このプロトコルの全体的な目標は、私たちに、その中の様々な種類のxylem細胞の配水の電気顕微鏡分解能を提供することです。この方法は、水の分布と変化する水のレジーム、水の分布の季節変動、凍結/解凍サイクルの影響、湿木中の水の分布、および特定の生物的ストレスによって引き起こされるキャビテーションを明確にするために、xylemの水を観察するために使用されてきました。高い油圧張力の下で生きている幹の凍結固定は時々導管の管腔の破裂した氷の結晶としてcryo-SEMによって観察される人工キャビテーションを引き起こす。
この更新された手順は、サンプリング手順でアーティファクトを使用せずに、xylemの高品質のエアロトーム顕微鏡写真を取得することに焦点を当てています。簡単には説明できない重要な詳細が数多くあるため、実行可能なデモンストレーションは重要です。同時に、この方法を実践しているのは世界中の少数の研究所だけなので、訓練を受け取ることは容易ではありません。
この手順を開始するには、枝を囲み、黒いビニール袋でサンプリングするために葉を出して、xylemと葉の間の水位を平衡化してから、サンプリングの2時間以上前に残します。圧力チャンバを用いて、試料から少なくとも2枚の葉の水電位を決定する。水の電位が約マイナス0.5メガパスカルより高い場合、凍結後にサンプルを収穫することができます。
水の電位がマイナス0.5メガパスカルより低い場合は、緩和のための処理を進めます。水で満たされる茎の周りに水密な襟を、修正します。剪定せん断やのこぎりを使用して、水面下で茎を切断し、サンプルのカットエンドを水中に保ちます。
サンプルをできるだけ早く別の水の容器に移し、カットエンドを空気にさらすことを最小限に抑えます。広い離れた種の場合、クリソプラの中で張力誘発物を防ぐために、SEM用のクライオサンプルが採取された茎の切断端まで得られる場所からの長さが、サンプルの最大血管長よりも長いことを確認してください。次に、サンプルを黒いビニール袋で覆い、蒸散を減らします。
試料のカットエンドを水中に保管し、xylem張力を緩和するために約30分間この状態を維持します。この後、再度水電位を測定し、xylem張力の緩和を確認する。まず、はさみやユーティリティナイフを使用して、水密な襟の片側を切り開きます。
絞りを水平に保持したまま、粘着テープで茎の周りにしっかりと襟を取り付けます。絶縁手袋を着用し、液体窒素の容器を安全に保持します。液体窒素をいっぱいになるまで襟に入れ、徐々に液体窒素を加えてXylemの水を完全に凍結します。
十分な凍結時間を経過した後、液体窒素を除去するために、試料ステムの凍結部分から襟を外す。すぐにサンプルを収穫するために細かい手のこぎりを使用してください。その後、冷凍サンプルをアルミホイルで覆うか、サンプルチューブに戻します。
回収したサンプルを液体窒素で満たされた容器に素早く入れます。観察を行う準備ができるまで、サンプルをマイナス80°Cで保管してください。まず、クライオスタットの標本室の温度をマイナス30°Cに設定し、通常はほとんどの植物のxylem樹液を凍結状態に保つのに十分な寒さです。
鋭利なナイフまたは細かい歯の鋸を使用して、クライオSEMの標本ホルダーのために調整できる小片にサンプルをトリミングします。トリミングされた部分をチャック、クライオスタットのホルダーに取り付け、クライオ切断用の組織凍結埋め込み媒体を使用します。チャックをクライオスタットのミクロトームの標本ホルダーに取り付けます。
厚さ5~7マイクロメートルの断面を繰り返し削り取って表面を整えます。初期表面に全深度の1,000~2,000マイクロメートル以上を切り取ることは、予断によって生じるサンプルの損傷部分を発生させるのに役立ちます。サンプルの表面を大まかにトリミングした後、ミクロトームブレードの未使用部分を試料表面の上に調整します。
試料の表面とブレードの間の距離をわずかに広げます。そして、表面を1、2回だけ切ります。次に、ブレードを再度スライドさせて、未使用の部分を試料表面に配置します。
