The experiments were supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada to CMSP. We thank Koppert Canada for their bumblebee colony donations. Portions of this manuscript, including some figures and tables have been published in Naturwissenschaften11, and reproduced here with permission from Springer.

オタワ大学の動物ケア委員会は、ミツバチでの作業者に対する安全手順の輪郭を描く私達の実験プロトコルを、承認した。 1.テスト環境の準備<ol><li> 2 MX 2 MX 2メートルの空きスペース（分離室、または金属スクリーンに覆わ飛行ケージ）を準備します。 注：お部屋は、試験空間として選択された場合、ミツバチが窓、ドアの下のスペース、および空気交換ダクトを通って逃げることができないことを確認してください。 </li><li>ミツバチが入り、障害物な ​​しでテスト·スペースを終了することができ、飛行ケージに小さなエントリポイント（ 例えば 、約2cmの直径の穴）を追加します。メンテナンスや機器構成のために予約期間中の試験空間からミツバチを維持するためにアクセスポイントを阻止するためのメカニズムを設計します。 注：我々は、 マルハナバチのインパチェンスクレソンの労働者を使用していました。 </li><li>コネクタを使用して、テスト·スペースに1つまたは2つのコロニーボックスを接続してください。死んだ蜂はBLOことができないことを確認してくださいコネクタをCK。 NOTE：ガラストップカバーを木製「ブリッジ」構造、及びワイヤーメッシュチューブ：ここで、接続構造の二種類を使用する。彼らは、きれいに簡単であり、彼らは蜂のためのトラクションを提供する。 </li><li>テスト-空間内に2つの人工の花のホルダーを置きます。 <ol><li>テスト空間の中心に花の保有者を置き、または壁に取り付けます。 </li><li>マスキングテープを使用した造花の円筒部の先頭に「2K6ヘッド」RFIDリーダを接続します（位置決めのための図1を参照）。造花を添付するためにどの1.2メートル背の高い木製のスタンドを使用してください。 注：スタンドの上部は​​造花が接続可能な取り付け機構を備えていなければならない。模式図については、図2を参照してください</li></ol></li><li>高周波（分。200 Hz）の追加蛍光灯器具を適切にテスト空間を点灯する。そのLIGを確保するために、高周波電子バラストを使用してくださいHTのちらつきはマルハナバチ」のビジュアルフリッカー値6を超えている。 注：ここでは、2×2×2メートルのスペースのために約1200ルクスの光強度を生成する12昼光色蛍光灯を使用しています。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig1highres.jpg" /> 図1. RFID人工フラワーデザイン。実験1のRFIDリーダで使用されるRFID対応造花の模式図は、花の中心を通って開いた円筒の上に休んだ。刺激パターンと位置：。末梢の同心、B。中央の同心、C。周辺ラジアルおよびd。中央ラジアル。この図は、ORBAN ら 11から変更されている。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig2highres.jpg" /> <sチョン&gt;図2.刺激ディスプレイスタンド。造花刺激スタンドの設計、および添付ファイルのクリップを示す模式図。アタッチメントクリップは造花に接着されており、迅速にかつ刺激スタンドから刺激を取り付け、取り外すために使用されます。この構成は、動きに敏感なビデオ実験に用いた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52033/52033fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 2.バンブルビーコロニー準備<ol><li>商業的に順序付けられたコロニーの到着すると、飛行ケージにコロニーボックスを接続してください。 </li><li>テストセッションの開始まで自由摂取 ：花粉（種々の植物からミツバチによって収集）と、砂糖水（体積比1：1）を提供する。 <ol><li> 1Lの水を沸騰させて、糖水溶液を作成するために、糖の同じ体積で混合する。 </li><li>養蜂家やCOMから花粉を購入マルハナバチコロニーの商業サプライヤー。乳鉢と乳棒を用いて花粉を挽くと、（必要に応じ）蜂蜜と水と混ぜてペースト状に湿ったそれを作るために。 </li></ol></li><li>実験が始まると、毎日の砂糖水15〜40ミリリットル（コロニーサイズに比例した量）を提供する。花粉を自由に提供し続ける。ハニーポット内のストレージレベルに応じて砂糖水の量を調整します。 注：低食品貯蔵レベルを保つには、労働者がより多くの食料を求めて巣を離れるためのインセンティブを提供しています。 </li><li>ステップ1.3で説明したようにミツバチは、コネクタ構造を経由してテスト環境を入力することができます。 注：ミツバチは巣や実験を通してテスト環境との間で自由に移動。 </li></ol>無線周波数識別による観察3.準備<ol><li>コロニーが到着するとすぐに労働者の胸部にRFIDタグを接着起動し、新しい作品として、実験を通して継続ERSが出現する。 </li><li>糊付けテクニック<ol><li>最初のタグ付けの際に個々の容器内のすべての労働者を配置します。冷蔵庫（約7℃）で約1時間のクールダウンの労働者はそれらを遅くする。 注：タグ付けの前に労働者を冷却するには、積極的なコロニーは、より管理しやすくするのに役立ちます。これは刺されの可能性を最小限に抑えることができます。 </li><li>タグ付け装置（タグ·プロバイダによって提供される）は、非毒性接着剤を使用して、作業者の胸部にRFIDタグを取り付ける。 （それらが飛行することができる前に）それらは未熟段階にある間に、労働者に糊RFIDタグは、それらが、出現する。 </li><li> RFIDタグは労働者では除去できないことを確認するために戻って、コロニー内のワーカーを配置する前に10分以上の間隔をあけてください。 </li></ol></li><li> （胸部上の糊残りやはげパッチで見られるように）、それらのRFIDタグを失った彼らのキャロウ段階でタグ付けされていなかった労働者、または労働者を処分する。 注：これらの蜂はoutsid経験を持っていたかもしれないコロニーをメール。 </li><li> RFID Readerソフトウェア<ol><li> RFIDリーダソフトウェアを構成するパーソナルコンピュータ（PC）を使用します。 YYYY-MM-DD HHへのオペレーティングシステムの日付書式を変更：MM：SSは、ダウンロードされたRFIDデータが正しくエンコードされるようにする。カンマ区切り値（CSV）などのRFIDリーダでデータをエクスポートできるように、C ++プログラミング言語を使用したRFIDリーダで供給されたプログラムを調整します。 </li><li> USBコネクタに、RS-232を使用してコンピュータにRFIDリーダを接続します。リーダは、記憶容量（最大32,000のレコード）に到達する前に、定期的にRFIDリーダにデータをダウンロードする。日付、時刻、および各タグに関連付けられた13文字のユニークな文字列を記録するためにRFIDリーダを使用してください。