著者は大いにピエールBourdoncle、トーマスギルバートとコーチンイメージング施設のルイーズRimbaultを認める。この作品は、INSERM、CNRSとリーグ国立コントル·ルがん（エキップのlabellisée）によってサポートされていました。

Tリンパ球の調製<ol><li> 10,11を説明したように一次マウスまたはヒトT細胞を準備します。 </li><li> 3×10 6細胞/ mlの- 2の密度で、10％ヒト血清ABを含む完全RPMI培地中のヒトT細胞を養う。 注：代わりに、ヒト血清のウシ胎児血清（FCS）を使用すると、培養中のヒトT細胞の大部分の自発分極を誘発することができる。 4培養におけるこれらの細胞を維持 - 5日、さらに、この期間中にいつでもそれらを処理。 </li><li>類似の細胞密度で、10％FCSを補充した完全RPMI培地中でマウスT細胞を維持する。 10ng / mlのIL7の存在下で、37℃でO / N培養した後、次の日すぐに使用するか。 </li><li>完全RPMI中CEMヒトT細胞株を育成10％FCSを補充した。 </li></ol> 2.ケモカイン刺激<ol><li> 10 mMのHEPEを補足した暖かいHBSS培地で実験条件あたり5×10 5細胞を洗浄S。いくつかの実験のために、2μgのpmaxGFP及び8μgのをpcDNA3.1 +（空ベクター対照）、デッドPKCζキナーゼ、またはN末端​​Par6プラスミドで前日初代ヒトT細胞を共トランスフェクトする。 </li><li>温かいHBSS-Hepes緩衝培地中で細胞ペレットを再懸濁し（実験条件0.3mlのxの番号を使用する）。 </li><li> 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに細胞を配布します。 注：したがって、単一の実験条件に対応する1管は0.3ミリリットルHBSS-HEPES培地中で5×10 5個の細胞が含まれています。いくつかの実験では、500 nMのラトランクリンAまたは媒体（DMSO）を追加し、ケモカイン刺激の前に30分間細胞をインキュベート。 </li><li>各チューブに10から500 / mlのCCL19またはCXCL12ケモカインを追加します。 注： - ヒトT細胞のための200 / mlのケモカイン我々は通常、10を使用しています。 CEM細胞は、CCL19に結合するCCR7受容体を発現しない。そのため、CEM細胞だけCXCL12刺激に反応することができるようになります。 500 n - でまた、より高いケモカ​​イン濃度（300を使用グラム/ ml）をマウスのT細胞を分極する。 </li><li>チューブを数回反転し、それぞれ、一次T細胞またはCEM 8または10分間37℃の水浴中でそれらを培養する。 </li><li>各チューブに2％パラホルムアルデヒド（PFA）及びPBS中10mMのHepesを含む温かい溶液0.3mlを加えて分極処理を停止する。チューブを反転し、5分間37℃でそれらをインキュベートする。 </li></ol> 3.染色は<ol><li>チューブフローサイトメトリーマイクロチューブから細胞を転送します。 </li><li> 1％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.5mMのEDTA、PBS中の10mMのHepesを含むRT溶液で完全にチューブを埋める。 </li><li> 4分間460×gでチューブを遠心。 </li><li>上清を捨て、PBS中の5％FCSを含有するRT溶液100μlで細胞を懸濁します。 </li><li>離れて光から、渦それらを、各チューブに、FITC抗HLA-ABCの5μl加えて、室温で30分間、それらをインキュベートする。 </li><li> PBSで5％FCS、Aを含むで細胞を1回洗浄する一度PBSでのみND。 </li><li> RTで：1％のBSA、0.5mMのEDTA、PBS中10mMのHEPESを含む溶液で細胞を洗浄し、10分間インキュベートし、500μlの1％PFAを加える。 </li><li>上清を捨て、0.2％BSA、0.1％サポニン、0.5mMのEDTAおよび10mMのHepes（透過化緩衝液）を含むPBS溶液で完全にチューブを埋める。 </li><li>この培地中で細胞を2回洗浄する。 </li><li>培地を除去し、細胞ペレットを解離するためにそれらをボルテックスするチューブを裏返し。 </li><li> 、各チューブに抗P-ERMの抗体の100倍希釈渦にそれらを、室温で30分間インキュベート：0.25 / mlのTRITCファロイジンおよび/または1を追加します。 </li><li>透過化バッファーで細胞を洗浄。必要に応じて、蛍光二次抗体とインキュベートします。 </li><li> 200μlのPBSに細胞を再懸濁し、マイクロチューブに転送。 注：細胞を取得するための準備ができている。