マリー·キュリー国際フェローシップ送信（欧州連合（EU）のFP/2007-2013グラント契約＃221834と254780）、JDマクダネル財団、NSFグラントSBE 0542013、健康グラントNS034994の国立研究所、精神保健グラントMH5467、ハワードヒューズ医学研究所の国立研究所（Janeliaファームリサーチキャンパス助成金）。

1。マイクロドライブの構築電極と頭蓋骨に固定されている固定部を運び可動部：すべてのドライブは、同じ基本的な要素から作られています。理想的なマイクロドライブは、複数の小さなステップの電極の平滑が十分に長い旅を可能にする電極の偶発的な動きを防ぐため、頑丈なことに、動物の行動に干渉することなく、実験者によって操作が簡単、重量の大きさと光の中で小さいです。これらの競合する要求の結果として、異なるドライブ·スイート様々なアプリケーション。 真鍮フラットヘッドネジ、マッチングナット、シングルロウピンヘッダー、2つのカスタムカット真鍮板から調製したプラスチック製のブリッジのみ：4部は、当社の基本的なドライブを構築するために必要とされている。 <ol><li>ヘッダーから3ピンの部分を破る</li><li>静かに中央のピンを引き抜きます。 </li><li>ドリルビットサイズが＃55とそれを介してドリルで穴を拡大します。 </li><li>目をカット00から90のタップを使用してお読みください。 </li><li>真鍮板二枚を切り取ります。 </li><li> Dremmelでプレートの端を提出してください。 </li><li>ドリルビットサイズ＃65を使用して、両方の部分の真ん中に穴を開けます。 </li><li>真鍮板がピンに触れているようにドライブの部分を組み立てる。これを達成するために、真鍮板、ねじピン·ヘッダ·ホール、第真鍮板、ナット、連続を通じて、真鍮のネジを挿入します。優しくそうアセンブリが​​安定になることをしているネジを締めます。 </li><li>はんだ端子は真鍮のプレートに終了します。 </li><li>ねじの突出末端を提出してください。 </li><li>ネジにナットをはんだ。ない真鍮板に半田付けナットを十分に注意してください。 </li><li>ドライブの動きをテストします。プラスチック製の橋を高めるために時計回りにネジを回します。 </li></ol> 2。シリコンプローブを準備するドライブにプローブを固定する前に、cerebrを防ぐために、プローブのボンディング領域に余分な断熱材を追加するospinal液（CSF）または短絡を生産するから湿度： <ol><li> 10:1の比率でSylgardエラストマー成分を秤量し、混合します。 </li><li>シャープ綿棒を使用して、プローブの先端にSylgardを適用します。 </li><li> 2時間60℃に予熱したオーブンで乾燥させます。 </li></ol>記録部位は、任意の残骸を欠いていることを確認するために、プローブ·チップは、洗浄する必要があります。 <ol start="4"><li> Contrad洗剤の4％の希釈を準備します。 </li><li>プローブは少なくとも2時間63℃で中性洗剤に浸しましょう​​。 </li><li>蒸留水で繰り返しプローブを浸漬することにより、洗剤を洗い流してください。 </li></ol>ドライブにプローブを固定する前に、各記録部位のインピーダンスを確認する必要があります。 <ol start="7"><li> 0.9％食塩水にプローブを浸し、インピーダンスメーターに接続します。あまりにも多くの記録部位が間違っインピーダンスは、手順2.4から2.6を持っているか、別のプローブを用いて検討してください。ここでは自家製のチャネルセレクタと組み合わせるフレデリックHaer、株式会社（FHC）からインピーダンス調整モジュールを使用しています。また、Neuralynx、Inc。