リレーショナルデータベース管理システム（RDBMS）にダウンロードしたCSVファイルをインポートします。 </li></ol></li></ol> RFIDリーダー4.造花の準備<ol><li>地元の工芸品店から青と黄色焼く粘土を購入。 </li><li> BLを作成UE直径1.5cmの円筒、および側の1.5センチメートル×3センチの穴をカット。 注：シリンダー側の穴は、RFIDリーダ用のレセプタクルとして機能します。 </li><li>一端は8 cmであり、もう一方の端に直径1.5cmの青色円錐を作成する。 </li><li>シリンダとコーンをマージします。 </li><li>黄色の粘土の長さ20cmおよび0.5センチ幅のストランドを作成します。 </li><li>サイズに黄色ストランドをカットし、青錐体とシリンダーに働く。 注：ラジアル形状は長さ5cmの直線を必要とするであろう、と同心の形状は4-8センチの円形のラインが必要になります。 </li><li>完全に硬化するまで、130°Fで粘土を焼く。 </li></ol>モーションセンシティブビデオ録画による観察5.準備<ol><li>とすぐにコロニーが到着するように働きバチの胸部に着色されたプラスチック製の番号タグを糊付け起動し、新しい労働者が出現するように、実験を通して継続。 </li><li>初期taggi中にすべての労働者を削除するすべての個人が番号タグを受け取ることを確実にするためにセッションをngの。バックコロニー内の場所の労働者、すぐタグ付けした後。 NOTE：RFIDタグとは異なり、多数のタグは削除する作業者にとってより困難である。 </li><li>新しい労働者が出現するように、彼らはまだ未熟であるが、それらをタグ付けする。周波数をタグ付けコロニーサイクルの状態により異なりますが、約7-10労働者に平均で2〜3日毎に。彼らはもはや花ナイーブでない可能性があるため、それらのキャロウ段階でタグ付けされていなかった労働者を処分する。 </li><li>利用可能なタグ番号よりもより多くの労働者をタグ付けするためのシステム 注：実験は数ヶ月の期間継続し、複数のコロニーが関与している場合、使用可能なタグ番号がなくなっていることを良いチャンスがある。 693同時にタグ付けされた労働者にまで許可する、それぞれが1から99までの番号約7識別可能なタグの色があります。 3-4コロニーを使用して3ヶ月間実行している実験は、合計で優に超える693の労働者を持っていますが、決して同時に生きています。 &lt;オール&gt; <li>特に以下の番号については、番号タグが体系的に配置されている（ 例えば 、タグ番号の上側が常に蜂の頭と整列される）ことを確認してください：6、9、66、69、99。 </li><li>死んだ労働者を外し、「解放」として、そのタグ番号を記録します。 「利用可能」であるタグの数や色のデータベースを維持するか、「使用中」のユニークなタグが同時に複数のハチで使用されていないことを保証する。 注：追加のタグの組み合わせは、既存の色に色を加えることによって製造することができる。たとえば、シャーピーペンで青タグに黄色の点を追加すると、新しい組み合わせを作成することができます。 </li></ol></li><li>ビデオデータ処理<ol><li>テスト環境の外に（ 図3参照）、各花のディスプレイの前に2つのインターネットプロトコル（IP）ビデオカメラ（最低1融点画像の解像度）を配置します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig3highres.jpg" /> <st栄&gt;図3.テスト環境。フォアグラウンドで2正面ビデオカメラを示すテスト環境の写真は、照明器具、及び刺激の間の天井ビデオカメラは、部屋の中央にあるサンプルの刺激で立っている。 注：IPビデオカメラや造花間のガラス分周器は、人工的な花がはっきりと見えるようになります。 IPビデオカメラは離れて刺激から5メートルまでであり得る。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52033/52033fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </li><li> 1.8ミリメートルバリフォーカルレンズ付き株式レンズを交換してください。これらのレンズは、十分なズームを可能にし、造花に焦点を当てる。 </li><li>造花の手前に1〜2メートルを中心に、直接造花の上に追加のIPビデオカメラを置きます。このビデオカメラはホバリングとantennation行動をキャプチャします。 </li><li> IPビデオカメラを接続します<html>セカンダリネットワークインタフェースコントローラ（NIC）、およびイーサネット·ハブを介して PCへ。 </li><li>動的IPビデオカメラにIPアドレスを配布するためにPCの動的ホスト構成プロトコル（DHCP）を構成する。 </li><li> PC上のファイル転送プロトコル（FTP）サーバを設定する。 </li><li>自動的にPC上でビデオクリップを堆積するためにFTPクライアント·プロセスを構成します。 </li><li> 10秒のビデオクリップの動きが検出されるたびに記録するIPカメラを設定する。 </li></ol></li><li>ビデオクリップの解析<ol><li>ビデオクリップを開き、コンテンツフレームごとの好みのビデオビューアを使用してを表示します。 </li><li>蜂のプラスチックタグ番号、スプレッドシートまたはRDBMSでの記録の日付と時刻を記録します。ここでは、造花と接触する蜂の足として上陸を定義します。 注：（別の蜂が刺激に存在する間着陸を）社会的に影響される選択肢を捨てる。 </li></ol></li></ol>ビデオ観察のE &quot;&gt; 6。造花の準備<ol><li>グラフィック編集ソフトウェアを使用して視覚特性を設計します。 注：印刷されたパターンを切り取り、コーンに折り畳むことができることを確認します。直径8cmコーン、その結果、切り欠き形状を生成するように幾何学的な計算を使用してください。 </li><li>印刷、カット、そしてコーンに視覚特性を折る。 </li><li>接着剤取付けクリップ（ 図2参照） を刺激する。 </li></ol> 7.統計分析<ol><li>いずれの実験においても、それぞれのハチのための選択の割合を計算する（ 例えば、特定のハチは、yの合計のうち1花のx選択をした）。 </li><li>フィットテスト7の複製された善とこれらの比率を分析します。 注：複製されたG-テストの全体的な重要性を示している複製物の変動性（すなわち、各ハチ）の量を示している異質値（G hの ）、およびプールされた値（G pを ）計算すべての選択肢割合。 Gの値は、有意性の試験で2つの値をχと比較される。 </li></ol> 8.刺激プレゼンテーションシーケンス<ol><li>検査空間内のフラワースタンドに造花を取り付けます。場所の影響を回避するために、一定の時間間隔（ 例えば、毎日）に表示される刺激の組み合わせと場所を変更します。 </li></ol> 9.試験終了<ol><li>ミツバチを殺すために3日間℃-10℃ディープフリーザーでコロニーを置きます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Plowright, C. M. S., Evans, S. A., Leung, J. C., Collin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preference+for+symmetry+in+flower-na&#239;ve+and+not-so-na&#239;ve+bumblebees.">The preference for symmetry in flower-na&#239;ve and not-so-na&#239;ve bumblebees.