The Authors acknowledge the economic support by FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), &#8220;Neurogel-en-Marche&#8221; Foundation (France), Fondazione &#8220;La Colonna&#8221;.

注：すべての手順は、ミラノ大学の審査委員会によって承認されたと1986年11月（609分の86 / EEC）日付の欧州共同体指令に準拠して実験動物のためのイタリア語のガイドラインに会った。 移植用の細胞の調製注：第5回とこれらの実験のために、培養中の第9回継代の間に使用した神経幹細胞;移植のために標識される前に、増殖および分化能力のための文化をテストします。 12を免疫細胞化学によって分化の程度を決定します。 <ol><li> 1×10 6細胞/150μlの（移植マウスあたり1×10 6細胞）の濃度に再懸濁細胞。細胞の過剰が注射器のロードのために必要とされるので、マウス当たり少なくとも1.2×10 6細胞を準備します。 </li><li> 10ミリリットルコニカルバイアル中の細胞を神経幹細胞培地13を用いて3回洗浄する。それぞれにおいて洗浄工程、遠心分離により沈殿物を細胞（500×gで5分間、RT）。 </li><li>最後のスピンの前に細胞を数える。 </li><li>細胞（5分間500×gで）を遠心分離し、その後、すべての細胞を除去しないように注意しながらしかし上清のせいぜい25μLを残し、上清を吸引除去する。 </li><li>穏やかにピペッティングして細胞ペレットを再懸濁に希釈Cの1ミリリットルを追加することによって、2倍の細胞懸濁液を準備します。 </li><li>チューブ中の希釈剤Cの1ミリリットルにPKH26エタノール色素溶液4μlのを追加することによって、希釈Cで- （6 M 4×10）と分散させるためによく混ぜ、すぐに染色する前に、2X色素溶液を調製する。 </li><li>急速に2X色素溶液1mlに2倍の細胞懸濁液の1ミリリットルを追加して、すぐに（最終細胞密度が1.2×10 7細胞/ mlおよび2×10になります- 6 M PKH26）ペッティングしてサンプルを混ぜる。 </li><li> 1-5分間細胞/色素サスペンションをインキュベートする。 </li><li> 2（等量のを追加することによって、染色を停止しますml）のHBSS中の1％BSA溶液で1分間インキュベートする。 </li><li>遠心細胞（500×gで10分間）し、上清を注意深く取り除く。 </li><li> HBSSと遠心（5分間500×gで）の10ミリリットルで再懸濁細胞ペレット。 </li><li>未結合の色素の除去を確実にするために完全培地10mlで細胞ペレットを2回洗浄する。 </li><li>細胞の回収、細胞の生存率及び蛍光強度の評価のための完全培地10ml中で細胞ペレットを再懸濁する。細胞は移植のために必要な場合は、洗って、3.3×10 5細胞/ 50μlの濃度で、滅菌生理溶液で再懸濁します。 </li></ol>外科2.準備<ol><li>清潔手術機器を殺菌。 </li><li>無菌エージェントで拭いて手術領域を用意。 IHインパクターデバイスを設定します。 </li><li>デバイス、連続フロー誘導商工計量VetScavフィルタ付き活性ガスのスカベンジャー、酸素ジーン：麻酔機器を準備マウス用rator、低流量O 2メーター。誘導室と手術中に使用されるマスクを清掃してください。 </li><li> 2.5％酸素中の（v / v）のイソフルラン（1L /分）で動物を麻酔し、有効にする薬剤のためのフロー誘導後5分待ってください。ウィスカーがけいれんしているかどうかを確認してくださいまたはフットパッドをつまんに応じて、ゆっくり後肢撤退がある場合。手術中に、2.0％の酸素（v / v）をイソフルラン（1 L /分）にイソフルラン濃度を低下させる。 </li></ol>手術や移植のためのマウスの調製<ol><li>標準的な条件での実験（22±2℃、湿度65％、および午前8時午後8時から午前人工光）の前に少なくとも3日間のオスの成体CD1マウス（25-30 g）を保管してください。 注：外科準備から縫合までの全手順は、約40分かかります。 <ol><li>動物を特定するには、耐水性カラーインクを用いて尾をマーク。 </li></ol></li><li>電動式を使用してくださいでICクリッパーは、腰部領域に、約T2レベルで、首からのマウスの背部の毛をカットする。 </li><li>ヨウ化物水溶液とエタノール（滅菌水中70％）を調製した領域を滅菌する。 </li><li> 200μlのゲンタマイシン（滅菌生理食塩液中1 mg / ml）でのサブ皮膚の皮下（sc）注射で動物を治療する。 </li><li>ブプレノルフィンの乾燥を防止し、注入するために、両方の動物の眼に眼科用潤滑剤を塗布（皮下、0.03ミリグラム/ kg）は、痛みを軽減する。 </li></ol> 4.