著者は、 ベンサミアナタバコ苗の寛大な寄付のためにマサチューセッツ総合病院のジェンシーンに感謝したいと思います。ジェン·ブッシュは、植物の成長、成長チャンバ領域を設定する際の助言が大きく私たちを助けた。ウィス大学のトム·フェランテは、共焦点顕微鏡で重要なヘルプを提供した。著者は、特に遺伝子銃および関連物資の寛大な寄付のためにボストン小児病院とWyssさん研究所のドンIngberに感謝したいと思います。このプロジェクトの資金は、MJVため、PAS、JCW、およびMDM、およびChimerionバイオテクノロジーによって、株式会社のためのエネルギー省高等研究計画局（ARPA-E賞＃DE-000079）との協力協定を通じて提供されていました。

ターゲットと複数のオルガネラのための選択的にスプライス配列の1。デザイン<ol><li>最終的なタンパク質発現のための部位を決定。この作業のために、関心は葉緑体、ペルオキシソーム、および細胞質ゾルをターゲットにしている。 </li><li>関心対象の細胞小器官へのタンパク質を標的化することが知られているタンパク質およびDNA配列を同定するために文献を使用する。この場合、葉緑体は、 シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、L-アスパラギン酸メチル6,15から配列を標的とシロイヌナズナのトランスサイレチンのようなS-アラントイン合成酵素16,17から配列を標的ペルオキシソームを決定した。 </li><li>正しい細胞小器官への関心のタンパク質をターゲットとすべき代替スプライシング体制を特定します。この作業のため、自然のシロイヌナズナシステム 6で観察されるようなスプライス部位。 mRNA配列は、天然のスプライス部位を残して再設計されましたが、シーケンスは、符号化葉緑体やperoxisを置いた選択的にスプライスイントロン（ 図1）内のタグをOMEターゲティング。 </li></ol> DNAのパーツの2。ギブソン総会 図2も参照してください。 ギブソンの組立方法は、部分的に隣接するDNA部分の一本鎖および2）アニール相補塩基対を作るために二本鎖DNAの末端のダイジェスト）を1に予め作られた混合物中のいくつかの酵素の作用に依存する。これは、制限部位の制限なしにDNA断片のクローニングを可能にする。 <ol><li> DNAプラスミド構築物における要素の順序を選択します。 a）は、プラスミド、植物、カナマイシン耐性マーカーで作業することが知られているGFP構築物を含むベクター（孔、および大腸菌およびアグロバクテリウム·ホスト·ツメファシエンス ）、b）工程aのための複製起点：一例としてTriTag-1の要素を有しているプロモーター配列、（P ENTCUP2、植物において構成的であることが示されている）、c）の葉緑体配列（CTS）と、c）ペルオキシソーム標的化配列（PTS）を標的、およびd）スプライス部位の一連の6先に説明したように。 </li><li> インシリコデザイン· ソフトウェアで構築ベース用ベースを設計します。 APEはこの仕事に便利なオープンソースのフリーウェアパッケージです。 プラスミドベクターに含まれるプラスミドベクター、プロモーター、ATG、スプライスドナー部位、葉緑体標的配列、スプライスドナー部位、中性部位、スプライスアクセプター部位、ペルオキシソーム標的配列、スプライスアクセプター部位、GFP：注：TriTag-1は、順序を有する。 <ol><li> PCR用のプライマーをご注文の際に各ピース間50bpの重複が存在するようなインシリコ DNA構築物を設計します。 