</a> Learn. Motiv. 42 (1), 76-83 (2011).</li><li>Streit, S., Bock, F., Pirk, C. W. W., Tautz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+life-long+monitoring+of+individual+insect+behaviour+now+possible.">Automatic life-long monitoring of individual insect behaviour now possible.</a> Zool. 106, 169-171 (2003).</li><li>Chittka, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+human+are+insects,+and+does+it+matter.">How human are insects, and does it matter.</a> Formosan Entomol. 31, 85-99 (2011).</li><li>Lihoreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radar+tracking+and+motion-sensitive+cameras+on+flowers+reveal+the+development+of+pollinator+multi-destination+routes+over+large+spatial+scales.">Radar tracking and motion-sensitive cameras on flowers reveal the development of pollinator multi-destination routes over large spatial scales.</a> PLoS Biol. 10 (9), e1001392 (2012).</li><li>Brodbeck, D. R., Shettleworth, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matching+location+and+color+of+a+compound+stimulus:+Comparison+of+a+food-storing+and+a+nonstoring+bird+species.">Matching location and color of a compound stimulus: Comparison of a food-storing and a nonstoring bird species.</a> J. Exp. Psychol. Anim. Behav. 21 (1), 64-77 (1995).</li><li>Srinivasan, M., Lehrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+resolution+of+colour+vision+in+the+honeybee.">Temporal resolution of colour vision in the honeybee.</a> J. Comp. Physiol. A. 157 (5), 579-586 (1985).</li><li>Sokal, R. R., Rohlf, F. J., Freeman, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2011).</li><li>Lunau, K., Fieselmann, G., Heuschen, B., van de Loo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+targeting+of+components+of+floral+colour+patterns+in+flower-na&#239;ve+bumblebees+(Bombus+terrestris;+Apidae).+.">Visual targeting of components of floral colour patterns in flower-na&#239;ve bumblebees (Bombus terrestris; Apidae). .</a> Naturwissenschaften. 93 (7), 325-328 (2006).</li><li>Lehrer, M., Horridge, G. A., Zhang, S. W., Gadagkar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+vision+in+bees:+Innate+preference+for+flower-like+patterns.">Shape vision in bees: Innate preference for flower-like patterns.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 347 (1320), 123-137 (1995).</li><li>Thompson, E. L., Plowright, C. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+images+may+or+may+not+represent+flowers:+picture-object+correspondence+in+bumblebees+(Bombus+impatiens).">How images may or may not represent flowers: picture-object correspondence in bumblebees (Bombus impatiens).</a> Anim. Cognit. , (2014).</li><li>Orb&#225;n, L. L., Plowright, C. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+flower-like+and+non-flower-like+visual+properties+on+choice+of+unrewarding+patterns+by+bumblebees.">The effect of flower-like and non-flower-like visual properties on choice of unrewarding patterns by bumblebees.</a> Naturwissenschaften. 100 (7), 621-631 (2013).</li><li>Leonard, A. S., Papaj, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X&#8221;+marks+the+spot:+The+possible+benefits+of+nectar+guides+to+bees+and+plants.">X&#8221; marks the spot: The possible benefits of nectar guides to bees and plants.</a> Funct. Ecol. 25 (6), 1293-1301 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

