP</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>72091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES buffer</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium citrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Soil, Einheitserde classic&#160;</td>
			<td>PATZER GMBH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrometer - Infinite M200</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S-5390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Hydroxy benzhydrazide&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV light source - BLAK RAY</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome - VT1000S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of recombinant cellulase cel5a from trichoderma reesei in tobacco plants

セルロース分解酵素、セルラーゼは、研究と産業の利益の両方の標的である。このような菌糸構築真菌および嫌気性細菌などの難培養する生物におけるこれらの酵素の優勢は、この分野における組換え技術の使用を早めました。植物発現法は、酵素および他の工業的に有用なタンパク質の大規模生産のための望ましいシステムである。ここで、 ニコチアナ·タバカムにおける真菌エンドグルカナーゼ、 トリコデルマ·CEL5Aの一過性発現のための方法は、実証される。成功したタンパク質発現はmCherry-酵素融合タンパク質を用いて蛍光によってモニターし、示されている。さらに、基本的な一連のテストは、一過性に発現T.の活性を調べるために使用されているSDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、ザイモだけでなく、蛍光染料ベースの基質分解アッセイを含むデルマレー CEL5A、。ここで説明するシステムは、アクティブセルを製造するために使用することができる短時間でulase、構成的または誘導性発現系を介して植物におけるさらなる生産の可能性を評価するようになっている。

TrCel5AとTrCel5A-mCherryを、一過性発現系（ 図1Aおよび1B）を用いてタバコ植物において首尾よく発現された。 TrCel5A-mCherry融合タンパク質の発現パターンの検査は、健康な葉の緑色光（ 図1D）の下で広範なタンパク質の発現を示した（ 図1C）を 、明らかにした。 総可溶性タンパク質の抽出を一過TrCel5Aタンパク質を発現させ?...

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Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

タバコ植物を、一過性発現系を介して、真菌セルラーゼ、TrCel5Aを作製した。発現は、蛍光融合タンパク質を用いてモニターすることができ、タンパク質活性を発現後に特徴付けた。

組換えセルラーゼCEL5Aの式から<em&gt;トリコデルマ·</em&gt;タバコ植物における

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

expression-recombinant-cellulase-cel5a-from-trichoderma-reesei

Research

JoVE Journal

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

12.7K ビュー.  RWTH Aachen University. タバコ植物を、一過性発現系を介して、真菌セルラーゼ、TrCel5Aを作製した。発現は、蛍光融合タンパク質を用いてモニターすることができ、タンパク質活性を発現後に特徴付けた。 

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

環境学

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

バイオベースの産業の原料としてたばこ木とポプラの評価のための転写産物および代謝物プロファイリング

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

放射性トレーサーで植物にミネラル栄養素や毒性物質のフラックスを測定する

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

植物の氷核と氷伝播の研究のための高解像度赤外線サーモグラフィ（HRIT）の使用

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That represents 100 million tons of food being destroyed or diverted to non-human consumption each year. Aflatoxins are powerful carcinogens normally accumulated by the fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus in cereals, nuts, root crops and other agricultural products. Silencing of five aflatoxin-synthesis genes by RNA interference (RNAi) in peanut plants was used to control aflatoxin accumulation following inoculation with A. flavus. Previously, no method existed to analyze the effectiveness of RNAi in individual peanut transgenic events, as these usually produce few seeds, and traditional methods of large field experiments under aflatoxin-conducive conditions were not an option. In the field, the probability of finding naturally contaminated seeds is often 1/100 to 1/1,000. In addition, aflatoxin contamination is not uniformly distributed. Our method uses few seeds per transgenic event, with small pieces processed for real-time PCR (RT-PCR) or small RNA sequencing, and for analysis of aflatoxin accumulation by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). RNAi-expressing peanut lines 288-72 and 288-74, showed up to 100% reduction (p&#8804;0.01) in aflatoxin B1 and B2 compared to the control that accumulated up to 14,000 ng.g-1 of aflatoxin B1 when inoculated with aflatoxigenic A. flavus. As reference, the maximum total of aflatoxins allowable for human consumption in the United States is 20 ng.g-1. This protocol describes the application of RNAi-mediated control of aflatoxins in transgenic peanut seeds and methods for its evaluation. We believe that its application in breeding of peanut and other crops will bring rapid advancement in this important area of science, medicine and human nutrition, and will significantly contribute to the international effort to control aflatoxins, and potentially other mycotoxins in major food crops.

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

We demonstrate a method for the analysis of aflatoxins and transgene expression in peanut seeds that contain RNA-interference signals for silencing aflatoxin-synthesis genes in the fungus Aspergillus flavus. RNAi-mediated control of mycotoxins in plants has not been reported previously.