椎弓切除<ol><li>手術中に低体温症の問題を回避するために、暖かいスライド上にマウスを置きます。背側を上にして動物を置きます。 </li><li> T7からT12に、関心領域にわたって、メスとの縦の切開を行います。 </li><li> （通常は胸部背側のプロセス番目の 5 番目と6の間のスペースにあります）標準鉗子を使用して皮膚や表在性の脂肪パッドを持ちます。 </li><li> T6として容器の下にプロセスを数えるその後T7に移動。 </li><li>背骨の湾曲を高めるために、マウスの腹側の下に少しのベアリングを配置します。グレーフェ鉗子でそれをブロックすることにより、脊髄を固定する。 </li><li>ラミナの連絡先メス先端の背側表面までメスを使用してT7およびT10椎骨レベルから両側性脊椎傍の筋肉をカットします。 </li><li> T7からT10まで接合をオフにチェックするためにメスを使用してください。 T8とT9とげの突起との間の空間に停止します。マイクロハサミでT8-T9とT9-T10の間に組織をカット。 <ol><li> T9プロセスを削除するには骨鉗子を使用してください。慎重にマイクロはさみで筋肉層を削り取ることで接合を公開します。骨が露出するまで続けます。 </li></ol></li><li>ラミナから筋肉を削除し、椎骨間の小さなスペースを開くために鉗子を使用してください。静かに、骨の下にマイクロはさみを入れ両側のラミナをカットし、ピンセットでこの部分を削除する。 </li><li> fにラミナを削除コー​​ドを公開するorceps。背後にある任意のフリーまたはぎざぎざの骨片を残すしないように注意してください。骨鉗子でそれらを削除する。 </li><li>切開に近いかもしれ骨膜および任意の骨片や筋肉を削除するには、小さな先端鉗子を使用してください。 </li><li> T9の背側プロセスの上半分を取り外し、IHインパクターデバイスプロトコルに進みます。 </li></ol> 5. IHインパクデバイスプロトコル（挫傷） <ol><li> IHインパクデバイスの安定化プラットフォームの中央にマウスを置きます。 </li><li> 2関節の位置決めアーム（胸椎ための左腕、頸椎用右腕）によって安定化プラットフォームに接続された二つの歯鉗子で動物をブロックします。 </li><li>吻側椎体（T8）の側縁を把握する吻側アームを使用してください。 </li><li> T10椎体を把握するために同じように尾側アームを操作します。 </li><li>装置内に安定化プラットフォームを置き、チップを下げる（直径0.75mm）とそれに触れることなく、可能な限りコードに近い。 </li><li>影響を開始する前に、先端を3回の完全な回転を持ち上げます。 </li><li> 100mm /秒で60 kdynの力を提供するように設定インパクとの挫傷を実行します。 </li></ol> 6.縫合糸およびポスト·介護<ol><li> 4/0吸収性縫合糸で切開を縫合。削除ラミナのサイトで露出脊髄をカバー。小さな針によってカットの先端で組織を縫合。すぐ上および脊髄露出のサイトの下に2針を入れてください。 </li><li>根本的な筋肉をピンチオフすることなく、2または3フレックスクリップを使用して皮膚を閉じます。 </li><li>腰に注射生理食塩水を皮下2mlのマウス術後を水和。 </li><li>外科リカバリ中に低体温症を避けるために、バック予め温めケージにマウスを置きます。加熱パッド上のケージを置きます。 </li><li>チェックすることにより、急性期後の傷害中にマウスを監視サイズ膀胱、縫合糸と動物の体重一日二回。優しく（流血、曇りまたは沈殿物を含む可能性が尿）尿路の感染症を避けるために、膀胱（7日間1日2回）絞る。 </li><li>損傷後5日間、食塩水注入（2日間2ミリリットル術後皮下注射）と抗生物質（皮下注射ゲンタマイシン0.2ミリリットル）で一日一回のマウスを扱う。 </li><li>ブプレノルフィンと術後鎮痛のためのマウストリート（0.1 mg / kgをし、一日二回）3日間のけがを投稿してください。 </li></ol>細胞の7尾静脈注射注：以下のステップで尾静脈に細胞を注入するための手順が示されている。細胞はまた、定位フレーム15〜16を使用することにより脊髄内移植を投与し、または大槽17にすることができた。このような間葉系間質細胞のような他の細胞型は、この方法で移植することができることを考慮することが重要である（ 例えば 、骨髄間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、羊水細胞）。さらに、ナノ粒子のような他の治療の選択肢は、脊髄損傷後の尾静脈を介して注入することができる。 <ol><li>使用前に針をきれいにする70％エタノールとPBSを使用してください。唯一の滅菌手袋と針と注射器を扱う。 </li><li> 0.3ミリリットルのシリンジ（29 G針と0.33 1ccシリンジ）への細胞の試験管と負荷75μLで細胞を懸濁します。 </li><li>気泡が細胞懸濁液中に存在していないことを確認してください。