RFID技術は、容易かつ高精度に個々の労働者の数百を研究できますが、記録された行動の特徴は、ヒトおよびビデオ録画による観察とは異なる。 RFIDによって記録された選択行動は、花の探求として記述することができます。これは、このようなパターン11,12上のアプローチ8、迷路のアーム9,10への参入、触角の反応8、または着陸などの他の研究で用いられた基準と比較して、好みの非常に厳しい基準である。オーダー選択行動の定義の妥当性を比較するために、そして報わ行動のための新しいRFIDの方法を検証するために、着陸のビデオ録画が実験2で観察されたすべての選択肢措置が等しくない：RFID基準フローラルエントリによって測定されるように、ことが示されたビデオデータはパターン·タイプの視覚特性はハチの選択により重要であることを示しながら、パターンの位置の視覚的プロパティは、ハチの選択により重要である。未学習選択行動を研究する上での一般的な課題の一つは、それがどんな花粉や蜜を提供していない造花の花ナイーブ、訓練を受けていないミツバチを引き付けるために非常に困難なことである。実際、以前の実験の多くは、テスト刺激に選択行動とは無関係であると考えられる刺激にテスト環境でハチを訓練に頼っ。 RFIDモーションセンシティブビデオ録画、連続録画を可能にすることによって、この障害を克服する、24時間毎日、研究者の一定の監督なしに、数百蜂に15-20ミツバチからのサンプルサイズを大きくすることができる。訓練されていないミツバチによる報わ選択肢はまれな出来事ままで、これらの新しい実験的な設計パラメータは、観測を可能にする。 これら二つの技術によって提供されるその他の改良点は、個人差の試料バイアスの排除、外的妥当性の改善、および追跡が含まれる。 SAMPL唯一の植民地でダースかそこらのミツバチを研究したときに電子の偏りを導入してもよい。のみ労働者が所定の時間に研究者との「協力」が起こることが観察されているため、おそらく見逃されていても、同じコロニー内の個々の労働者全体の行動の特異性に大きな違いがあります。 300以上のミツバチのコロニーで15-20蜂を研究、ケース·サンプリング·バイアスは重要である可能性のある総コロニーのわずか5％を占める。タグ付けと、すべての労働者の挙動を観察することは完全にこの問題を排除します。同時刺激の選択肢の数も操作することができる。私たちは技術的な理由のために私たちの実験では、バイナリの選択肢を提供しますが、単一選択またはいくつかの選択肢の設計も可能である。 外的妥当性の面では、実験室環境でミツバチを研究することは、伝統的に、結果の一般化を妨げている、非常に人工的となっている。例えば、研究者はPRでなければなりませんでしたデータ収集のためのESENT、ミツバチは1つずつテスト環境1で採餌しなければならなかった、そしてテストは、小さな時間ウィンドウに限定されていた。このホワイトペーパーで説明されている新しい技術は観測が教師なしと無制限にすることによって、これらの人工的な制限を削除します。我々はこれらを単一の蜂によって、またはいくつかの蜂によって選択肢を繰り返したかどうかを確かめることができるので、最終的には、行動の個人差を文書化することができます。 運動に敏感な、高空間分解能のビデオカメラは、刺激の設計の柔軟性の観点から、RFID技術優位を持っている：視覚刺激の外観は、ほぼ任意の形状とすることや、被験者の識別は、少なくともで捕捉することができるものであれば形成することができる数フレーム。識別は、各ビデオクリップの手動検査を必要とする研究者によって読み取られる必要があるため、動画を処理してRFIDデータを処理するよりも時間がかかり、もう少しである。視覚刺激の設計は、Rの制約を満たすことができればFIDリーダー（ すなわち、蜂にRFIDタグがRFIDリーダのうちの少なくとも3〜4ミリメートルに来なければならない）場合、RFID技術は、自動化された大規模なデータ収集の上縁部を有する。定性調査は、おそらくビデオ分析によって愛用され続けるだろう。この実験で示されるように、RFIDリーダは手動のコーディングを必要としない、非常に大きなデータセットを蓄積することができる。それぞれの技術に関連したわずかに異なる利点は、将来的にそれらが相補的な方法で使用することができることを示唆している。 両方の技術の将来はめったに発生しない行動の正確な定量にあるのかもしれない。たとえば、将来のアプリケーションのための1つの異なる可能性は、温室および他のより自然な環境でこれらの技術を用いることである。自然主義と実験制御の組み合わせは、以前にお答えすることはできなかった質問に対処できるようになる。大まかに言えば、これらの技術は、厳格なAの行動を観察する二つの新しい方法を提供しますND効率的な方法。 RFIDとモーションセンシティブビデオがちょうど花粉媒介や昆虫を研究研究者のための大きな一歩ではありませんが、これらの技術はまた、他の行動科学者にアピールすることがあります。