25bpの各方向：これは、プライマーとして50 bpのオーバーラップを使用することが可能である。 <ol><li>シーケンス片の起源を追跡するようにしてください。それはのようになります。成長させ、ミニプレップするプラスミド; PCRの鋳型として用いることができる直鎖状配列;である必要があるか、シーケンス商業的に合成された？いくつかの企業が断片&lt;500bpのための低コストのDNA合成サービスを提供しています。それは商業的にご注文することが有利だったので、この場合は、TriTag自体は437 bpである。 </li><li>すべてのフラグメントをPCRで増幅し、その鋳型DNAから精製された場合、最良の結果が来る。耐性マーカーをより容易にPCRで増幅された二つの小さなテンプレートに、この大きなDNAを分割するには良い場所です。 </li><li>制限制限酵素DpnIを、メチル化DNAを切断する。 PCRの鋳型は、 大腸菌からのミニプレップした場合大腸菌、DpnIを処理は、混入のテンプレートDNAを除去します。 </li></ol></li></ol></li><li>別途、すべてのDNA配列を浄化した水、TEまたは緩衝液EBで溶出する。 <ol><li>気孔ベクター部分1、〜3,000 BP（緑の矢印）。 PCRは増幅され、治療をDpnI。 </li><li>気孔ベクター部分2、〜3,000 BP（黒矢印）。 PCRは増幅され、治療をDpnI。 </li><li> TriTag INSERT、437 BP（青の矢印）。商業的になっております。 RのddH 2 Oにesuspend </li><li> P ENTCUPプロモーター 、〜750塩基対（オレンジの矢印）。 PCRで増幅し、DpnIを処理された。 </li></ol></li><li> DNA断片のそれぞれの濃度を測定する。ベクトル片の150 ngの/μLを目指す。 </li><li>冷凍庫からギブソンアセンブリミックスの分量を取り、氷上で解凍する。これは、ラボ12月14日に行うことが商業的に入手可能なだけでなく、簡単です。 <ol><li>粘性5Xマスターミックスと15μlの反応サイズの1.33倍の分量：このレシピへの2つのステップがあります。 5Xマスターミックスには含まれています。3ミリリットルの1Mトリス-HCl、pH7.5、300μlの1 M MgCl 2を 、各dNTP、300μlの1 M DTT、1.5グラムのPEG-8000、20 mgのNAD、および蒸留H 2の600μlの10 mMの6ミリリットルのO。 320μlの一部（18）を調製し、-20℃で1が、すべてを凍結する解決策は非常に粘性になります。これらの「5X等温線バッファを &quot;ラベル</li><li> （320μl）を、残りの1に、1.2μLT5エキソヌクレアーゼ、20μLのPhusionハイ-FIDを追加elity DNAポリメラーゼ、160μLのTaq DNAリガーゼと700μlの蒸留H 2 O -20℃でPCR管中の氷とストアに15μLずつ（〜80）を準備</li></ol></li><li>各フラグメントの等モル量のボリュームを決定します。 Gibthon.orgを含むいくつかのオンライン計算機があります。すべてのDNA断片5μlの合計があるはずです。ギブソンは分量を混ぜて15μLに追加します。これは、ピペットに小さすぎるボリュームを必要とする場合、DNA断片を希釈および/または複数のアリコートを使用する。 <ol><li>単独のベクターDNA（抗生物質耐性マーカーを含む例えば DNA部分）の制御を準備し、水でボリュームを構成することを忘れないでください。 </li></ol></li><li> 30〜60分間50〜55℃でサーマルサイクラーにチューブをインキュベートする。氷の上で交換して、Eに変換する熱ショック、化学的にコンピテントセルを経由して大腸菌 。エレクトロコンピテント細胞を使用しないでください。高塩濃度および比較的低いDNA濃度細胞はアークが発生することがあります。 <ol><li> 200μlの塩化カルシウムコンピテントの市販製剤に全20μLを適用大腸菌 。 42℃で氷30分および熱ショック60秒でインキュベート</li><li>氷2分に戻り、750μlのSOCまたはLB培地を適用し、37℃でマイクロ遠心チューブに30分を振っ回復LB +菅（またはその他の適切な抗生物質）に混合し、適切な希釈液をプレート。これは、従来のライゲーションに基づくクローニングよりも高いバックグラウンド（および非標的組換え事象の数が多い）になることがありますが、約10個のコロニーをスクリーニングすることは価値がある。 </li></ol></li><li>配列を介してクローンを確認し、-80℃で一定分量を保存する</li></ol>遺伝子銃とタバコの3。微粒子銃トランスフェクションこれはJoveの18,19年に設立された技術である。重要なステップとの相違点を以下に説明する。 <ol><li> 50〜100を成長ミリリットルE. COLiや200ミリリットルアグロバクテ 。文化をマキシプレップ。約1,500 NG /μLの濃度は、継続するために必要とされている。 </li><li>前述したように、遺伝子銃の弾丸を準備します。遺伝子銃にロードします。 </li><li> ベンサミアナタバコタバコの葉の表皮組織のトランスフェクションのために、3ヶ月の植物の根元に近い大葉を選択します。丁寧にカットさ15cmシャーレに湿ったペーパータオルの上にボトム側を上に配置します。 </li><li> 200〜250 PSIへの遺伝子銃He圧力を設定します。 </li><li>慎重に約3〜5センチメートルその上、葉の下側のリブの間の遺伝子銃を目指しています。安全性を解放し、リーフに粒子を送達。各弾丸は、葉上の同じ場所に二度使用されてもよい。葉が爆発した場合、新しい葉があるため、12 cmの葉のためのそのような年齢、水分などの成長条件への葉の靭性のある分散があるを破棄し、起動し、約6ショットに合うように期待しています。 </li><li>の上で覆われた葉を格納ベンチで暗い場所で2〜3日間、ペトリ皿。 </li><li> UV蛍光を装備した解剖顕微鏡で葉を調べ、GFPを発現する個々のセルを検索します。葉の5〜10ミリメートルのセクションを分析。 </li><li> 〜200μlの0.1％トリトンX-100の下にディープウェル顕微鏡スライドに葉を沈める。界面活性剤は、表面上に気泡を防ぐことができ、及びディープウェル顕微鏡スライドは、より大きな組織の撮像領域を可能にする。 </li></ol>トランスフェクションされた組織の4。共焦点顕微鏡これらの命令は、すべての楽器ごとに異なりますので、適切な訓練を受けた取得することが不可欠である。 <ol><li>蛍光検出実験のために、489 nmの励起レーザーを設定し、GFP蛍光とクロロフィルの自家蛍光のために630から700ナノメートルのための500から569 nmの光電子増倍管検出器を設定します。 40倍水浸対物レンズを用いて画像セル。 </li></ol>