細胞沈殿を避けるために水平位置に注射器を保管してください。 </li><li>尾静脈を拡張する加熱ランプの下にマウスを置きます。 </li><li>マウスをつかみ、そっと細い青線で外側尾静脈を視覚化するために、マウスレストレーナーにそれを引っ張る。 </li><li>アルコール綿で尾を清掃してください。静脈が可視化されると、左手の中指と親指の間に尾静脈をつかむ。 </li><li>水平線から15°の角度で表面に針を持参し、ベベルがアップしていることを確認してください。 </li><li> 0.33μL/秒の速度で細胞50μlを注入。注入後、10秒ずつ針の後退を遅らせる。ゆっくりと針を撤回し、細胞懸濁液の可能流出に注意を払う。 </li><li>負荷の間のステップ7.1のように注射器を清掃してください。 </li></ol> 8.行動試験と後肢機能<ol><li>オープンフィールドでマウスを置きます。 </li><li>バッソマウスのスケール（BMS）18に従って運動機能とオープンフィールド試験で挫傷後の後肢の回復を評価します。 注：神経機能は、4週間18のために、損傷後3日目から、定期的に評価されなければならない。 </li></ol> 9.灌流<ol><li>実験期間の終了時に、ペントバルビタールナトリウム（65ミリグラム/ kg）を腹腔内注射により動物を麻酔。つの評価するためにつま先ピンチを使用して、E麻酔レベルは、マウスが侵害刺激に反応した後にのみ進むと。 </li><li>手術平面上仰臥位で動物を拘束。 </li><li>ちょうど胸郭の下に外皮と腹壁を通してカット。肝臓からダイアフラムを区切ります。 </li><li>胸膜腔を露出させるために、振動板をカットするはさみを使用してください。 </li><li>襟の骨まで、胸郭の側面をカット。 </li><li>剣状軟骨をクランプし、頭の上に止血剤を配置するために止血剤を使用してください。 </li><li>鉗子で横平面上の心の底三分の一を持ってください。左心室に針を挿入します。 </li><li>心をクランプする止血剤を使用してください。これは、針を固定し、漏出を防ぐことができます。 </li><li>右心房をカットするはさみを使用してください。 </li><li> PBSを動物を通じて（18ミリリットル/分）をポンプすることを許可する。 （;約70ミリリットルのPBSに相当する3-4分）バッファ注入期間を通じてこの圧力を維持する。心がきれいになるまで続けます。</li><li>ポンプを介して固定液（蒸留水で4％パラホルムアルデヒド、4％PFA）を可能にするためにストップコックを切り替えます。 4％PFAは、約8〜10分（300ミリリットル）のために動物を介してポンプを許可します。徐々に30ml /分の最大値に到達するまで圧力を増加させる。硬化肝臓は成功した灌流の最良の指標です。 </li></ol> 10.組織の収集および処理、組織学およびIimmunohistochemistry <ol><li> L1にT5から脊髄を解剖。次に、（4℃でO / N）4％PFAで6ミリリットルの組織をポスト修正。 </li><li>クライオそれを保護し、凍結中の結晶の形成を防止するために、4℃で72時間、30％スクロース溶液中で同じ組織を置く。 </li><li>クイックドライアイスを使用してコードを凍結し、-80℃で保管してください。 </li><li> 15ミクロン厚のクライオスタットによるセクションとスライドガラス上にセクションを収集し、免疫細胞化学のために継続する。 </li><li>各sのPBS200μlのセクションをすすぐLIDE（3回、各5分間、RT）。 </li><li> 200の10％NGSμlのRTで1時間、PBS中0.2％トリトンX-100で各スライドを透過。 </li><li>各スライドのために200μlのPBS（;各5分間、RT 3回）でセクションをすすぐ。 </li><li> （; PBS中0.1％トリトンX-100を5％NGS）30分（RT）用スライドのブロッキング溶液を200μlとの非特異的部位をブロックする。 </li><li> 4℃でO / N一次抗体200μlを各スライドをインキュベートする（5％NGS中で抗体を希釈し、PBS中0.1％トリトンX-100）。 </li><li>各スライドをPBS200μlでセクションを洗ってください（3回、各5分間、RT）。 </li><li> RTで2時間、適切な二次抗体でインキュベートする。 </li><li>各スライドをPBS200μlでセクションを洗ってください（3回、各5分間、RT）。 </li><li> 4 &#39;、6- diamidin -2- phenilindole（DAPI）（1μg/ mlの最終濃度で、室温で10分間）、200μlの染色と核。 </li><li> FluorSave試薬を用いてマウントし、共焦点顕微鏡により分析する。 注：イン制御決定は、一次抗体は、同じサブクラスの関係のないIgGの同等の濃度の省略、交換する必要があります。微小管関連タンパク質2次抗体を使用した。 </li></ol>