マルハナバチやミツバチによって無学選択行動を研究する上で重要な問題は、花ナイーブ、訓練を受けていない労働者が容易に嗜好を測定することができるテストのスペースを入力しないということです。その結果、多くの研究者が理想的な技術よりも少ない頼る：プレトレーニング労働者、研究者は、実験の刺激とは異なるように考える表向きは中立刺激から検査空間内に供給する。しかし、最近の実験は、中性であると考えられていた刺激（テストセッションの後続の選択行動に影響を与えない、すなわち 、刺激）が予期1優先に影響を与えたことを示した。無線周波数識別（RFID）2、モーションセンシティブビデオ録画を含む自動システムは、この問題を解決する機会を提供することができる。研究の目的は二重であった：（1）主に、（2）二次的EVに、マルハナバチによって未学習花の嗜好に関する文献に貢献する二つの異なる自動記録装置によって記録されたように、2つの選択肢測定システムをaluate。 二つの自動化されたシステム3は、未学習選択行動を観察するために、本 ​​研究で実装されました：RFIDとモーションセンシティブビデオ録画。両方のシステムの2つの重要な要素は、選択肢が報われず、異なる視覚的な手掛かりの表示を操作できることである。 （1 MP解像度で記録する高精細、）モーションセンシティブビデオだけでなく、飛行室で自由に探索する労働者の継続的な観察 ​​を可能にするが、比較的稀な事象4の効率的な観測のために重要である。 実験1の研究の質問は一緒に表示されたときの特性がどのように相互作用するか異なる視覚的にも関する。本研究では、パターン·タイプに関連したパターンの位置の相対的な重要性を探求しようとするものである。 （ すなわち 、サンバースト）と同心円状、放射状に2×2のデザインを使用して（ すなわち 、雄牛の電子あなたがた）パターンタイプは造花（刺激の例については図1を参照）のいずれかに中央または末梢配置されます。 RFIDリーダーは、これらの特別に設計された人工的な花の刺激に組み込まれている、とマルハナバチは、私たちは造花刺激に入り、各タグ付けされた労働者を記録することができるように、RFIDタグが有効になってを受ける。 RFID観察はパッシブタグの存在によって変調された無線周波数の信号（この場合は13.56MHz）を送信する（造花に組み込まれた）リーダー機構により機能する。読者は、タグ固有の識別を可能にするタグまたがっ若干異なるこれらの信号変調を検出し、記録することができます。 実験2の質問が3つある。まず、ビデオ録画同等選択基準によって測定されるように、RFID、及び着陸によって測定されるように、花のエントリがありますか？選択は異なる措置につながる可能性の異なるポイント（ビデオのための着陸、およびRFID用フラワーエントリー）で測定されている好みの。第二に、末梢ポジショニング対中央の効果は何ですか？これは、異なる位置に2つの半径方向のパターンからなる組み合わせ（ 図4b参照） を提示した場合、労働者が中央のパターンを選択するかどうかは不明である。第三に、パターンタイプVSパターン位置の相対的な重要性は何ですか？言い換えれば、マルハナバチ、好ましいパターンタイプ、又は好ましいパターン位置のパターンに着陸するのだろうか？ミツバチは、周辺-同心円状に中央ラジアルを好むこともできますが、プリファレンスは、パターンの種類や、その中心位置が原因​​である可能性があります。この実験では、2つの変数が互いに5（ 図4cを参照し、d）と対戦した。 実験2では、私たちは、花のような刺激に対して動きに敏感なビデオ録画を使用していました。造花は飛行ケージの内側に入れ、運動に敏感な高精細ビデオカメラは、フロンからこれらの花で指摘されたtとトップ。検査領域における2つの刺激の各々の正面図を捕捉するように、より具体的には、2つのカメラを配置した。追加のビデオカメラは上から行動をホバリング記録する刺激との間に位置し、造花の両方からの挙動を撮影した。マルハナバチは、高精細ビデオクリップを読み取ることができる多数のタグを用いて同定した。ホバリング、antennation着陸行動が観察された。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="708">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:143px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:231px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Miniaturized mic3 tags</td>
			<td style="width:143px;">Microsensys</td>
			<td style="width:119px;">mic3 TAG 64 bit RO</td>
			<td>RFID tags to glue to bee</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFID reader 2k6 head</td>
			<td style="width:143px;">Microsensys</td>
			<td style="width:119px;">2k6</td>
			<td>RFID readers built into artificial flowers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IP camcorders</td>
			<td style="width:143px;">Vivotek</td>
			<td style="width:119px;">IP8161</td>
			<td>Motion-sensitive video recorders</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Opalith Plattchen number tags and non-toxic glue</td>
			<td style="width:143px;">Beeworks.com</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Number tags to glue to bees</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bumblebee Colony for Research</td>
			<td style="width:143px;">Koppert Canada</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Artificial flowers</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Developed by campus biology shop</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Artificial flower stand</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Developed by campus biology shop</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flight room</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Developed by campus biology shop</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laptop with Windows</td>
			<td style="width:143px;">Generic hardware / Microsoft software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to download RFID data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RS 232 to USB converter</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Connect RFID reader to computer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Desktop</td>
			<td style="width:143px;">IBM</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to transmit video data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Second NIC</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;">10/100M NIC PCI</td>
			<td>Used to transmit video data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Network hub</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;">4-port</td>
			<td>Used to transmit video data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High precision tweezer</td>
			<td style="width:143px;">SPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to glue number and RFID tags to bees</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sugar</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to mix with water to create sugar-water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pollen</td>
			<td style="width:143px;">Any local apiarist</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fed to bumblebees</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Marking cage with plunger</td>
			<td style="width:143px;">Beeworks.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Aids tagging process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Honey</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to mix with water ot create pollen paste</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bake clay</td>
			<td style="width:143px;">Sculpey</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Stimulus for RFID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clay shaping tools</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Stimulus for RFID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">White paper</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Stimulus for Video</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Laser printer</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Stimulus for Video</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wood</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Stimulus for Video -- attachment clip</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radio frequency identification and motion-sensitive video efficiently automate recording of unrewarded choice behavior by bumblebees