<ol>
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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl/D-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis.">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li><li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. 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Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+Fluorescence+Complementation+(BiFC)+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene.">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

本研究では、単純な戦略は、植物内の複数の細胞区画に一つのトランスジェニックタンパク質をローカライズするために記載されている。目標は、 ベンサミアナタバコの複数の細胞小器官に単一の遺伝子を発現し構造物を設計することでした。戦略は合理的にGFPベースのDNA構築物の設計、ギブソンアセンブリ、遺伝子銃で葉細胞へのプラスミドの配信、および共焦点顕微鏡を用いた結...

この作品は、植物細胞が複数の細胞小器官ではなく、単一のDNA構築物でレポータータンパク質を発現するように遺伝子操作される代謝工学/合成生物学のプロジェクトです。 複数の場所へのタンパク質を標的化するための一つのアプローチは、複数の遺伝子のコピー、異なる局在化ペプチドを含むそれぞれクローニングすることを含む。各コピーは、単一のトランスフォームを1戻し交配によって、あるいは連続的な再変換によって導入するか、しなければならない。これは、追加のクローニングを必要とし、末端ごとに1つのローカライズタグによって制限されます。 複数の場所にタンパク質を局在化する別の方法は、選択的スプライシング2-5を介してである。 RNAは、単一の遺伝子から転写されるが、転写産物の異なるコピーは、セルごとに複数の方法で、多くの場合、異なる方法で処理されます。これは、単一の遺伝子から転写されたセル内の複数のメッセンジャーRNAをもたらすことができる。これらの異なるmessengeR RNAは、同じタンパク質、またはフレームシフトの場合は、全く別のタンパク質の異なるアイソフォームをコードすることができます。選択的スプライシングは、長年にわたって文献に記載されているが、作用及び保存された供与体および受容体スプライス部位のメカニズムは、より最近6解明されている。これらのサイトは、より良い説明されているように、彼らは、エンジニアリングのための機会を開く。 複数の細胞小器官にタンパク質を発現する際に植物代謝エンジニアが課題に直面しています。複数の細胞小器官に局在していることがあるタンパク質を、技術者は、対象とする細胞小器官にそれを指示する別々のシグナル配列と、同じ遺伝子のそれぞれを複数回複製しなければなりません。 3オルガネラにおける単一遺伝子の場合、これは単に三つの遺伝子である。しかし、6個の遺伝子の代謝経路のために、これは18の遺伝子、かなりのクローニングの努力に展開されます。シングル、選択的にスプライス遺伝子記号に複数の局在化配列を結合するificantlyこの努力が削減されます。例えば、リエンジニアリング光呼吸7,8およびイソプレノイド合成9,10は葉緑体およびペルオキシソームの両方を含む。天然のシロイヌナズナ系で観察されるように我々のケースでは、先に6に記載のスプライス部位を利用した。当社は、合理的にだけでは自然なスプライス部位を残してmRNA配列を再設計したが、選択的にスプライスイントロン（ 図1）内の葉緑体またはペルオキシソームターゲティングタグをコードするであろう配列が配置されます。発現されたタンパク質は、またはそれをエンコードされたmRNA前駆体はイントロン（ 図1Gおよび1H）として切り出したかどうかに応じて、タグを持っていない可能性があります。この作品で提示コンストラクトのデザインの詳細については、関連記事11を参照してください。 これはまだかなりのクローニングの努力、ギブソンアセンブリ、DNA構築物をクローニングするための新しい方法であるため、uは建設中のsed。ギブソン方法に関わらず、制限部位（ 図2）12〜14、任意の配列のために使用することができる。酵素の具体的なミックスは、ワンステップ、等温アセンブリを可能にします。この方法では、いくつかの二本鎖の線状DNA部分は、それらが約50塩基対の配列が重複しているように設計されている。ギブソン·アセンブリ酵素混合物は、部分的相同配列の一本鎖を露出させる、直鎖DNA部分を消化する。これらの部分的な一本鎖配列は、迅速なワンステップ、配列に依存し、ライゲーションフリーサブクローニング反応において得られた反応混合物に再アニールされる。 この作品は、ギブソンのアセンブリの新しいライゲーションのないメソッドを使用して、1）合理的な設計選択的スプライシングを受けた植物の葉緑体、ペルオキシソーム、およびサイトゾルでの発現のための構造、2）そのクローニング、遺伝子銃でタバコの葉の細胞への3）の配送を説明し、 GFPで観察されたように、オルガネラターゲティングを示す4）結果および共焦点顕微鏡。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligonucleotide primers</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td style="width:167px;">Design specifically for construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneBlocks</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td>500 bp oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApE software</td>
			<td style="width:191px;">U Utah</td>
			<td style="width:119px;">(download)</td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28004</td>
			<td>Used to purify PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td>Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Master Mix with GC Buffer</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0532S</td>
			<td>Used to PCR-amplify gene of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibson assembly reaction mix</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2611L</td>
			<td>Master mix of the following 9 ingredients</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M Tris-HCl pH7.5</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">T1075</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M MgCl2</td>
			<td style="width:191px;">G Biosiences</td>
			<td style="width:119px;">82023-086</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0192</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M DTT</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0861</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEG-8000</td>
			<td style="width:191px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">19966</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NAD</td>
			<td style="width:191px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1124,0005</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:191px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">T5E4111K</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">F530S</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0208L</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibthon.org</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Website to simplify calculations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid PLUS Maxi kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12963</td>
			<td>Used to prepare DNA for gene gun bullets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Gun system</td>
			<td style="width:191px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">165-2451</td>
			<td>Includes all parts necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nicotania benthamiana</td>
			<td style="width:191px;">(n/a)</td>
			<td style="width:119px;">(n/a)</td>
			<td>Gift of Jen Sheen, MGH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5 X MP</td>
			<td>Imaging of resultant cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deep well slides</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">71561-01</td>
			<td>Used for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A Plasmid Editor (ApE) </td>
			<td style="width:191px;">University of Utah </td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gibthon:Ligation calculator</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient gene expression in tobacco using gibson assembly and the gene gun