のNeuroNexus、Inc。またはNanoZによってniPOD同時に、すべてのプローブ·チャネルのインピーダンスを監視することができます。 </li></ol> 3。マイクロドライブにプローブを貼付<ol><li>かみそりの刃を使用して、堅牢な表面を作成するためにブリッジに複数の溝を切った。 </li><li>ドライブのブリッジにプローブを並べる。この手順は、最高のクランプでドライブを保持し、シャンクは、ドライブのネジで完全に平行になるように、マイクロマニピュレータでプローブを調整することにより、手術用顕微鏡下で行われます。これは、それを介して &quot;切断&quot;せずに脳組織にプローブシャンクの移動、前進時にそれを確実にします。ドライブのベースに相対的なプローブ·チップの正確な深さは表面から考慮ターゲット構造の深さを取って、この段階で決定されるべきである頭蓋骨。 </li><li>プローブは、その後グリップセメントでブリッジに固定されています。 </li><li>オプション：脳内のプローブのトラックを視覚化するため、DII溶液（エタノールで希釈した1から2パーセント）はこの段階では、プローブの背面に適用することができます。 </li></ol> 4。頭蓋骨の準備手術前には、基準とグランド電極と、上のヘッドファラデーケージの部品が用意されています。 <ol><li>銅線の2つの2 &quot; - 長い部分と、約1 mmの各絶縁銅線のはんだ一方の端をカットします。 </li><li>針を使用して、それへの銅線の00から90、1/8 &quot;ステンレス製のネジと半田ワンピースの頭をこすり、はんだ付けなどのステンレス鋼の接地ネジ電極には、適切なフラックス（例えば、N-3のすべての目的を必要とするラ社からフラックス）と高いはんだごて先端温度。慎重にネジの溝に流れ込むから任意のはんだを防ぐことができます。これは、接地電極として使用されます。準備するために、別のネジと銅線で繰り返し参照電極。 </li><li>銅メッシュからtrapeziodal部分を切り取ります。これらの作品は、ヘッドを保護するために組み立てられます。 </li></ol>多くの小さな動物の手術で使用されている手術器具と準備は同じです。全体の手術が承認されたNIHのガイドラインに従って、無菌条件を使用して、深いイソフルラン麻酔下で行われます。このビデオに示すように、（モック）手術は、デモンストレーションのみを目的としてあることに注意してください。適切な可視性と撮影の目的は、いくつかの準備手順、手術予防と術後の手順について示した/目に見えるか説明していません。 手術に先立ち、すべてのコンポーネントと電源は、適切な手順（; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdfサバイバル齧歯類の手術のためのガイドラインを参照してください）​​に続いて、滅菌されるべきである。手術中、頭蓋骨の滅菌フィールドは、滅菌ドレープによって準備され、隔離されています。最後の手術では、広いスペクトルの抗生物質です。ローカルppliedと長時間作用型の鎮痛剤（例えば、ブプレノルフィン、[Buprenex] 0.05 mg / kg）を筋肉内に与えられます。加えて、鎮痛剤（例えば、イブプロフェン）は5日間で約60 mg/kg/24時間で飲料水に記載されています。適切な手術と麻酔の手順については、適切な情報源12を参照してください。 <ol start="4"><li>定位固定装置に動物をインストールし、剃ると頭皮13を清掃してください。 </li><li>正中線に沿って皮膚を切って、頭皮を脇にプッシュします。 、骨膜を除去するクリーニングと頭蓋骨を乾燥させる。 </li><li>ブレグマとラムダとの間の位置との距離を測定し、それに応じて定位アトラス14を使用してプローブの注入部位のx座標とy座標を決定します。