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著者は、競合する経済的利害関係を宣言していない。

本論文では、70 kdyne（重度）の力で無限ホライゾンインパクターを用いて、外傷性脊髄損傷の再現可能なモデルを得るための方法を記載した。大きな力パラダイム（80 kdyne）を使用して、我々は、残念ながら、より高いマウスの死亡率に関連付けられているより深刻な傷害を引き起こす可能性があります。この問題を回避するために、我々は一般的に、関数の緩やかな回復と低死亡率と再現性...

脊髄損傷（SCI）は、スポーツや暴力1、自動車事故のような高エネルギー外傷によって引き起こされる最も一般的な損傷である落ちる。重度のSCIでは、傷害力は神経機能の突然の喪失を引き起こし、神経組織を破壊するか、損害賠償。外傷性SCIは、年齢の10と40年の間に若年成人に頻繁に発生します。それは非常に患者の心身の状態に影響を与え、社会2に莫大な経済的影響を引き起こす。急性期治療アプローチは、多くの場合、おそらくさらなる損傷3-4を減衰させるために、コルチコステロイド、外科的安定化及び解凍の高用量に限定されず、SCI後の運動回復にこれらのメソッドの役割はまだ論争されている。急性組織欠損、外傷および複数の細胞型5-6の変性の原因脱髄および死亡の二次機構の活性化に加えて。機能の回復の程度は、缶10は、損傷部位7で免れる白質の程度と相関させること。 SCIの動物モデルは、損傷に対する組織の生物学的応答を調査し、潜在的な治療法をテストするための両方に使用することができる。さらに、ヒト病理の有用な動物モデルだけでなく、その条件のいくつかの局面を再現しなければならないだけでなく、直接の臨床観察および実験上の利点を提供しなければならない。脊髄損傷の最も広く使用されるモデルは、外科的に露出させた脊髄8に送ら挫傷又は圧迫傷害を伴う。制御重量ドロップ挫傷の開発はSCI研究の歴史の中で重要なマイルストーンを表している。オハイオ州立大学脊髄研究センターは、コンピュータ9により制御される衝撃のパラメータを脊髄の特定の圧縮を誘発するために使用することができ、装置の技術的課題を追求してきた。これは、もともと利用のWiのために設計されました目のラット;後には、マウス10に向けて適用するように変更されました。この種のアプローチの利点は、損傷の生体力学を深く詳細に研究することができ、損傷のパラメータは、再現可能な実験モデルを得るために、より完全な方法で定義することができることであり、したがって、効果のより正確な評価を可能にする機能回復過程に治療をテストしました。 多くの研究は、SCIモデル11における幹細胞の種々の移植の効果を評価した。我々は最近、数時間のマウスドナー12-13の死後、サブ脳室帯（SVZ）から成体神経幹細胞を単離した。この手順では、SCIを硬化させるための再生医療のアプローチで有利であると思われる神経幹細胞と呼ばれる死後の神経前駆体（PM-のNPC）の集団を提供する。本論文では、デモンストレーションを行います：ⅰ）​​重要なトレーサーPKH26で細胞標識のためのプロトコル、II）SURG外傷性SCIで実行するiCalの手順、および標識された細胞のIII）静脈内（IV）投与。さらに、本研究で、我々は、移植された細胞は、脊髄損傷部位に移動し、主にタンパク質（MAP）2陽性細胞微小管関連に分化することを実証している。さらに、分化は、後肢機能の安定した回復の促進を伴っている。