ピーナッツにおけるアフラトキシンのRNAi仲介制御：メソッドは、ピーナッツにマイコトキシン生産と導入遺伝子発現を分析します/<em&gt;アスペルギルス</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Enhancement of the Initial Growth Rate of Agricultural Plants by Using Static Magnetic Fields

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing seeds of Garden Balsam (Impatiens balsamina), Mizuna (Brassica rapa var. japonica), Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis), and Mescluns (Lepidium sativum). We applied magnets under the culture dish. During the 4 days of application, we observed that the stem and root length increased. The group subjected to magnetic field treatment (n = 10) showed a 1.4 times faster rate of growth compared with the control group (n = 11) in a total of 8 days (p &#60;0.0005). This rate is 20% higher than that reported in previous studies. The tubulin complex lines did not have connecting points, but connecting points occur upon the application of magnets. This shows complete difference from the control, which means abnormal arrangements. However, the exact cause remains unclear. These results of growth enhancement of applying magnets suggest that it is possible to enhance the growth rate, increase productivity, or control the speed of germination of plants by applying static magnetic fields. Also, magnetic fields can cause physiological changes in plant cells and can induce growth. Therefore, stimulation with a magnetic field can have possible effects that are similar to those of chemical fertilizers, which means that the use of fertilizers can be avoided.

The goal of this protocol is to demonstrate the acceleration of the initial growth rate of plants by applying static magnetic fields with no external energy.

静磁場を利用した農業植物の初期の成長率の向上

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing ...

Assessment of Methane and Nitrous Oxide Fluxes from Paddy Field by Means of Static Closed Chambers Maintaining Plants Within Headspace

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based on the diffusion theory. A known volume of air overlaying a defined soil area is enclosed within a parallelepiped cover (named &#34;chamber&#34;), for a defined period of time. During this enclosure period, gases (methane (CH4) and nitrous oxide (N2O)) move from soil pore air near their microbial source (i.e., methanogens, nitrifiers, denitrifiers) to the chamber headspace, following a natural concentration gradient. Fluxes are then estimated from chamber headspace concentration variations sampled at regular intervals throughout the enclosure and then analyzed with gas chromatography. Among the techniques available for GHG measurement, the static closed chamber method is suitable for plot experiments, as it does not require large homogenously treated soil areas. Furthermore, it is manageable with limited resources and can identify relationships among ecosystem properties, processes, and fluxes, especially when combined with GHG driving force measurements. Nevertheless, with respect to the micrometeorological method, it causes a minimal but still unavoidable soil disturbance, and allows a minor temporal resolution. Several phases are key to the method implementation: i) chamber design and deployment, ii) sample handling and analyses, and iii) flux estimation. Technique implementation success in paddy fields demands adjustments for field flooding during much of the cropping cycle, and for rice plant maintenance within the chamber headspace during measurements. Therefore, the additional elements to be considered with respect to the usual application of non-flooded agricultural soils consist of devices for: i) avoiding any unintended water disturbance that could overestimate fluxes, and ii) including rice plants within the chamber headspace to fully consider gases emitted through aerenchyma transportation.

The overall goal of this protocol is to measure greenhouse gas emissions from paddy fields using the static closed chamber technique. The measurement system needs specific adjustments due to the presence of both a permanent water layer in the field and of the plants within the chamber headspace.

メタンおよび亜酸化窒素フラックス静電気による水田からの評価閉鎖チャンバー ヘッド スペース内の植物を維持します。

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based ...

Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast make 2-dimensions (2D) infrared images somewhat difficult to interpret. Viewing an IR image or the video of plants freezing in 3 dimensions (3D) would allow a more accurate identification of sites for ice nucleation as well as the progression of freezing. In this paper, we demonstrate a relatively simple means to produce a 3D infrared video of a strawberry plant freezing. Strawberry is an economically important crop that is subjected to unexpected spring freeze events in many areas of the world. An accurate understanding of the freezing in strawberry will provide both breeders and growers with more economical ways to prevent any damage to plants during freezing conditions.
The technique involves a positioning of two IR cameras at slightly different angles to film the strawberry freezing. The two video streams will be precisely synchronized using a screen capture software that records both cameras simultaneously. The recordings will then be imported into the imaging software and processed using an anaglyph technique. Using red-blue glasses, the 3D video will make it easier to determine the precise site of ice nucleation on leaf surfaces.

Here, we present a protocol to image a strawberry plant freezing in 3 dimensions. Two infrared cameras positioned at slightly different angles are used to produce a red-blue anaglyph video to observe the freezing of the plant in 3 dimensions.

植物の凍結の三次元赤外線ビデオを制作するためのプロトコル

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

タバココナジラミの迅速同定のループ介在増幅法 (LAMP) アッセイ

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

噛む昆虫マンドゥカセクスタによる侵入時のジャガイモの遺伝子発現研究を簡素化する剥離葉アッセイ

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...