メスで頭蓋骨に十字架をこすることで、サイトをマークします。 </li><li>上に別の骨プレート上に、途中で骨に丸頭のドリルビット（サイズ¼）とドライブのサポートネジ（ステンレス鋼、000から120、1/16 &quot;）を使用して頭蓋骨をドリル頭蓋骨の側面を購入する。ネジがしっかりと結合ヘッドギアに頭蓋骨にアンカーを提供します。 </li><li>小脳上の穴をドリルとグランドのステップ4.2で調製した参照電極を挿入します。ローカルフィールドポテンシャル（LFP）を記録するために、リファレンスサイトの選択は重要です。小脳LFPは、この正中線の位置で最小であるすべての皮質領域と筋肉アーティファクトの最小であるため、このサイトが選択されます。 </li><li>頭蓋骨の表面全体に小さなブラシを使用して、象牙質活性化因子（Metabondキット）を適用します。 0.9％食塩水で洗ってください。 </li><li>慎重にアンカーネジとアースと参照電極を覆うが、プローブ注入部位が明確に残して、頭蓋骨に、歯科用セメントを（混合については、製造元の指示に従ってくださいMetabondキット）を適用します。 </li><li> 4つの銅メッシュフラップ（ステップ4.3に調製）を頭蓋骨に固定します。このためには、頭蓋骨の前方、左、右、および後部の両側にそれぞれの狭い基盤を固める。番目のeの銅は、骨と直接接触しませんが、常にセメントの層で区切らないでください。 </li></ol> 5。脳の表面を準備する<ol><li>頻繁に生理食塩水で骨を潤しながら、丸頭のドリルビットを使用して、複数の段階で移植部位の周りにドリルダウンします。 </li><li>慎重に骨弁を除去し、脳表面を灌漑。 </li><li>複数のシャンクプローブを挿入するため、硬膜の大規模なストリップは削除されます。メスと昆虫針（あるいは、標準タングステン微小電極）から調製されたフック：2つのツールは、硬膜を除去するために必要とされている。硬い表面（例えばガラス顕微鏡スライド）に対して押すことにより、針の先端を曲げて、（​​ここでは、木製のQ-ティップの一部、あるいはmicrodissectingニードルホルダー）は、ハンドルに取り付けます。 </li><li>フックで硬膜を持ち上げて、メスでそれを切る。特別なケアは、PIA、船舶、新皮質の表面の損傷を防ぐために取られます。小さな出血が解決することができます生理食塩水灌漑による。大出血が発生した場合、または新皮質が何らかの方法で侵害された場合は、1つは、手術を終了し、別の動物の作製を検討する必要があります。 </li></ol> 6。プローブを注入するこの段階では、皮質表面の血管の密度と配向性を慎重に評価されています。プローブは大きな血管からのフリーエリアでは、脳を貫通しているため、定位座標は、調整する必要があります。 注入は、ドライブ·アセンブリは、定位ホルダーに取り付けられたワニ口クリップで保持することができます。途切れない脳表面の可視性とプローブの先端は成功した侵入のために重要である。 <ol><li>常に生理食塩水で開頭術を潤しながら、ゆっくりと、目的のターゲット上で約1ミリメートルにプローブを下げる。新皮質の記録については、プローブ·チップは、皮質に約0.5ミリメートルを下げており、表面の近くに戻って持ち上げた。 </li&gt; <li>ニードル（10 mLのパラフィン油中のワックスの10 20G、65℃で加熱）を介してワックスとパラフィンオイルの温かい溶融混合物を適用することにより、開頭術をシールします。前のアプリケーションに、30°Cにミックスを冷却し、密度をテストします。それは）簡単なプローブの動きを可能にするために十分なソフトでなければなりません。完全なカバレッジを容易にするために、混合物をマイクロcauterizerの先端で硬化したワックスに近づくことによってその場で溶融することができます。 </li><li>オンにする無料のナットを残すように注意して、グリップセメントで頭蓋骨にドライブの底部を添付してください。それは、プローブが皮質に損傷を与えますそれ以外の場合は、この段階でドライブのいずれかの偶発的な &quot;バンプ&quot;を回避するために最も重要である。ドライブが頭蓋骨に固定された後、プローブの滑らかな動きを確認する必要があります。 </li><li>頭蓋骨にプローブのコネクタ部分を固める。 </li></ol> 7。上のヘッドファラデーケージを構築する<ol><li>プルアップ抵抗とプローブとDRI周りに保護シリンダーに銅メッシュフラップを組み立てるVE。シリンダーは、環境ノイズと動作動物中の荷電ウィスカによって生成された徐波の成果物に対して、電気シールドとして機能します。 </li><li>銅メッシュがプローブコネクタの上部レベルですので、余分な材料を離れて切断することによってシリンダーの高さを調整します。 </li><li>はんだリファレンスとグランドのネジからコネクタの適切なピンへの配線。また、はんだ隣接する銅メッシュフラップが一緒に銅メッシュにアース線を電気的導通を確保し、はんだ付けします。 </li><li>それを強化するため、金属や動物の皮膚の間の任意の直接接触を防ぐために銅メッシュ上にグリップセメントの層を適用します。必要に応じて、さらにヘッドギアを強化​​するためのエポキシ樹脂の層を適用します。 </li><li>ドライブスクリューの動きをテストします。 </li><li>ゴム手袋からカット部分とヘッドギアの上部をカバーしています。 </li></ol> 8。自由に動く動物の記録<ol><li> appropri後術後ケアを食べ、高インピーダンスヘッドステージと軽量、ultraflexibleマルチストランドケーブルを使用して記録システムに動物を接続します。カウンターヘッドギアの重量。 </li><li> homecageに毎日記録の品質をテストします。記録部位の位置は、ユニットの発火パターンとローカルフィールドポテンシャルの形状の両方によって判断される。ターゲット構造に達するまで少しずつ（通常は1月8日1日あたり1/4回転まで、すなわち35から70マイクロメートル）でネジを回して徐々にプローブを下げます。 </li></ol> 9。代表的な結果電気信号（ローカルフィールドポテンシャルとユニット活動）が記録された構造と動物の現在の動作に応じて異なります。ラットのオープンフィールドを探求している間に図1は、32チャンネルCA1海馬の録音の例を示します。 supの探査中にローカルフィールドポテンシャルの著名な8ヘルツ（シータバンド）発振に注意してください。複数のシャンクと部位（矢印で示されたスパイクの例）でスパイクerimposed。ニューロンユニットのアクティビティを分析するために、スパイクが検出され、その波形を15から16までのクラスター分析を使用して単一のユニットにソートされます。 <img src="/files/ftp_upload/3568/3568fig1.jpg" alt="図1" /> 図1 4シャンクス×8サイトのシリコンプローブを用いて行動をラットCA1海馬の録音。録音は、広帯域とローカルフィールド電位振動（例えば &quot;シータ&quot;バンド8 Hzのリズム）とニューロンのスパイク活性の両方を勉強することができます20 000 Hzのサンプリングされます。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3568/3568table1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3568/3568table1.jpg" alt="表1に" /></a> 表1に使用される試薬や機器への代替。

