ここで説明するプロトコルは、ケモカインの機能とin vivoでのマクロファージの挙動を調べることができます。細胞の細胞の既存の実験モデルのほとんどは、インビトロ細胞実験に基づいています。しかし、インビトロ実験は、時には複雑な環境をvivoでモデル化するには単純すぎることがあります。
また、生体内の化学引き上げ能力を表さない場合もある。これらの方法は、マウスにとって困難である直接細胞行動観察のためにシマウマ魚の特定の利点を利用する。TGFABP-10A インターロイキン-34 トランスジェニックコンストラクトを生成して開始します。.
FABP-10Aインターロイキン-34コンストラクトをトランスジェニックなTg(mpeg1:GFP)トランスジェニックおよび野生型魚の胚にトランスポザーゼMRNAと一緒に注入します。原稿の指示に従って胚を上げて収集します。その後、摂氏4度または室温で2時間一晩4%パラホルムアルデヒドでそれらを固定します。
固定後、PBSTで胚を洗浄ごとに5分間3回洗浄します。胚をPBSTで50%メタノールで別々に脱水し、続いて100%メタノールを脱水し、次いで新鮮な100%メタノールに変え、少なくとも2時間はマイナス20°Cで保存する。プローブハイブリダイゼーションの準備ができたら、胚をPBSTで50%メタノールで別々に再水和する。
その後、PBSTで1回5分間3回洗浄します。室温でPBSTでプロテアーゼKで胚を消化する。次いで、消化液を廃棄し、室温で20分間4%パラホルムアルデヒドで固定を繰り返した。
固定後、1回の洗浄で10分間PBSTで胚を2回洗浄します。65°Cの加熱ハイブリダイゼーションバッファを少なくとも1時間プリハイブリダイゼーションします。その後、インターロイキン-34プローブを摂氏65度に予熱し、10分間加熱します。
ハイブリダイゼーションバッファーを元のチューブにリサイクルし、予熱プローブを摂氏65度で一晩でハイブリダイゼーションを行います。翌日、胚を50%ホルムアミドと2X SSCTで洗い、続いて2倍のSSCTを、次に摂氏65度で0.2X SSCTを洗浄します。各洗浄を1回20分で3回繰り返します。
その後、1回の洗浄につき5分間PBSTで胚を3回洗浄する。室温で1時間のブロッキングバッファーの600ミリリットルでサンプルをブロックします。その後、抗ジゴキシゲニンHRP抗体溶液の400マイクロリットルを追加し、一晩摂氏4度で胚をインキュベートします。
翌日、抗体を取り除き、PBSTで6回、洗浄ごとに20分間洗浄します。最後の洗浄後、各サンプルを30マイクロリットルの1Xプラス増幅希釈液で5分間洗い流します。フルオロフォア・チラミンの働く溶液中のサンプルを暗闇の中で5~15分間インキュベートします。
信号が弱い場合はインキュベーション時間を30分に延長する。次いで、PBSTで1回10分間、胚を洗浄します。そして、一晩摂氏4度で一次抗体でそれらをインキュベートします。
翌日、PBSTで5回洗浄して1回30分間洗浄し、一晩摂氏4度で二次抗体でインキュベートする。翌日、PBSTで1回10分間胚を3回洗い、暗闇の中で摂氏4度またはマイナス20度のグリセロールに長く保管します。画像化の前に、蛍光顕微鏡を使用してDS赤およびGFPの二重陽性胚を選択してください。
魚を取り付けるには、金属浴を使用して1%低融解アガロースの1ミリリットルを摂氏90度以上に加熱します。その後、体温に冷却し、0.2%トリケーヌの50マイクロリットルで混合します。麻酔した胚を底面にカバースライド付きの小皿に移します。
周囲の水を取り除き、ゆっくりと胚に低融解アガロースを落とします。アガロースが固まる前に魚の位置を慎重に設定し、肝臓領域をカバースライドの近くに保ちます。アガロースが固まったら、それを補強するためにアガロースの別の層で慎重に覆います。
コンフォーカル顕微鏡キャリアテーブルに皿を置き、トリカインでE2溶液で魚を覆い、イメージングを開始します。共焦点顕微鏡を操作するには、Zen Black 2.3ソフトウェアを開いて[位置指定]をクリックし、インキュベーションを行い、温度を摂氏29度に設定します。取得メニューをクリックし、スマートセットアップメニューで必要なスキャンモードとレーザーを選択します。
次に、Z スタックと位置を選択します。実験用デザイナーメニューをクリックし、最初のブロックでマルチブロック実験を有効にして、低倍率でサンプルを見つけます。次に、高倍率に切り替え、視野の中央に観察領域を入れましょう。
位置とZスタック情報を設定します。次に、適切なレーザー強度、走査層、および撮像速度を選択します。すべてのブロックが設定されたら、適切なループ数を設定し、記録を開始します。
このプロトコルは、GFPで標識されたマクロファージであるトランスジェニック魚の胚に発現プラスミドを介して肝臓特異的インターロイキン-34を注入するために使用された。フルマウント蛍光をその蛍光ハイブリダイゼーションおよび免疫染色で使用し、インターロイキン-34およびGFP標識マクロファージの発現を解析した。マクロファージ細胞数を未注入で定量的に分析し、注入された胚の肝臓および尾領域を構築した。
ライブイメージングは、緑色とラベル付けされたマクロファージを直接観察し、対照魚の肝臓を通過し、魚を発現する上でインターロイキン-34の肝臓に移行するために使用されました。このプロトコルの重要なステップは、関心のある細胞にラベルを付けるために適切なトランスジェニックラインの選択を含む。そして、トランスジェニック遺伝子の発現を画像化するための適切な組織と同様、適切な観察時間枠。
この技術は、生体内のT細胞および好中球のような他の細胞の挙動に関する他のケモカインの機能を研究するために適用することができる。