<table><tbody><tr><td>PKH26GL-1KT&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>091M0973</td><td></td></tr><tr><td>Infinite horizon (IH) Impactor device&amp;nbsp;</td><td>Precision Systems and Instrumentation, LLC</td><td>Model 0400 Serial 0171</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin 10 mg/ml</td><td>Euroclone</td><td>ECM0011B</td><td>1 mg/ml in sterile saline solution</td></tr><tr><td>Isoflurane-Vet 250 ml</td><td>Merial</td><td>B142J12A</td><td></td></tr><tr><td>Blefarolin POM OFT 10 g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Warmer</td><td>2Biological Instruments</td><td>HB101-sm-402</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel, size 10</td><td>Lance Paragon</td><td>26920</td><td></td></tr><tr><td>Small Graefe Forceps</td><td>2Biological Instruments</td><td>11023-14</td><td></td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Medicon Instruments</td><td>07 60 07</td><td></td></tr><tr><td>Micro scissors</td><td>2Biological Instruments</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Absorbable sutures (4/0)</td><td>Safil Quick</td><td>C0046203</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>2Biological Instruments</td><td>13014-14</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 7 wound clip applicator</td><td>2Biological Instruments</td><td>12031-07</td><td></td></tr><tr><td>7 mm Reflex wound clips</td><td>2Biological Instruments</td><td>12032-07</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Euroclone</td><td>ECS0200D</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>1086431000</td><td></td></tr><tr><td>Anti Microtubule Assocoated Protein&amp;nbsp; (MAP) 2</td><td>Millipore</td><td>AB5622</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave Reagent&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Neural stem cells medium</td><td></td><td></td><td>DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 &amp;mu;g/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Euroclone</td><td>ASM5002</td><td></td></tr><tr><td>l-glutamine</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780-25G</td><td></td></tr><tr><td>progesterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6149-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium-selenite</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9133-1MG</td><td></td></tr><tr><td>transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T 5391</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium-salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0200000</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technology</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>h-EGF</td><td>Life Technology</td><td>PHG6045</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 0.33 cc 29 G</td><td>Terumo</td><td>MYJECTOR&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>buprenorphine</td><td>Schering Plough SpA</td><td>TEMGESIC</td><td></td></tr><tr><td>eye gel</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>LIPOSIC</td><td></td></tr></tbody></table>

neural stem cell transplantation in experimental contusive model of spinal cord injury

脊髄損傷は、神経学的機能障害の複合体により特徴付けられる壊滅的な臨床症状である。脊髄損傷の動物モデルは、損傷に対する生物学的応答を調査し、潜在的な治療法を試験するための両方に使用することができる。外科的に露出した脊髄に送達挫傷又は圧迫傷害病理の最も広く使用されるモデルである。この報告では実験的な挫傷特定傷害パラメータの定義によって再現可能な損傷動物モデルの作成を可能にする無限ホライゾン（IH）インパクター装置を用いて行われる。幹細胞移植は、一般的に、この衰弱状態を硬化させるための潜在的に有用な戦略と考えられている。多くの研究は、幹細胞の種々の移植の効果を評価した。ここでは、CD1マウスにおける細胞の尾静脈注射に続いて、脊髄損傷のために適応する方法を実証する。 I）細胞標識のWi：一言で言えば、我々はのための手順を提供重要なトレーサー番目と、ii）マウスの術前治療、挫傷、脊髄損傷のiii）の実行、および死後の神経前駆体のiv）の静脈内投与。この挫傷モデルは、再生医療のアプローチでは、幹細胞移植の有効性および安全性を評価するために利用することができる。

移植された細胞の総数は、1×10 6細胞で、尾静脈内に3つの連続した注射に分けた。我々は、リン酸緩衝液（PBS）50μlの3.3×10 5個の細胞を投与する。最初の注射は、第二6時間後に、傷害後30分以内に実行され、病変の後、最後の18時間であった。 PM-のNPCを投与するためのSCI後18時間の制限時間の選択は、この時点14で血液脳関門の最適な透過性によって決定した。幹細胞?...