この切断処理を3~4回繰り返して、ナイフマークのない透明な表面を得る。最終カットの後、サンプルから遠く離れた位置にブレードを設定して、粉塵がサンプルに付着するのを防ぎます。そして、マイクロトームからチャックを取り外します。
次に、クライオスタットチャンバに組織凍結埋め込み培地を備えたクライオSEM標本ホルダーに標本を取り付けます。まず、装置のユーザーマニュアルに従って、クライオSEMの標本室のマイナス120°Cの下の温度を維持するために液体窒素を使用する。次に、調製した検体を用いて、液体窒素を充填した絶縁容器に、凍結スタットチャンバーに置きます。
試料交換ロッドを使用して、液体窒素の下に試料ホルダーを保持します。避難前室の避難を開始するとすぐに、検体ホルダーをクライオSEM検体室の避難前室に迅速に移す。まず、電動銃の加速電圧をオンにします。
次に、試料ステージの温度をマイナス100°Cに上げます。霜の塵が取り除かれるのを数分間待ち、xylem細胞の氷の表面レベルが細胞壁に比べてわずかに減少するまで待ちます。その後、スペウエンステージの温度をマイナス120°Cに下げます。
本研究では、細胞スケールでの配水を明確に可視化するために、クライオSEM観測法が用いられている。低倍率では、画像の黒い領域は水が完全にまたは部分的に消える空洞を示し、灰色の領域はxylem細胞壁、細胞質および水を示す。高倍率では、3気管のルミナから水が完全に失われないことを明らかになり、その時点でのキシレム樹液中のマクロ気泡の発生を示す。
広い離れ種に関しては、キャビテーションの発生は血管内で容易に検出され、水の存在は繊維内で区別するのが難しく、特に低倍率では区別できない。細胞質細胞とパレンチマ細胞は、気管内の水や、氷面テクスチャーを通した血管と区別することができる。凍結エッチングプロセスに対する温度の影響を分析すると、霜粉が徐々に昇華し、温度上昇に伴って昇華の進行を通じて内線皮ピット膜が明確化することが明らかになりました。
残存する大きな霜の塵粒子は、さらなる凍結エッチングによって除去することができる。しかし、Xylem導管の氷の表面レベルが不必要に低下するので、これは問題になる可能性があります。観察の質は正確な標本の準備によって大きく達成される。
ミクロトームの鋭い刃で表面の平滑化は特に重要である。使用済みのブレードによる不十分なスムージングは、ナイフマークに似た粗い表面を作成したり、切り傷から多数のほこりが発生する可能性があります。負の水柱圧力の緩和を伴わない試料凍結は、xylem導管におけるキャビテーションの実際の誘導を引き起こす。
クラスター化された氷の結晶は、試料が緩和されなかった標本の血管で観察される。対照的に、同様の水の可能性を有するリラックスしたサンプル標本では、クラスター化された氷の結晶は観察されない。干ばつに苦しんでいる生きている植物に凍結固定を適用すると、クラスター化された氷の結晶などの結果ベースのアーティファクトを誘発する可能性があります。
これらのアーティファクトは、xylem導管の水状態の誤解につながります。したがって、凍結固定の前にサンプルの水位を確認することが重要です。この手順は、xylem導管内の状態のイメージを提供しますが、観察のために生きている木を破壊する必要があります。
MRIやマイクロCTなどの他の非侵襲的な観察方法と、補助レベルの画像観察を組み合わせることで、水の輸送と使用の性質に関する理解を深めます。本論文で導入された水位の観察は、細胞内で混合される水の関係を解明する方法、および、生物的または生物的ストレスに対するその他の解剖学的反応を明確にする方法を提供する。エネルギー分散X線分光法またはトップシムを搭載したクライオ-SEMは、水を含む検体の表面上の元素分布を研究するために使用されてきた。
同じようなフレームで元素分析とこの手順を組み合わせることで、水の状態に関連するxylem細胞の挙動に関する深い知識を得ることができます。部屋のサンプルの凍結固定のために液体窒素を使用する場合は、酸素欠乏を避けるために部屋を換気することを忘れないでください。