また、チューブあたり200μlの最大総量を維持しながら、最終的に1％に濃縮されたPFAを追加細胞は、さらなる処理のために同じ日に使用されるべきではない場合染色を保存するために集中。 </li></ol> 4.イメージの取得と分析<ol><li>装置のスイッチを入れ（ 特定の試薬​​/機器の表を参照）、それはメーカーの指示に従って、それ自体を校正しましょう。 NOTE：INSPIREソフトウェアは対物レンズ40倍（0.75 NA）で使用した。 IDEAS 3.0ソフトウェアは、報告されたすべての定量化のために使用された。 </li><li>将来の実験のためのテンプレートに保存することができます取得一連のウィンドウを準備します。 RMS勾配値を定量化ヒストグラムを描画します。 RMS勾配ヒストグラム上で選択し「フォーカスでは「集団から、エリアのヒストグラムの「単一セル」の人口をdelimitate。マイクロ遠心チューブが機械内に挿入された後、個々の細胞上にゲートをレーザーパワーを調整し、5000 Tリンパ球を取得する。 </li><li>アイデアでソフトウェアは、取得ファイルを開き、個々のセルに対して得られた明視野画像（チャンネル1）のための勾配RMS値の値が表示されたヒストグラムを作成します。 57より上のRMSの勾配値を示す細胞を考慮RMS勾配ヒストグラムにゲートを描きます。 注：RMS勾配分析において考慮焦点面内にある唯一のTリンパ球を取ることができる。我々は、57よりも優れたRMS勾配値を示す個々の細胞を焦点面にあり、正確に考慮することができることを実験的に決定している。 </li><li>解析/マスクは、メニューでは、2画素の侵食された明視野画像M01、上の形態学のマスクから（M01,2）を侵食すると呼ばれる、新しいマスクを作成します。その後、分析に/むしばむ（M01,2）マスク上の計算されたエリアの新機能を、作成し、メニューを用意しています。前のゲートに選択された細胞から、この新しく作成されたマスクを使用してセルの面積を示すヒストグラムを開きます。 注：によって利用可能な形態学マスクデフォルトでは、セルの実際のサイズよりもはるかに大きいです。これにより、2ピクセルにそれを侵食することがより正確である。 </li><li>キャリブレーションビーズや破片（小エリア）とダブレット（大面積）を除く、個々のT細胞上にゲートを描きます。各取得時にこのゲートを調整します。 注：セルサイズの変動は、ゲートの位置に影響を与える。マウスT細胞はCEM細胞より小さい自体、ヒトT細胞よりも小さいように、各細胞型の領域は、その大きさに比例する。 </li><li>前のステップでゲートしたシングル、焦点の合った細胞を考慮すると、ファロイジンでのRAWマックス·ピクセルの関数として、HLA-ABC染色に直接上限·ピクセルからなるドットプロット（チャネル2、X軸）を開く染色（チャンネル4、Y軸）。無染色または飽和蛍光イベントを除外するためにゲートを作成します。 HLA-ABC（チャネル2）とファロイジン（チャンネル4）染色のために直接上限画素を示すオー​​プンつのヒストグラム。 </li><li>解析/マスクメニュー、レコード生成で2画素の浸食HLA-ABC染色細胞（チャネル2）の形態のマスクから（M02,2）をむしばむと呼ばれるEA新しいマスク、、。その後、分析に/むしばむ（M02,2）で計算真円度パラメータからなる​​新しい機能を作成し、メニューを用意しています。 注：このパラメータは、円からの細胞形状の偏差を測定します。したがって、完全に丸いT細胞は、低円形度を示すことになる細長い極性細胞に対し高い真円度値を有する。 </li><li>その後、以前にゲート細胞から円形の特徴の値を報告します別のヒストグラムを作成します。個々のセルのための円形度の値に応じて合焦細胞集団、直接個々の分布をプロットするために、このヒストグラムを使用する。 </li><li>非刺激細胞のためにヒストグラムの形状を見ると、極性細胞のためにゲートを描き、非刺激細胞のほとんどの真円度の限界値まで最低の真円度の値で始まるプロットされている。ゲーテッド人口（％はゲートで囲われた）の間で偏細胞の割合の統計表示を見てください。 注：我々は、13以下の円形度指数値のため、このゲートを設定している。 </li><li>細胞内のアクチン染色の偏光を見るために、HLA-ABC染色（チャネル2）およびファロイジン染色を比較し、明るい詳細類似R3の値のヒストグラムをプロット（チャンネル4）。 注：この大きな特徴の値は、二以上の染色である重畳。 </li><li>前と同じゲート戦略を使用して、偏アクチン染色を有する細胞のパーセンテージを示す分離された染色のための非刺激細胞上にゲートをプロットする。 </li><li>完了すると、MHCクラスIおよびファロイジン染色、偏光された細胞の割合の分布に偏析を示す細胞のパーセンテージは平均±SD、全てのセルの真円度と類似度指標の平均値をcorrespに示されていると共にonding統計パネル。 </li></ol>