複数の細胞内小器官への単一のタンパク質を標的化するために、植物は典型的に関連性のある遺伝子を複製し、差動プロモーターおよび/またはシグナル配列を含む複雑な調節戦略を用いて別々に各遺伝子を発現する。メタボリックエンジニアや特定の細胞小器官に酵素を標的とすることに興味の合成生物学者は、チャレンジに直面している：複数の細胞小器官に局在していることがあるタンパク質のために、エンジニアは、同じ遺伝子を複数回複製しなければなりません。この作品は、この戦略に対する解決策を提示：mRNAの選択的スプライシングを利用する。この技術は確立された葉緑体およびペルオキシソーム標的化配列を利用して、選択的にスプライシングされた単一のmRNAにそれらを組み合わせたものです。いくつかのスプライスバリアントは、葉緑体、ペルオキシソームにいくつか、および細胞質ゾルへのいくつかに送信されます。ここで、システムは、複数のオルガネラが選択的スプライシングに標的化するために設計されている。本研究では、GFPは、exprがあると予想された合理的に設計された5 &#39;のmRNA一連のタグによって葉緑体、細胞質ゾルおよびペルオキシソームでessed。これらのタグは、異種遺伝子は、複数の細胞内小器官で発現されることが必要なときに必要なクローニングの量を減少させる可能性を有する。構築物は、以前の研究11で設計し、ギブソン·アセンブリ、制限酵素を必要とせず、ライゲーション非依存性クローニング法を用いてクローニングした。得られたプラスミドは、改変された遺伝子銃プロトコールでベンサミアナタバコ葉表皮細胞に導入した。最後に、形質転換された葉を共焦点顕微鏡で観察した。

設計作業は、重要な計画の結果であった。このプロジェクトへの新規で示差的に発現するタンパク質に翻訳されるmRNA前駆体を作成するための選択的スプライシングを使用することである。これらのタンパク質は、この場合には、異なる細胞小器官で発現される葉緑体、ペルオキシソームおよび/または細胞質ゾル。我々は、代わりに6を接合される天然のシロイヌナズナ遺伝子?...

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

この作品は、選択的にバイオラッド遺伝子銃を用いてアッセイ、植物では細胞内小器官を標的化するための新しい方法を説明します。

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

transient-gene-expression-tobacco-using-gibson-assembly-gene

Research

JoVE Journal

Environment

20.4K ビュー.  Harvard University. この作品は、選択的にバイオラッド遺伝子銃を用いてアッセイ、植物では細胞内小器官を標的化するための新しい方法を説明します。 