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利害の衝突が宣言されません。

この映画は動作ラットの慢性的な大規模なレコーディング用シリコンプローブの注入手順を示しています。ニューロンの活動の質の録音を確保するための重要なステップは、生物学（脳組織）と技術（シリコンプローブ）材料の両方の脆弱性から生じる。任意のリモート &quot;ハード&quot;面（1つは硬膜を除去せずに脳にそれらを移植しようとした場合、例えば、シャンクが壊れるだろう）と?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 名 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>シリコンプローブBuzsaki32、4シャンク×8サイト。包装：柔軟なポリアミドケーブル</td><td>材料</td><td> NeuroNexus </td><td>プローブ：buzsaki32 包装：HC32 </td><td>記録用プローブ</td></tr><tr><td>ラウンド真鍮ねじ、00から90×1/2ラウンド真鍮のネジ</td><td>材料</td><td> JIMorris </td><td> R0090B500 </td><td>駆動部</td></tr><tr><td>真鍮六角ナット、00から90 </td><td>材料</td><td> JIMorris </td><td> N0090B </td><td>駆動部</td></tr><tr><td>真鍮C260ストリップ、ASTM-B36 厚さ：0.025 &quot;、長さ：12&quot;幅：1/2 &quot; </td><td>材料</td><td>スモールパーツ</td><td> B000FMYU72 </td><td>駆動部</td></tr><tr><td>コネクタヘッダ、ピッチ2mmのメートルエール、単一行、まっすぐ、36ポジション</td><td>材料</td><td>閲覧</td><td> 2163S-36-ND </td><td>駆動部</td></tr><tr><td> 2部Sylgardシリコンエラストマー</td><td>材料</td><td>世界の精密機器</td><td> SYLG184 </td><td>にプローブを外断熱</td></tr><tr><td>ディーコンは70液体洗剤をContrad </td><td>試薬</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 04から355 ディーコン研究所 番号：1002 </td><td>記録部位をきれいにする</td></tr><tr><td>インピーダンス調整モジュール</td><td>機器</td><td> FHC（株） </td><td> 55-70-0 </td><td>インピーダンス計</td></tr><tr><td> niPOD - 32チャンネル</td><td>機器</td><td> Neuronexus </td><td> niPOD -32 </td><td>インピーダンス計</td></tr><tr><td>グリップセメント産業グレード</td><td>材料</td><td>コー​​キングDentsply </td><td> 675571（粉末） 675572（溶媒） </td><td>グリップCEメンター</td></tr><tr><td> 1,1 &#39; - ジオクタデシル-3,3,3&#39;、3&#39;-tetramethylindocarbocyanine過塩素酸塩（ &#39;DiIを&#39;; DiIC18（3）） </td><td>試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> D282 </td><td>脳内のプローブトラックを染色するために</td></tr><tr><td>ステンレス鋼の機械ねじ、バインド頭、スロットのドライブ、＃00から90、1/8 &quot; </td><td>材料</td><td>スモールパーツ</td><td> MX-0090-02B </td><td>グラウンドとリファレンスネジ</td></tr><tr><td>マグネットワイヤ、20G、ナイロンポリウレタンコーティング、MW80 </td><td>材料</td><td>スモールパーツ</td><td> B000IJYRP2 </td><td>地面と基準線</td></tr><tr><td>ステンレススチール製の小ネジ、ドライブスロット結合ヘッド、＃000から120、1/16 &quot; </td><td>材料</td><td>スモールパーツ</td><td> MX-000120-01B </td><td>アンカーのネジ</td></tr><tr><td> N-3のすべての汎用磁束液体</td><td>試薬</td><td>ラ-CO（MARKAL） </td><td> 23512 </td><td>半田ステンレス鋼にできます。 </td></tr><tr><td>マイクログリッドの精度拡張銅</td><td>材料</td><td> Dexmet </td><td> 3 CU6-050 ​​FA </td><td>上のヘッドファラデーケージ用銅メッシュ</td></tr><tr><td> C＆B-METABONDクイック！セメントシステム - 象牙質アクチベーター</td><td>材料</td><td> Parkell </td><td> S380 </td><td></td></tr><tr><td> C＆B-METABONDクイック！セメントシステム - 歯科用セメント</td><td>材料</td><td> Parkell </td><td> S380 </td><td></td></tr><tr><td>鋭いポイントタングステン針とホルダー</td><td>ツール</td><td> Roboz手術器具</td><td> RS-6064とRS-6061 </td><td>硬膜を持ち上げてフックを作成するには</td></tr><tr><td>カーバイドバーHP 1月4日</td><td>ツール</td><td>ヘンリーシャイン</td><td> 9990013 </td><td></td></tr><tr><td>パラフィン（顆粒） </td><td>材料</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> P31-500 </td><td></td></tr><tr><td>ミネラルオイル、ライト（NF / FCC） </td><td>材料</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> O121-1 </td><td></td></tr><tr><td> GC ELECTRONICS 10から114の2パートエポキシ接着剤</td><td>材料</td><td>ニューアーク</td><td> 00Z416 </td><td></td></tr><tr><td>タイプ1のリッツ21 AWG 36分の40レッド0.041 TO（MW80-C）ポリウレタンナイロンシングル &quot;+ / -0.002&quot; OD </td><td>材料</td><td>ニューイングランドワイヤー·テクノロジー株式会社</td><td> N28-36E-400から2 </td><td>ヘッドとアンプ間のケーブルを作成するには</td></tr><tr><td> 32チャンネルの非常に大規模な統合のステージ、20倍のゲイン</td><td>機器</td><td> Plexon </td><td> HST/32V-G20 </td><td>ステージ</td></tr></tbody></table>