<ol><li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chemokines+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li>
<li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li>
<li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases%3A+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li>
<li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li>
<li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta%3A+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li>
<li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li>
<li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li>
<li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+T+cell+shape%2C+motility%2C+and+sensitivity+to+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409(2007).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。

イメージングフローサイトメトリーの最近の技術を使用して、ケモカイン刺激によって誘発される細胞および分子事象を分析するための迅速かつ有益なゲーティング戦略が提示されている。ケモカイン刺激及び分極プロセス中の異なるタンパク質の細胞内分布によって誘導される細胞形態の変化：単一の実験から、人は情報の2つの主要なタイプを得ることができる。興味深いことに、証拠は...

ケモカインは、特殊な場所1に細胞を引き付ける小さな可溶性タンパク質である。したがって、それらは、組織中の細胞の正確な位置決め、発達および生理学において重要な機能に関与する。それは効果的な免疫応答を協調して作用する多くの異なる細胞型の作用に依存して、免疫系は、この規則の例外ではない。外来抗原が検出され、中和され得る前に、所定の状態でつの免疫細胞型の特定の位置を制御することによって、ケモカインは、予め求められている。 特に、Tリンパ球において、ケモカインは、T細胞の運動2,3を支持し係合すると、多くの細胞内シグナルを誘発する、特異的な表面受容体（カルシウム上昇、ERKリン酸化のRho GTPアーゼ活性化、インテグリン親和性および細胞骨格の変化の増加）に結合する。細胞レベルでは、人は、ケモカイン刺激により誘発される形態学的変化を観察することができる。細胞形状の変化はT細胞に特に劇的である：血流中に移動するとき、休止T細胞は、ビーズ状の丸い形態を持っている。前方に前縁しかしながら、炎症部位において又はリンパ系器官の近傍でのケモカインの存在の検出は、現在のバイポーラ形からなる典型的な「ハンドミラー」形態を採用するT細胞の形状を変更しようとしているそしてバック4で立ち下がりエッジ、または腹肢、。また、細胞内成分は、マイグレーションを維持するために、偏T細胞のこれらの二つの対向領域に分離することができる。例えば、ケモカイン刺激5と重合アクチン時アクチンフィラメントの重合増加が偏T細胞2の前面に蓄積する。一方、皮質F-アクチン細胞骨格を血漿膜にリンクエズリン - ラジキシン、モエシン（ERM）ファミリーのリン酸化タンパク質のようないくつかのタンパク質は、偏光の腹肢に再局在化するT細胞を6。興味深いことに、本発明者らおよび他のこの分極処理は、T細胞の遊走に必要とされることを示した。確かに、偏光と干渉する任意の治療は、細胞の運動性を阻害します。例えば非定型プロテインキナーゼC（PKC）ファミリー、PKCζおよびPKCιブロックT細胞分極および樹状細胞7のそれらの遊走スキャン処理のメンバーの活性の阻害。 T細胞の分極ものRho GTPアーゼによって調節される。我々は、最近記載Fam65bタンパク質によるRhoAの活性の調節は、T細胞の形態の変化及びトランスウェルアッセイ6中を移動する能力を妨害することを示している。分極は、細胞の運動性の前提条件のステップであるとして、それはケモカイン応答の主要な読み出しとして定量化することができるようにすることが重要である。細胞形状の変化は、以前に手動8を測定した。しかし、定量化のこの種は、非常に時間のかかるであり、その通常は数そう細胞の数が考慮される。 ここでは、新たな方法を迅速にケモカイン刺激にさらされるTリンパ球の形状変化の度合いを定量化するために提示される。イメージングフローサイトメトリー技術（ 具体的な試薬/機器の表を参照）、フローサイトメーターの利点を組み合わせた、使用され、ケモカイン刺激の異なる条件で効率的に偏光した細胞の量を定量する顕微鏡9。一つは、この技術でロバスト測定できる形態変化の定量化に加えて、ケモカインシグナリングの際にいくつかのタンパク質の細胞内局在の変化を評価することも可能である。

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Human serum AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Human T cell nucleofactor kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8-100</td><td>This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC antibody</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>clone B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream&lt;sup&gt;x&lt;/sup&gt; Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid and robust analysis of cellular and molecular polarization induced by chemokine signaling