私たちは、同封の試験空間でのマルハナバチの選択行動を観察するための2つの方法を提示します。最初の方法は、無線周波数識別（RFID）は、様々な視覚的な手がかりを表示造花に組み込まれて、読者、およびマルハナバチ労働者の胸部に接着RFIDタグ（ すなわち 、パッシブトランスポンダ）から構成されています。我々の実装では新規性は、RFIDリーダは、色、パターン·タイプ、空間周波数（パターンすなわち 、「多忙 ​​」）、および対称性（空間周波数のようないくつかの異なる視覚特性を表示することが可能である造花に直接組み込まれていることである対称性）は、この実験で操作されていませんでした。さらに、自動化されたシステムと併せてこれらの視覚ディスプレイは報わと訓練されていない選択行動を記録することが可能である。第二の方法は、動きに敏感な高精細ビデオカメラを使用して、造花で記録選択行動から構成されています。 Bumblebeesは一意に識別するため、そのthoracesに釘付け番号タグを持っている。 RFIDにわたってこの実装における利点は、着陸の挙動を観察することに加えて、ホバリングおよびantennationとして好みの代替策も観察することができることである。両方のオートメーションメソッドは、アカウントに個人差を取る大規模な研究を可能にすることによって実験的制御、および内部妥当性を高める。ミツバチが自由にそのようなオンサイト研究助手の可用性などの制約なしにテスト環境を出入りすることができますので、外的妥当性も向上する。リアルタイムで、人間の観察と比較して、自動化された方法は、より費用対効果の高い、おそらく少ないエラーが発生しやすい。