large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents

神経科学における主要な課題は、神経アセンブリの集団活動にビヘイビアをリンクしている。ニューロンと回路の入出力の関係の理解は、単離されたニューロンの代表的大規模なサンプルの動作動物、すなわち記録の神経アンサンブルのメカニズム解析のために適切な空間選択性と時間分解能を持つメソッドが必要になります。神経活動のアンサンブルの監視は、被験者1から11を含む小規模および大規模な脳が、両方の動物において過去10年間に著しく進展している。シリコンベースのデバイスで複数のサイトの記録があるため、そのスケーラビリティ、少量の、幾何学的デザインの特に有効である。 ここでは、カスタムメイドのアクセサリコンポーネントを使用して市販のマイクロマシンシリコンプローブを用いて、げっ歯類の動作で複数の単一ニューロンと局所電場電位を記録するための方法について説明します。二つの基本的なオプションfがあります。またはプリアンプにシリコンプローブをインターフェース：プリント回路基板とフレキシブルケーブル。プローブの供給会社（ <a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a> 。 <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a> 。 <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a> ）は、通常のボンディングサービスを提供し、プリント回路基板に接合プローブを提供するまたはフレキシブルケーブル。ここでは、柔軟なポリイミドケーブルに接続されている4シャンク、32サイトプローブの注入を記述し、可動マイクロドライブに搭載された。プローブ調製、マイクロドライブ、建設、手術の各ステップは、エンドユーザーが簡単にプロセスを複製することができるように図示されている。

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Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

我々は、大規模な複数の単一ユニットの記録とシリコンプローブとげっ歯類を動作中のローカルフィールドポテンシャルの方法について説明します。ドライブ製造、ドライブとプローブ注入プロセスへのプローブの添付ファイルが簡単に複製するのに十分詳細に示されています。

動作げっ歯類の可動シリコンプローブによるニューロンの大規模なレコーディング

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

large-scale-recording-neurons-movable-silicon-probes-behaving

Research

JoVE Journal

Neuroscience

34.5K ビュー.  University of New Jersey. 我々は、大規模な複数の単一ユニットの記録とシリコンプローブとげっ歯類を動作中のローカルフィールドポテンシャルの方法について説明します。ドライブ製造、ドライブとプローブ注入プロセスへのプローブの添付ファイルが簡単に複製するのに十分詳細に示されています。

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Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

麻酔ラットのシリコンプローブで大規模なニューロンアンサンブルの録音

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

神経科学

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

げっ歯類におけるランニングホイール活動の概日リズムの記録および分析

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the centrolateral/parafascicular; Cl/Pf nucleus). The activation of either the PPN or Cl/Pf nuclei in vivo has been described to induce the arousal of the animal and an increment in gamma band activity in the cortical electroencephalogram (EEG). The cellular mechanisms for the generation of gamma band oscillations in Reticular Activating System (RAS) neurons are the same as those found to generate gamma band oscillations in other brains nuclei. During current-clamp recordings of PPN neurons (from parasagittal slices from 9 - 25 day-old rats), the use of depolarizing square steps rapidly activated voltage-dependent potassium channels that prevented PPN neurons from being depolarized beyond -25 mV.
Injecting 1 - 2 sec long depolarizing current ramps gradually depolarized PPN membrane potential resting values towards 0 mV. However, injecting depolarizing square pulses generated gamma-band oscillations of membrane potential that showed to be smaller in amplitude compared to the oscillations generated by ramps. All experiments were performed in the presence of voltage-gated sodium channels and fast synaptic receptors blockers. It has been shown that the activation of high-threshold voltage-dependent calcium channels underlie gamma-band oscillatory activity in PPN neurons. Specific methodological and pharmacological interventions are described here, providing the necessary tools to induce and sustain PPN subthreshold gamma band oscillation in vitro.

The pedunculopontine nucleus (PPN) is located in the brainstem and its neurons are maximally activated during waking and rapid eye movement (REM) sleep brain states. This work describes the experimental approach to record in vitro gamma band subthreshold membrane oscillation in PPN neurons.

