המחברים מודים מאוד פייר Bourdoncle, תומאס גילבר ולואיז Rimbault של מתקן קוצ&#39;ין ההדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, CNRS וליגת העל לאומי contre le הסרטן (labellisée Equipe).

1. הכנת T לימפוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עכבר ראשוני או תאי T אנושיים כפי שתואר 10,11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח תאי T אנושיים במדיום RPMI להשלים עם 10% בסרום אנושי AB בצפיפות של 2 - 3 x 10 6 תאים / מיליליטר. הערה: השימוש בסרום עוברי עגל (FCS) במקום סרום אנושי יכול לעורר קיטוב ספונטני של חלק גדול של תאי T אנושיים בתרבות. שמור את התאים הללו בתרבות ל4-5 ימים ועוד תהליך אותם בכל עת במהלך תקופה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי T העכבר במדיום RPMI מלא בתוספת 10% FCS בצפיפות תאים דומה. להשתמש מייד או ביום שלמחרת, לאחר O / תרבות N על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 10 ng / ml IL7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח את קו התא האנושי CEM T בRPMI המלא בתוספת 10% FCS. </li></ol> 2. chemokine גירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 x 10 5 תאים לכל תנאי ניסוי במדיום HBSS חם בתוספת 10 מ&quot;מ Hepes. עבור חלק מניסויים, שיתוף transfect התאים T אנושי ראשוני היום קודם לכן עם 2 מיקרוגרם pmaxGFP ו8 מיקרוגרם pcDNA3.1 + (וקטור ריק, שליטה), kinase PKCζ המת, או פלסמידים Par6 N-terminal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה במדיום HBSS-Hepes חם (0.3 להשתמש מספר x מיליליטר של תנאי ניסוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ את התאים בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge. הערה: לכן, צינור אחד המתאים לתנאי ניסוי יחידים יכיל 5 x 10 5 תאים ב0.3 מיליליטר בינוני HBSS-Hepes. עבור חלק מניסויים, להוסיף 500 ננומטר Latrunculin או רכב (DMSO) ודגירת התאים למשך 30 דקות לפני גירוי chemokine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 עד 500 ng / ml CCL19 או chemokine CXCL12 בצינור אחד. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל 10-200 מיליליטר chemokine / ng לתאי T אנושיים. תאי CEM אינם מבטאים את הקולטן CCR7 שנקשר CCL19. לכן, תאי CEM רק להיות מסוגלים להגיב לגירוי CXCL12. יתר על כן, שימוש בריכוזים גבוהים יותר chemokine (300-500 ng / ml) לקטב תאי T העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הצינורות כמה פעמים דגירה אותם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 8 או 10 דקות לתאי T ראשוניים או CEM, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את תהליך הקיטוב על ידי הוספה על צינור אחד 0.3 מיליליטר של פתרון חם המכיל paraformaldehyde 2% (PFA) ו -10 מ&quot;מ Hepes בPBS. הפוך את צינורות דגירה אותם על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li></ol> 3. Stainings <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים מצינורות microcentrifuge לזרום cytometry צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא את הצינורות לחלוטין עם פתרון RT המכיל 1% אלבומין בסרום שור (BSA), 0.5 mM EDTA ו -10 מ&quot;מ Hepes בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה הצינורות ב 460 XG למשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant וresuspend התאים של פתרון RT המכיל 5% FCS בPBS 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של FITC-אנטי-HLA-ABC בצינור אחד, מערבולתם, דגירה אותם במשך 30 דקות ב RT, הרחק מאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעם עם PBS המכיל 5% FCS,פעם אחת עם PBS רק ND. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב RT: להוסיף 500 μl 1% PFA, דגירה של 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף תאים עם תמיסה המכילה 1% BSA, 0.5 mM EDTA ו -10 מ&quot;מ HEPES בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, למלא את הצינורות לחלוטין עם פתרון של PBS המכיל BSA 0.2%, saponin 0.1%, 0.5 mM EDTA ו -10 מ&quot;מ Hepes (חיץ permeabilization). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תאים פעמיים במדיום זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הצינורות כדי להסיר בינוני ומערבולתם לנתק את התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.25 מיקרוגרם / מיליליטר TRITC-Phalloidin ו / או 1: של נוגדן אנטי-P-100 ERM דילול על צינור אחד, מערבולתם דגירה במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם חיץ permeabilization. דגירה עם נוגדנים משני ניאון במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 200 μl PBS ולהעביר אותם לצינורות microcentrifuge. הערה: תאים מוכנים לרכישה. לחלופין, תוך שמירה על נפח כולל מרבי של 200 μl לכל צינור, להוסיף PFA המרוכז ל% 1 סופייםריכוז על מנת לשמר את stainings אם לא כדי לשמש התאים באותו היום לעיבוד נוסף. </li></ol> 4. תמונות רכישה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המכשיר (ראה טבלה של חומרים כימיים / ציוד ספציפי) ולתת לו לכייל את עצמו בהתאם להוראות היצרן. הערה: תוכנת INSPIRE שימשה עם מטרת 40X (0.75 NA). תוכנת 3.0 הרעיונות שימשה לכל quantifications דיווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרה של חלונות רכישתו ניתן לשמור בתבנית לניסויים עתידיים. לצייר היסטוגרמות שלכמת את ערכי שיפוע RMS. מאוכלוסיית &quot;בפוקוס&quot;, שנבחרה על RMS היסטוגרמה שיפוע, delimitate האוכלוסייה &quot;תא יחיד&quot; על היסטוגרמה של האזור. ברגע שצינור microcentrifuge הוכנס במכונה, להתאים את כוח הלייזר, שער על תאים בודדים ולרכוש 5,000 T לימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברעיונות רכיםכלי, לפתוח את קובץ הרכישה וליצור היסטוגרמה שתציג את הערך של ערך RMS שיפוע לתמונות בשדה בהיר (ערוץ 1) התקבלה לכל תא בודד. צייר שער על ההיסטוגרמה שיפוע RMS שרואה תאים מציגים RMS ערך שיפוע מעל 57. הערה: צבע RMS מאפשר לקחת בחשבון בניתוח רק לימפוציטים מסוג T הנמצאים במישור המוקד. יש לנו לקבוע באופן אמפירי שתאים בודדים המציגים ערך שיפוע RMS עדיף על 57 הם במישור המוקד, ויכולים להיחשב באופן מדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניתוח / תפריט מסכות, ליצור מסכה חדשה, שנקרא Erode (M01,2) ממסכת המורפולוגיה על תמונות brightfield M01, נשחקו של 2 פיקסלים. לאחר מכן, בניתוח / תכונות תפריט, ליצור תכונה חדשה של האזור, המחושב על מסכת Erode (M01,2). מהתאים שנבחרו בשער הקודם, לפתוח ההיסטוגרמה מראה את השטח של תאים באמצעות מסכה חדשה שנוצרה זה. מסכות המורפולוגיה זמינות על ידי: הערהברירת מחדל הוא הרבה יותר גדולה מהגודל האמיתי של התא. לכן, זה יותר מדויק לשחוק אותו עד 2 פיקסלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר שער על תאי T הבודדים, לא כולל את חרוזי הכיול ופסולת (פינת קטנה) והכפילויות (שטח גדול). התאם את השער הזה בכל רכישה. הערה: וריאציות בגודל תא תשפיע על מעמדו של השער. ככל שתאי T העכבר קטנים יותר תאי T אנושיים שהם עצמם קטנים יותר מאשר תאי CEM, השטח של כל אחד מסוגי תאים יהיה יחסית לגודלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתחשב בתאים בודדים, בפוקוס שהיו סגור בשלבים הקודמים, לפתוח עלילת נקודה בהיקף של Raw מקס Pixel על הכתמת HLA-ABC (ערוץ 2, ציר x) כפונקציה של Raw מקס Pixel על phalloidin הכתמה (ערוץ 4, ציר y). צור שער שלא לכלול את אירועי ניאון בלא כתם או רוויים. שתי היסטוגרמות פתוחות המציגות את Raw מקס Pixel לHLA-ABC (ערוץ 2) וphalloidin (ערוץ 4) stainings. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניתוח / תפריט מסכות, creatמסכת ea חדשה, הנקראת Erode (M02,2) ממסכת המורפולוגיה של התאים HLA-ABC המוכתם (ערוץ 2), נשחקו של 2 פיקסלים. לאחר מכן, בניתוח / תכונות תפריט, ליצור תכונה חדשה הכוללת את הפרמטר המעגלי, המחושבת על Erode (M02,2). הערה: פרמטר זה מודד את הסטייה של צורת התא ממעגל. לכן, תא T עגול ומושלם יהיה ערך מעגלי גבוה ואילו תאים מקוטבים מוארכים יציג מדד מעגלי נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוצאה מכך, ליצור היסטוגרמה אחרת שתדווח על הערכים של התכונה המעגליות מהתאים מגודר בעבר. השתמש היסטוגרמה זו עלילה ישירות ההפצה של פרט, אוכלוסיית תאים בפוקוס על פי השווי של המעגליות לכל תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מסתכלים על צורת ההיסטוגרמה עבור תאים-מגורה עישון, לצייר שער לתאים מקוטבים, החל משעת הערך המעגלי הנמוך ביותר עד לגובה שווי הגבול המעגלי שבו רוב תאי מגורה שאינוהם זממו. תראו את תצוגת הנתונים הסטטיסטיים עבור אחוז התאים מקוטבים בקרב האוכלוסייה הנשלטת (% מגודרים). הערה: יש לנו קבוצת השער הזה לערכי מדד מעגליים להלן 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסתכל על הקיטוב של ההכתמה אקטין בתאים, העלילה היסטוגרמה לערך הדמיון R3 פרט מואר, השוואת צביעת HLA-ABC (ערוץ 2) ומכתים phalloidin (ערוץ 4). הערה: גדולה יותר את הערך של תכונה זו, יותר גבי שני stainings הן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באותה האסטרטגיה gating כמו קודם, עלילה שער על תאי מגורה שאינו לצביעה הנפרדת המציגה את אחוז התאים עם כתמים אקטין מקוטבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר יושלם, אחוז התאים מציג הפרדה בחלוקת MHC Class I וstainings phalloidin, אחוז התאים מקוטבים יחד עם הערכים הממוצעים של המדדים מעגליים ודמיון של כל התאים ± SD מוצג בcorrespלוחות סטטיסטיקת onding. </li></ol>