実験1：RFIDデータ コロニー内のすべての375の労働者は、RFIDタグが付けられた、これらの労働者の318（85％）が試験期間中のある時点で飛行ケージに入った。 197の合計（コロニーを残した蜂の62％）は、4つの造花刺激の少なくとも一つを訪問しました。 選択の定義選択は造花を締結する労働者として定義した（ 図1を参照）。私たちは、この行動ラベル「花の探査を。 &quot;選択のこの定義は、調査に応じて、ホバリング、antennationまたは着陸のいくつかの組み合わせを使用し、文献で使用されているもの、より厳しいです。それはミツバチが、ホバリングantennating、その上に着陸することによって、だけでなく、それを探求することで刺激に出席するだけでなく、必要とするため、花の探査は、選択の厳格な定義である。 データ管理<p class="jove_content"&gt; RFID技術は、他のメソッドに関連したデータの膨大な量を収集する能力を有する。この実験は、310221のレコードを生成した。 MySQLなどのデータベースプログラムは、このデータ量を格納するための不可欠なツールであると同様に重要な研究課題への回答を引き出すために使用されるSQLクエリです。例えば、一つの問題は、選択した定義である。 RFIDリーダーは、数分あるいは数時間のために造花の内側にとどまっ蜂の場合には、数千の録音に翻訳することができ、タグごとに1ミリの存在を記録するように構成された。選択の私達の定義は、少なくとも1ミリ秒続いた訪問だったが、録音の現在の文字列は、少なくとも1分の休憩で破壊されるまで新たな訪問はカウントされないだろう。 実験の概要フィットテストの四複製された良さが選択肢pを比較するためにミツバチ」「ナイーブセッション」からすべての選択肢について実施した偶然7の理論値にroportions。蜂のナイーブセッションは蜂が「参加した」とは、最初のテストの状態を指す。 G-テストは、中央位置の選好（ 表1を参照）、放射状のタイプを明らかにしている。 図4bは、同心円状のパターンが中央に配置され、放射状に周囲に配置されたとき、パターンの好みが逆になって示されている。位置決めは、図4a及びdのように一定に保たれている場合は、パターンの好みは、放射状パターンに向かっている。 図4は、各組み合わせのために、各パターンの最初の選択肢の相対的な割合は、すべての選択肢のために示す割合と同等であったことを示しています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig4highres.jpg"/> 図4. RFIDの実験結果。tにおける選択肢の周波数彼暗褐色の棒グラフ1実験では4つの異なる花の組み合わせはハチのナイーブセッション（左側y軸）からのすべての選択肢を表示し、淡褐色のバーは、各労働者の最初の選択 （右側のy軸を示している）。 「すべての選択肢」のショーに匹敵パターン &quot;最初の選択肢」が、より大きな統計的検出力を持つまで。棒グラフは、パターンの位置、パターンの種類よりも重要であることを示している。中央に配置されたパターンは、パターンの種類が他のあまり好ましくない同心円パターンを示していても好ましかった。アスタリスクは、偶然とは大きく異なる選択肢の割合を示している。注意してください。 * P &lt;0.05、** P &lt;0.01、*** P &lt;0.001。この図は、ORBAN ら 11から変更されている。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> 条件 </td><td colspan="3"> Pooled </td><td colspan="3"> 異質 </td><td></td></tr><tr><td> Gpの</td><td> DF </td><td> P </td><td>ガーナ</td><td> DF </td><td> P </td><td></td></tr><tr><td>中央同心VS中央ラジアル</td><td> 3.96 </td><td> 1 </td><td> 0.047 </td><td> 197.55 </td><td> 41 </td><td> 0.000 </td><td></td></tr><tr><td>中央同心VSペリフェラル、ラジアル</td><td> 33.77 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 210.81 </td><td> 42 </td><td> 0.000 </td><td></td></tr><tr><td>ペリフェラル同心VS中央ラジアル</td><td> 508.31 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 345.78 </td><td> 30 </td><td> 0.000 </td><td></td></tr><tr><td>ペリフェラル同心VSペリフェラル-ラジアル</td><td> 7.42 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 84.06 </td><td> 24 </td><td> 0.000 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1。 </sチョン&gt; RFIDデータの推測統計。実験1この表は、オルバンらから変更されている。（2013）11は 、G pは偶然からグループの割合の著しい偏りを指し、G hは （個人差のためのテストを指し、 すなわち 、異質）。統計的検定の完全な詳細については、原稿をご参照ください。 実験2：ビデオ·データ 264の選択肢の合計が3のテストセッションで4条件にわたって記録した。 表2は、各コロニーから貢献して労働者と選択肢の数を示しています。 選択の定義ホバリング、antennationと着陸：ビデオデータが選択行動の3つのタイプの記録を可能にする。行動のすべての3つのタイプがホバリングとantennationがdifficuされ、観察することができるが、LTは貧弱な解像度、または低速度ビデオカメラは記録することはできません迅速な動きにタグ番号に関連付ける。それは高精細ビデオカメラを使用することが重要である読み取ることができるフレームの数が少ない上にのみ表示されることがありタグ番号を確実にするために（これは私たちに利用できなかったものの、理想的には、高フレームレートのビデオカメラは、ボケを最小化するために使用されるべきである） 。この方法は、花の探査を検出し、RFID技術を用いて選択パターンを比較した。 モーション感度の考慮事項成功した実験の製造における主要な問題の一つは、動作感知カメラの構成図である。あまりにも敏感であるビデオカメラは現実的ではないと処理することが非常に高価になることができますあまりにも多くのデータを記録します。たとえば、最初に私たちのビデオカメラは建物の中に定期的な振動によって引き起こされた（ 例えば、廊下、エアコンなどに通り過ぎる人々 ）1Rをもたらし、11; 150-200すべての記録されたビデオクリップの2の有効なデータポイント。一方、さらに深刻なエラーが鍵データを逃すことができ、低感度の設定である。これは、エラーが結果を歪曲することができ、サンプリング、そうでなければ、同じようにすべてのビデオカメラを構成することが重要です。 実験の概要フィットテストの4つの複製された良さが偶然から大きく逸脱し、3つのグループの割合、および一つの非重要な全体的な割合を（ 表3および図5参照）が見つかりました。 （1）パターンは重要です：中央同心円状のパターンを介して中央ラジアルのための重要な好ましいのは、（ 表3参照）が見つかりました。 （2）半径方向のパターンの位置はそれほど重要では：中央の半径方向及び周半径方向の組み合わせの提示機会から有意差を示さなかった。 （3）中央ラジアルおよび周辺-同心の組み合わせが向かって強い優先をもたらした中央放射状パターンだ。同心の-中枢および末梢ラジアルの組み合わせは、末梢ラジアルパターンに対して有意な好みを誘発した。パターンは場所を捏造。個体差は、すべての4つの組み合わせ（ 表3参照）における非有意であった。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig5highres.jpg"/> 図5.モーションセンシティブ動画の検索結果結果2.実験における四つの異なる花の組み合わせで選択周波数はパターンポジショニングオーバーパターンタイプの重要性を示しています。ラジアルパターンは、パターンが周囲に配置した場合でも好まれた。値が表示されるパターンの選択肢の数を示している。アスタリスクは、偶然とは大きく異なる選択肢の割合を示している。注意してください。 ** はp &lt;0.01、*** はp &lt;0.001。この図は、オルバン11から変更されている。 <tabl電子国境= &quot;0&quot; CELLPADDING = &quot;0&quot; CELLSPACING = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> 条件 </td><td> セッション1 </td><td colspan="2"> セッション2 </td><td colspan="2"> セッション3 </td></tr><tr><td>コロニー1 </td><td>コロニー2 </td><td>コロニー3 </td><td>コロニー4 </td><td>コロニー5 </td></tr><tr><td>労働者の号</td><td> 45 </td><td> 7 </td><td> 2 </td><td> 8 </td><td> 23 </td></tr><tr><td>選択肢の番号</td><td> 151 </td><td> 25 </td><td> 2 </td><td> 20 </td><td> 65 </td></tr></tbody></table> 表2.モーションセンシティブビデオデータの記述統計。合計各コロニーのための実験2の造花で記録された選択肢の数、およびこれらの選択をする労働者の数。このテーブルには、オルバンら 11から変更されている。原稿をご参照ください完全な詳細については。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> 条件 </td><td colspan="3"> プールされた </td><td colspan="3"> 異質 </td></tr><tr><td> Gpの</td><td> DF </td><td> P </td><td>ガーナ</td><td> DF </td><td> P </td></tr><tr><td>中央同心VS中央ラジアル</td><td> 17.98 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 40.72 </td><td> 29 </td><td> 0.073 </td></tr><tr><td>ペリフェラルラジアルVS中央ラジアル</td><td> 1.85 </td><td> 1 </td><td> 0.173 </td><td> 53.63 </td><td> 39 </td><td> 0.060 </td></tr><tr><td>中央同心円対末梢ラジアル</td><td> 6.57 </td><td> 1 </td><td> 0.010 </td><td> 26.31 </td><td> 27 </td><td> 0.500 </td></tr><tr><td>ペリフェラル同心円対中央ラジアル</td><td> 18.18 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 41.92 </td><td> 37 </td><td>0.256 </td></tr></tbody></table> 表3.推測統計モーションセンシティブビデオデータ。実験2この表はオルバンらから変更されている。11。G pは偶然からグループの割合の著しい偏りを指し、G hは （個人差のためのテストを指し、 すなわち 、異質）。統計的検定の完全な詳細については、原稿をご参照ください。