ビデオ: Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

ハイスループットマイクロプレートアッセイを用いてウォーターズ、土壌、および底質中の微生物細胞外酵素活性の測定

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

環境学

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

バイオベースの産業の原料としてたばこ木とポプラの評価のための転写産物および代謝物プロファイリング

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne illness. Ready-to-eat (RTE) processed foods such as deli meats, cheese, and in some cases fresh produce, have been involved in foodborne disease outbreaks due to contamination with pathogens such as Listeria monocytogenes. With respect to L. monocytogenes, deli slicers are often the main source of cross contamination. The goal of this study was to use a fluorescent compound to simulate bacterial contamination and track this contamination in a retail setting. A mock deli kitchen was designed to simulate the retail environment. Deli meat was inoculated with the fluorescent compound and volunteers were recruited to complete a set of tasks similar to those expected of a food retail employee. The volunteers were instructed to slice, package, and store the meat in a deli refrigerator. The potential cross contamination was tracked in the mock retail environment by swabbing specific areas and measuring the optical density of the swabbed area with a spectrophotometer. The results indicated that the refrigerator (i.e. deli case) grip and various areas on the slicer had the highest risk for cross contamination. The results of this study may be used to develop more focused training material for retail employees. In addition, similar methodologies could also be used to track microbial contamination in food production environments (e.g.&#160;small farms), hospitals, nursing homes, cruise ships, and hotels.

The overall goal of this study was to demonstrate the potential cross contamination mechanism of foodborne pathogen Listeria monocytogenes in a retail deli setting. This methodology may be applied to a variety of different environments to track pathogen contamination. &#160;

蛍光粉を使用した小売環境における微生物汚染を追跡する - 小売デリカ環境の例

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

組換えセルラーゼCEL5Aの式から<em&gt;トリコデルマ·</em&gt;タバコ植物における

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

クラス1インテグロンおよび遺伝子カセットのための食品のスクリーニング

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That represents 100 million tons of food being destroyed or diverted to non-human consumption each year. Aflatoxins are powerful carcinogens normally accumulated by the fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus in cereals, nuts, root crops and other agricultural products. Silencing of five aflatoxin-synthesis genes by RNA interference (RNAi) in peanut plants was used to control aflatoxin accumulation following inoculation with A. flavus. Previously, no method existed to analyze the effectiveness of RNAi in individual peanut transgenic events, as these usually produce few seeds, and traditional methods of large field experiments under aflatoxin-conducive conditions were not an option. In the field, the probability of finding naturally contaminated seeds is often 1/100 to 1/1,000. In addition, aflatoxin contamination is not uniformly distributed. Our method uses few seeds per transgenic event, with small pieces processed for real-time PCR (RT-PCR) or small RNA sequencing, and for analysis of aflatoxin accumulation by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). RNAi-expressing peanut lines 288-72 and 288-74, showed up to 100% reduction (p&#8804;0.01) in aflatoxin B1 and B2 compared to the control that accumulated up to 14,000 ng.g-1 of aflatoxin B1 when inoculated with aflatoxigenic A. flavus. As reference, the maximum total of aflatoxins allowable for human consumption in the United States is 20 ng.g-1. This protocol describes the application of RNAi-mediated control of aflatoxins in transgenic peanut seeds and methods for its evaluation. We believe that its application in breeding of peanut and other crops will bring rapid advancement in this important area of science, medicine and human nutrition, and will significantly contribute to the international effort to control aflatoxins, and potentially other mycotoxins in major food crops.

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

We demonstrate a method for the analysis of aflatoxins and transgene expression in peanut seeds that contain RNA-interference signals for silencing aflatoxin-synthesis genes in the fungus Aspergillus flavus. RNAi-mediated control of mycotoxins in plants has not been reported previously.

ピーナッツにおけるアフラトキシンのRNAi仲介制御：メソッドは、ピーナッツにマイコトキシン生産と導入遺伝子発現を分析します/<em&gt;アスペルギルス</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

海洋モデルとしてフジツボタテジマフジツボ improvisus培養と遺伝子発現

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

アグロバクテリウムとサツマイモネコブセンチュウ-ジャガイモの変換を介したと GUS 染色によってスベリン遺伝子のプロモーター活性

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

噛む昆虫マンドゥカセクスタによる侵入時のジャガイモの遺伝子発現研究を簡素化する剥離葉アッセイ

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

純粋な落葉スタンドにおける3つの異なる方法を用いてリーフエリア指数推定

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...