<ol>
	<li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+chemokines+and+their+receptors.">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li><li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance.">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li><li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation.">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li><li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions.">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li><li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta:+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells.">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li><li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration.">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li><li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior.">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li><li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+T+cell+shape,+motility,+and+sensitivity+to+antigen.">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li><li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageStream+System:+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging.">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409 (2007).</li><li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen+specific+CD4++T+cells+using+MHC+class+II+tetramers.">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+phosphorylation:+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells.">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li><li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes.">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

באמצעות טכנולוגיה האחרונה של זרימת ההדמיה cytometry, אסטרטגית gating מהירה ואינפורמטיבי לנתח אירועים תאיים ומולקולריים הנגרמים על ידי גירוי chemokine מוצג. מניסוי בודד, ניתן לקבל שני סוגים עיקריים של מידע: השינויים במורפולוגיה של תאים הנגרמים על ידי גירוי chemokine והפצת subcellular של ?...

כמוקינים הם חלבונים מסיסים קטנים שמושכים תאים למקומות מיוחדים 1. לכן, הם משתתפים במיקום הנכון של תאים ברקמות, תפקיד מכריע בפיתוח ופיזיולוגיה. המערכת החיסונית היא לא יוצאת מכלל זה כפי שהוא מסתמך על הפעולה של סוגי תאים שונים הפועלים בתיאום לעלות תגובה חיסונית יעילה. על ידי שליטה על המיקום הספציפי של סוג תא חיסון אחד במצב נתון, כמוקינים הם-נדרש מראש לפני שניתן להבחין אנטיגנים זרים ונטרלו. בלימפוציטים מסוג T בפרט, כמוקינים להיקשר לקולטנים ספציפיים משטח ש, על אירוסין, לעורר רבים אותות תאיים (עליית סידן, זירחון ERK, הפעלת GTPases Rho, עלייה בשינויי זיקת integrins וcytoskeletal) שמעדיפים תנועתיות תאי T 2,3. ברמה התאית, ניתן לראות שינויים מורפולוגיים שהושרו על גירוי chemokine.שינויים אלה בצורות תא הם דרמטיים במיוחד בתאי T: יש לי תאי T נחים מורפולוגיה עגולה כמו חרוז-בעת נסיעה בזרם הדם. עם זאת, החישה של הנוכחות של כמוקינים באתרים דלקתיים או בקרבתו של איברי הלימפה הולכת לשנות את הצורה של תאי T אשר כעת לאמץ מורפולוגיה טיפוסית &quot;יד-ראי&quot; בהיקף של צורה דו-קוטבית: קצה מוביל בחזית ונגרר לקצה, או uropod, בחלק האחורי 4. בנוסף, רכיבים תאיים יכולים להפריד לשני אזורים מנוגדים אלו של תאי T מקוטבים כדי לקיים הגירה. לדוגמא, עליית פילמור הסיבי אקטין על גירוי chemokine 5 ויקטין polymerized מצטברת בחלק הקדמי של תא T מקוטב 2. מצד השני, כמה חלבונים, כגון חלבוני phosphorylated של משפחת Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) המקשרת את קרום הפלזמה לשלד תא F- אקטין קליפת המוח, מחדש בתרגום בuropod של מקוטבתאי T 6. מעניין, אנחנו ואחרים הראינו שנדרש תהליך קיטוב זה לנדידת תאי T. ואכן, כל טיפול שמפריע לקיטוב ימנע תנועתיות סלולרית. לדוגמא, עיכוב של הפעילות של החברים של החלבון טיפוסי קינאז C (PKC) משפחה, קיטוב תא לוקי PKCζ וPKCι T ותהליך סריקת הנדידה שלהם של תאים דנדריטים 7. קיטוב תא T גם מוסדר על ידי Rho GTPases. הראינו כי האפנון של פעילות RhoA על ידי חלבון Fam65b תאר לאחרונה מפריע T שינויי תא במורפולוגיה והיכולת שלהם להעביר בassay Transwell 6. כקיטוב הוא צעד תנאי מוקדם לתנועתיות סלולרית, זה קריטי ובכך להיות מסוגל לכמת את זה כקריאה העיקרית של תגובות chemokine. שינויי צורת תא נמדדו בעבר באופן ידני 8. עם זאת, בכימות