Watch this Scientific Journal Video about Radio Frequency Identification and Motion-sensitive Video Efficiently Automate Recording of Unrewarded Choice Behavior by Bumblebees at JoVE.com

Radio Frequency Identification and Motion-sensitive Video Efficiently Automate Recording of Unrewarded Choice Behavior by Bumblebees

This video describes Radio-Frequency Identification (RFID) and motion-sensitive video recording methods to monitor choice behavior by bumblebees.

無線周波数識別かつ効率的にモーションセンシティブビデオがマルハナバチによって報わ選​​択行動の記録を自動化

We present two methods for observing bumblebee choice behavior in an enclosed testing space. The first method consists of Radio Frequency Identification ...

radio-frequency-identification-motion-sensitive-video-efficiently

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.8K ビュー.  University of Ottawa. This video describes Radio-Frequency Identification (RFID) and motion-sensitive video recording methods to monitor choice behavior by bumblebees. 

ビデオ: Radio Frequency Identification and Motion-sensitive Video Efficiently Automate Recording of Unrewarded Choice Behavior by Bumblebees

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

神経科学

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. For this protocol the freezing medium used is 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) diluted in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS). Blocks of cortical tissue are transferred to cryovials containing the freezing medium and slowly frozen at -1&deg;C/min in a rate-controlled freezing container. Post-thaw processing and dissociation of frozen tissue blocks consistently produced neuronal-enriched cultures which exhibited rapid neuritic growth during the first 5 days in culture and significant expansion of the neuronal network within 10 days. Immunocytochemical staining with the astrocytic marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the neuronal marker beta-tubulin class III, revealed high numbers of neurons and astrocytes in the cultures. Generation of neural precursor cell cultures after tissue block dissociation resulted in rapidly expanding neurospheres, which produced large numbers of neurons and astrocytes under differentiating conditions. This simple cryopreservation protocol allows for the rapid, efficient, and inexpensive preservation of cortical brain tissue blocks, which grants increased flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Here, we describe a method for efficient cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. This simple protocol provides flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

高濃縮ニューロン培養の世代のための皮質組織ブロックの凍結保存

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

動作げっ歯類の可動シリコンプローブによるニューロンの大規模なレコーディング

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, various technologies are being developed as control tools. A subset of these tools focuses on modifying the behavior of arthropods by attraction or repulsion. Therefore, arthropods are often the focus of behavioral investigations. Various tools have been developed to measure arthropod behavior, including wind tunnels, flight mills, servospheres, and various types of olfactometers. The purpose of these tools is to measure insect or arachnid response to visual or more often olfactory cues. The vertical T-maze oflactometer described here measures choices performed by insects in response to attractants or repellents. It is a high throughput assay device that takes advantage of the positive phototaxis (attraction to light) and negative geotaxis (tendency to walk or fly upward) exhibited by many arthropods. The olfactometer consists of a 30 cm glass tube that is divided in half with a Teflon strip forming a T-maze. Each half serves as an arm of the olfactometer enabling the test subjects to make a choice between two potential odor fields in assays involving attractants. In assays involving repellents, lack of normal response to known attractants can also be measured as a third variable.

A vertical, T-maze olfactometer is described for assaying the behavioral response of arthropods. The olfactometer allows the experimenter to measure choices performed by test subjects when subjected to two potential odor fields. Both attraction to and repulsion from odorants can be measured with this device.

匂い物質へ節足動物Responseの垂直T-迷路チョイスアッセイ

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

後根潜在的記録によりマウスにおける脊髄シナプス前抑制を測定する<em&gt;インビボ</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

縦断のために脊髄商工を移植するための手順<em&gt;インビボ</emマウス脊髄の&gt;イメージング

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Quantifying Fish Swimming Behavior in Response to Acute Exposure of Aqueous Copper Using Computer Assisted Video and Digital Image Analysis

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction. However, these responses may be subtle, and measurement can be challenging. Using juvenile white sturgeon (Acipenser transmontanus) with copper exposures, this paper illustrates techniques used for quantifying behavioral responses using computer assisted video and digital image analysis. In previous studies severe impairments in swimming behavior were observed among early life stage white sturgeon during acute and chronic exposures to copper. Sturgeon behavior was rapidly impaired and to the extent that survival in the field would be jeopardized, as fish would be swept downstream, or readily captured by predators. The objectives of this investigation were to illustrate protocols to quantify swimming activity during a series of acute copper exposures to determine time to effect during early lifestage development, and to understand the significance of these responses relative to survival of these vulnerable early lifestage fish. With mortality being on a time continuum, determining when copper first affects swimming ability helps us to understand the implications for population level effects. The techniques used are readily adaptable to experimental designs with other organisms and stressors.

Measuring the impacts of environmental contaminants on fish behavior is often subjective and challenging particularly when dealing with sublethal endpoints. We describe methods including video technology to quantify swimming behavior of early life stage white sturgeon (Acipenser transmontanus) during and after 96 hr acute exposures to various concentrations of copper.

コンピュータ支援ビデオとデジタル画像解析を用いた銅水溶液の急性暴露に応答して、魚の遊泳行動を定量化

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction.  ...

Insect-machine Hybrid System: Remote Radio Control of a Freely Flying Beetle (Mercynorrhina torquata)

The rise of radio-enabled digital electronic devices has prompted the use of small wireless neuromuscular recorders and stimulators for studying in-flight insect behavior. This technology enables the development of an insect-machine hybrid system using a living insect platform described in this protocol. Moreover, this protocol presents the system configuration and free flight experimental procedures for evaluating the function of the flight muscles in an untethered insect. For demonstration, we targeted the third axillary sclerite (3Ax) muscle to control and achieve left or right turning of a flying beetle. A thin silver wire electrode was implanted on the 3Ax muscle on each side of the beetle. These were connected to the outputs of a wireless backpack (i.e., a neuromuscular electrical stimulator) mounted on the pronotum of the beetle. The muscle was stimulated in free flight by alternating the stimulation side (left or right) or varying the stimulation frequency. The beetle turned to the ipsilateral side when the muscle was stimulated and exhibited a graded response to an increasing frequency. The implantation process and volume calibration of the 3 dimensional motion capture camera system need to be carried out with care to avoid damaging the muscle and losing track of the marker, respectively. This method is highly beneficial to study insect flight, as it helps to reveal the functions of the flight muscle of interest in free flight.

Insect-machine Hybrid System: Remote Radio Control of a Freely Flying Beetle Mercynorrhina torquata

This protocol describes the process of constructing an insect-machine hybrid system and carrying out wireless electrical stimulation of the flight muscles required to control the turning motion of a flying insect.

昆虫・マシン・ハイブリッドシステム：自由フライングビートルのリモートラジオコントロール（<em&gt; Mercynorrhina torquata</em&gt;）

The rise of radio-enabled digital electronic devices has prompted the use of small wireless neuromuscular recorders and stimulators for studying in-flight ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

UV反射構造を検出してのSailFinモリーを使用して、メイト優先でその重要性を決定するためのアッセイ<em&gt; Poecilia latipinna</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...

無線周波数識別かつ効率的にモーションセンシティブビデオがマルハナバチによって報わ選​​択行動の記録を自動化

無線周波数識別かつ効率的にモーションセンシティブビデオがマルハナバチによって報わ選択行動の記録を自動化