脚橋核ニューロンにガンマバンド振動を記録

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a comprehensive survey of the morphological characteristics observed among a selective neuronal population. Combination of these techniques constitutes a novel approach for the collection and analysis of neuroanatomical data. Together, these techniques enable large-scale, and therefore more comprehensive, sampling of selective neuronal populations and establish unbiased quantitative methods for describing morphologically unique neuronal classes within a population.
The protocol outlines the use of modified rabies virus to selectively label neurons. G-deleted rabies virus acts like a retrograde tracer following stereotaxic injection into a target brain structure of interest and serves as a vehicle for the delivery and expression of EGFP in neurons. Large numbers of neurons are infected using this technique and express GFP throughout their dendrites, producing &#34;Golgi-like&#34; complete fills of individual neurons. Accordingly, the virus-mediated retrograde tracing method improves upon traditional dye-based retrograde tracing techniques by producing complete intracellular fills.
Individual well-isolated neurons spanning all regions of the brain area under study are selected for reconstruction in order to obtain a representative sample of neurons. The protocol outlines procedures to reconstruct cell bodies and complete dendritic arborization patterns of labeled neurons spanning multiple tissue sections. Morphological data, including positions of each neuron within the brain structure, are extracted for further analysis. Standard programming functions were utilized to perform independent cluster analyses and cluster evaluations based on morphological metrics. To verify the utility of these analyses, statistical evaluation of a cluster analysis performed on 160 neurons reconstructed in the thalamic reticular nucleus of the thalamus (TRN) of the macaque monkey was made. Both the original cluster analysis and the statistical evaluations performed here indicate that TRN neurons are separated into three subpopulations, each with unique morphological characteristics.

This protocol describes large-scale reconstructions of selective neuronal populations, labeled following retrograde infection with a modified rabies virus expressing fluorescent markers, and independent, unbiased cluster analyses that enable comprehensive characterization of morphological metrics among distinct neuronal subclasses.

大規模な再建と選択的集団のニューロンを分類するために形態学的指標に基づいて独立、不偏クラスタリング

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced electrodes for large-scale electrophysiological recording of neuronal activity, but the procedures for their chronic implantation are still underdeveloped. The activity of hippocampal place cells is known to correlate with an animal&#39;s position in the environment, but the underlying mechanisms are still unclear. To investigate place cells, here we describe a set of techniques which range from the fabrication of devices for chronic silicon probe implants to the monitoring of place field activity in a cue-enriched treadmill apparatus. A micro-drive and a hat are built by fitting and fastening together 3D-printed plastic parts. A silicon probe is mounted on the micro-drive, cleaned, and coated with dye. A first surgery is performed to fix the hat on the skull of a mouse. Small landmarks are fabricated and attached to the belt of a treadmill. The mouse is trained to run head-fixed on the treadmill. A second surgery is performed to implant the silicon probe in the hippocampus, following which broadband electrophysiological signals are recorded. Finally, the silicon probe is recovered and cleaned for reuse. The analysis of place cell activity in the treadmill reveals a diversity of place field mechanisms, outlining the benefit of the approach.

We describe the diverse steps to implant chronic silicon probes and to record place cells in mice that are running head-fixed on a cue-enriched treadmill apparatus.

慢性的なシリコン プローブと豊かなトレッドミル装置海馬場所細胞の記録

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems neuroscience. One key component of this technique consists of the precise placement of multiple electrodes into desired brain regions and the maintenance of their stability. Here, we describe a protocol for the construction of a 3D-printable hyperdrive, which includes eighteen independently adjustable tetrodes, and is specifically designed for in vivo extracellular neural recording in freely behaving rats. The tetrodes attached to the microdrives can either be individually advanced into multiple brain regions along the track, or can be used to place an array of electrodes into a smaller area. The multiple tetrodes allow for simultaneous examination of action potentials from dozens of individual neurons, as well as local field potentials from populations of neurons in the brain during active behavior. In addition, the design provides for simpler 3D drafting software that can easily be modified for differing experimental needs.

We present the construction of a 3D-printable hyperdrive with eighteen independently adjustable tetrodes. The hyperdrive is designed to record brain activity in freely behaving rats over a period of several weeks.

ラットの行動で大規模な神経細胞記録向上のマルチ ・ テトロード ハイパー ドライブの構築

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...