סוג זה הוא זמן רב מאוד, כך שבדרך כלל רק כמהעשרות תאים נלקחים בחשבון. כאן, שיטה חדשה מוצגת לכמת את מידת שינויי צורה של לימפוציטים מסוג T נחשף לchemokine גירוי במהירות. זרימת הדמיה cytometry הטכנולוגיה (ראה טבלה של חומרים כימיים / ציוד ספציפי) משמש, המשלב את היתרונות של cytometer זרימה ומיקרוסקופ 9 לכמת ביעילות את כמות תאים מקוטבים בתנאים שונים של גירוי chemokine. בנוסף לכימות של השינויים מורפולוגיים שאפשר למדוד וחסונה עם הטכנולוגיה הזו, אפשר גם להעריך שינויים בלוקליזציה subcellular של חלבונים מסוימים על איתות chemokine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="569">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">Name of the material/Equipment</td>
			<td style="width:95px;">Company</td>
			<td style="width:80px;">Catalog number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">RPMI</td>
			<td style="width:95px;">Gibco</td>
			<td style="width:80px;">61870-010</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:140px;">Human serum AB</td>
			<td style="width:95px;">PAA</td>
			<td style="width:80px;">C11-021</td>
			<td style="width:255px;">Pre-heat to inactivate the complement.</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:140px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:95px;">PAN Biotech</td>
			<td style="width:80px;">P30-3300</td>
			<td style="width:255px;">Pre-heat to inactivate the complement.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:140px;">Human T cell nucleofactor kit</td>
			<td style="width:95px;">Lonza</td>
			<td style="width:80px;">VCA-1002</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Murine IL7</td>
			<td style="width:95px;">Peprotech</td>
			<td style="width:80px;">217-17</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:140px;">HBSS</td>
			<td style="width:95px;">Gibco</td>
			<td style="width:80px;">14025-050</td>
			<td style="width:255px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Hepes</td>
			<td style="width:95px;">Gibco</td>
			<td style="width:80px;">15630-056</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:140px;">Murine CCL19</td>
			<td style="width:95px;">Peprotech</td>
			<td style="width:80px;">250-27B</td>
			<td style="width:255px;">Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:140px;">Human CCL19</td>
			<td style="width:95px;">Peprotech</td>
			<td style="width:80px;">300-29B</td>
			<td style="width:255px;">Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:140px;">Human CXCL12</td>
			<td style="width:95px;">Peprotech</td>
			<td style="width:80px;">300-28A</td>
			<td style="width:255px;">Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:140px;">PFA</td>
			<td style="width:95px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:80px;">157-8-100</td>
			<td style="width:255px;">This is a 8 % PFA solution in water. Mix volume to volume with 2X PBS to obtain a 4 % PFA solution in PBS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">&#160;BSA</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td style="width:80px;">A3059</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Saponin</td>
			<td style="width:95px;">Fluka</td>
			<td style="width:80px;">84510</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:140px;">Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td style="width:95px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">A12381</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:140px;">FITC-anti-HLA-ABC antibody</td>
			<td style="width:95px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:80px;">IM1838</td>
			<td style="width:255px;">clone B9.12.1</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:140px;">Anti-P-ERM antibody</td>
			<td style="width:95px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:80px;">3149P</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:140px;">ImageStreamx Mark II</td>
			<td style="width:95px;">Amnis</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and robust analysis of cellular and molecular polarization induced by chemokine signaling