細胞は、偏光と呼ばれるプロセスで、かつ多くのタンパク質の細胞内局在を変化させることによって、彼らの丸い形状を失うことによる刺激ケモカインに応答します。古典的な画像化技術は、これらの現象を研究するために使用されてきた。しかしながら、それらは時間のかかる形態の定量化および細胞の数の染色の共局在続く多くの細胞の手動取得を必要とした。ここでは、迅速かつ強力な方法は、サイトメーターのものと顕微鏡の利点を組み合わせたイメージングフローサイトメトリー技術を用いて細胞数千からなるサンプルにこれらの現象を研究するために記載されている。 MHCクラスI分子および繊維状アクチンのためのCCL19及び染色で刺激したTリンパ球を使用して、ゲーティング戦略を同時に形状変化の程度及びCCL19シグナル伝達によって影響されるマーカーの共局在化の程度を測定するために提示されている。また、このゲーティング戦略はobservに私たちを許可E CXCL12刺激後の偏T細胞中で（フロントで）繊維状アクチンと（後方の）リン酸化されたエズリン - ラディキシンモエシン（リン酸化ERM）タンパク質の分離。 Par6 /非定型PKCシグナル伝達経路の変異体の薬理学的阻害剤と式でアクチン重合の阻害：この手法は、2つの異なる要素の偏光に遮断効果を観察することが有用であった。したがって、証拠は、この技術は、形態学的変化およびタンパク質の再分配の両方を分析するのに有用であることが示されている。

ここで選択された最初の例では、CCL19で刺激したヒト一次Tリンパ球の使用に関する。しかし、同じ戦略は、初代マウスT細胞、T細胞株またはケモカイン刺激に応答する任意の他の細胞型で使用することができる。ここで紹介するゲーティング戦略は集中イベント、単一のセルを選択一連のウィンドウが含まれています。 （ 図1）またはCCL19刺激された（ 図2）Tリンパ?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling at JoVE.com

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

ケモカインシグナリングにより誘導される細胞と分子分極の迅速かつ堅牢な分析

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

rapid-robust-analysis-cellular-molecular-polarization-induced

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell Polarization and Migration

SCIENTISTS IN ACTION

8.1K ビュー.  Institut Cochin. Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

ビデオ: Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

生化学

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

神経科学

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing to the transparent embryonic body of zebrafish, it is convenient for us to study the effect of one chemokine on the behavior of a certain type of cells in vivo. Here we provided a workflow to investigate the function of a chemokine on macrophage migration in vivo. We constructed a tissue-specific overexpression plasmid to overexpress IL-34 and injected the plasmid into one-cell stage transgenic fish embryos whose macrophages were specifically labeled by a fluorescent protein. We then used whole mount fluorescent in situ hybridization and immunostaining to detect the pattern of the chemokine expression and the number or location of macrophages. The injected WT embryos were raised to generate a stable transgenic line. Finally, we used confocal live imaging to directly observe macrophage behavior in the stable transgenic fish to study the function of IL-34 on macrophages in vivo.

To test the effect of a chemokine on macrophage recruitment in vivo, the whole mount in situ hybridization was used to detect the ectopic expression of the chemokine, and immunostaining was used to label macrophages. Live imaging was used for real-time observation of macrophage migration.

生体内でのマクロファージ募集をテストするための異所性ケモカイン発現モデル

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

発生生物学

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

免疫・感染学

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil migration and chemotaxis owing to their advantages in real-time visualization, precise control of chemical concentration gradient generation, and reduced reagent and sample consumption. Recently, a growing effort has been made by the microfluidic researchers toward developing integrated and easily operated microfluidic chemotaxis analysis systems, directly from whole blood. In this direction, the first all-on-chip method was developed for integrating the magnetic negative purification of neutrophils and the chemotaxis assay from small blood volume samples. This new method permits a rapid sample-to-result neutrophil chemotaxis test in 25 min. In this paper, we provide detailed construction, operation and data analysis method for this all-on-chip chemotaxis assay with a discussion on troubleshooting strategies, limitations and future directions. Representative results of the neutrophil chemotaxis assay testing a defined chemoattractant, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), and sputum from a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patient, using this all-on-chip method are shown. This method is applicable to many cell migration-related investigations and clinical applications.

This article provides the detailed method of performing a rapid neutrophil chemotaxis assay by integrating the on-chip neutrophil isolation from whole blood and the chemotaxis test on a single microfluidic chip.

血液滴からの迅速な好中球走化性解析のためのオールオンチップ法

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

生物工学

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

イメージングG -タンパク質共役受容体（GPCR）を介するシグナル伝達事象その制御走キイロタマホコリカビ</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

生物学

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...