תאים מגיבים לגירוי chemokine ידי לאבד הצורה העגולה שלהם בתהליך הנקרא קיטוב, ועל ידי שינוי לוקליזציה subcellular של חלבונים רבים. טכניקות הדמיה קלאסית שימשו לחקר תופעות אלה. עם זאת, הם נדרשים הרכישה הידנית של תאים רבים ואחריו כימות של המורפולוגיה ושיתוף הלוקליזציה של ההכתמה של עשרות תאים זמן רב. כאן, שיטה מהירה וחזקה מתוארת ללמוד תופעות אלה על דגימות מורכבות מכמה אלפי תאים באמצעות זרימת הדמיה cytometry טכנולוגיה המשלבת את היתרונות של מיקרוסקופ עם אלה של cytometer. באמצעות לימפוציטים מסוג T מגורה עם CCL19 וצביעה למולקולות MHC Class I ויקטין פילמנטיות, אסטרטגית gating מוצגת למדוד בו זמנית מידת שינויי צורה והמידה של שיתוף לוקליזציה של סמנים שמושפעים מאיתות CCL19. יתר על כן, אסטרטגית gating זה אפשרה לנו observדואר ההפרדה אקטין פילמנטיות (בחזית) וEzrin-Radixin-Moesin פוספורילציה (phospho-ERM) החלבונים (בחלק האחורי) בתאי T מקוטבים לאחר גירוי CXCL12. טכניקה זו הייתה שימושית גם כדי לבחון את השפעת החסימה על קיטוב של שני אלמנטים שונים: עיכוב של פילמור אקטין ידי מעכב וביטוי תרופתי של מוטציות של / מסלול PKC איתות לא טיפוסי Par6. לפיכך, ראיות הראו כי טכניקה זו שימושית כדי לנתח את שני שינויים מורפולוגיים והפצה מחדש חלבון.

הדוגמא הראשונה שנבחרה כאן נוגעת לשימוש בלימפוציטים מסוג T האנושי העיקרי מגורה עם CCL19. עם זאת, באותה האסטרטגיה ניתן להשתמש בתאי עכבר העיקרי T, שורות תאי T או כל סוג תא אחר מגיב לגירוי chemokine. אסטרטגית gating מוצגת כאן כוללת סדרה של חלונות שבחר את האירועים ממוקדים, אז תאים בודד...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling at JoVE.com

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

ניתוח מהיר וחזק של תאי ומולקולרי קיטוב המושרה על ידי chemokine איתות

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

rapid-robust-analysis-cellular-molecular-polarization-induced

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell Polarization and Migration

SCIENTISTS IN ACTION

8.0K Views.  Institut Cochin. Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Video: Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

Visualisation וכימות של אינטראקציות תאיים של Neisseria meningitidis ואת האדם α-actinin על ידי הדמיה confocal

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

השימוש זרימה טפטוף ו כורים דיסק סיבוב עבור Staphylococcus aureus Biofilm ניתוח

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

פליטת אור סידן Assay עבור ניתוח פונקציונלי של יתוש ( Aedes aegypti) ו טיק ( Rhipicephalus microplus) G-חלבון בשילוב רצפטורים

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי<em&gt; Histolytica Entamoeba</em&gt; זיהום

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

איתור מולקולרית ראפיד והבחנה א נגיפי שפעת A ו- B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

ויבתר חלבון רב מתחמי איתות על ידי טיהור זיקה קומפלמנטציה ריאקציה דו-מולקולרית (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is characterized by lethal complications due to plasma leakage, ascites, pleural effusion, respiratory distress, severe bleeding, and organ impairment. A few cases of DENV infection present neurological manifestations; however, studies have not explored DENV-induced neuropathogenesis further. In this study, we present a protocol to use an immunocompetent outbred ICR (Institute of Cancer Research) mouse for investigating the induction of central nervous system (CNS) infection with DENV, followed by the progression of acute viral encephalitis-like disease.

Here, we present a protocol for creating an immunocompetent ICR (Institute of Cancer Research) murine model of central nervous system infection to display the development of neuropathy. Monitoring acute viral encephalitic disorders by identical disease scores could be performed for showing dengue virus-induced neuropathy in vivo.