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Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

脊髄損傷は、深刻な罹患率および高い死亡率を引き起こす外傷性状態である。本研究では、具体的に、神経幹細胞の移植に続いて、マウスにおける脊髄損傷の挫傷モデルを記述する。

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

neural-stem-cell-transplantation-experimental-contusive-model-spinal

Research

JoVE Journal

Medicine

13.0K ビュー.  University of Milan. 脊髄損傷は、深刻な罹患率および高い死亡率を引き起こす外傷性状態である。本研究では、具体的に、神経幹細胞の移植に続いて、マウスにおける脊髄損傷の挫傷モデルを記述する。 

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Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury

Respiratory compromise due to phrenic motor neuron loss is a debilitating consequence of a large proportion of human traumatic spinal cord injury (SCI) cases 1 and is the ultimate cause of death in patients with the motor neuron disorder, amyotrophic laterals sclerosis (ALS) 2.
ALS is a devastating neurological disorder that is characterized by relatively rapid degeneration of upper and lower motor neurons. Patients ultimately succumb to the disease on average 2-5 years following diagnosis because of respiratory paralysis due to loss of phrenic motor neuron innnervation of the diaphragm 3. The vast majority of cases are sporadic, while 10% are of the familial form. Approximately twenty percent of familial cases are linked to various point mutations in the Cu/Zn superoxide dismutase 1 (SOD1) gene on chromosome 21 4. Transgenic mice 4,5 and rats 6 carrying mutant human SOD1 genes (G93A, G37R, G86R, G85R) have been generated, and, despite the existence of other animal models of motor neuron loss, are currently the most highly used models of the disease.
Spinal cord injury (SCI) is a heterogeneous set of conditions resulting from physical trauma to the spinal cord, with functional outcome varying according to the type, location and severity of the injury 7. Nevertheless, approximately half of human SCI cases affect cervical regions, resulting in debilitating respiratory dysfunction due to phrenic motor neuron loss and injury to descending bulbospinal respiratory axons 1. A number of animal models of SCI have been developed, with the most commonly used and clinically-relevant being the contusion 8.
Transplantation of various classes of neural precursor cells (NPCs) is a promising therapeutic strategy for treatment of traumatic CNS injuries and neurodegeneration, including ALS and SCI, because of the ability to replace lost or dysfunctional CNS cell types, provide neuroprotection, and deliver gene factors of interest 9.
Animal models of both ALS and SCI can model many clinically-relevant aspects of these diseases, including phrenic motor neuron loss and consequent respiratory compromise 10,11. In order to evaluate the efficacy of NPC-based strategies on respiratory function in these animal models of ALS and SCI, cellular interventions must be specifically directed to regions containing therapeutically relevant targets such as phrenic motor neurons. We provide a detailed protocol for multi-segmental, intraspinal transplantation of NPCs into the cervical spinal cord ventral gray matter of neurodegenerative models such as SOD1G93A mice and rats, as well as spinal cord injured rats and mice 11.

Neural precursor transplantation is a promising strategy for protecting and/or replacing lost/dysfunctional cervical phrenic motor neurons in spinal cord injury (SCI) and the motor neuron disorder, amyotrophic laterals sclerosis (ALS). We provide a protocol for cell delivery to cervical spinal cord ventral horn in rodent models of ALS and SCI.

筋萎縮性側索硬化症や外傷性脊髄損傷では頚椎前角をターゲットとするための髄腔内細胞移植

Respiratory compromise due to phrenic motor neuron loss is a debilitating consequence of a large proportion of human traumatic spinal cord injury (SCI) ...

医学

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is described to obtain a consistent model of severe SCI. Use of a stereotactic frame and computer controlled impactor allows for creation of reproducible injury. Hypothermia and urinary tract infection pose significant challenges in the post-operative period. Careful monitoring of animals with daily weight recording and bladder expression allows for early detection of post-operative complications. The functional results of this contusion model are equivalent to transection models. The contusion model can be utilized to evaluate the efficacy of both neuroprotective and neuroregenerative approaches.

A contusion model of severe spinal cord injury is described. Detailed pre-operative, operative and post-operative steps are described to obtain a consistent model.

ラットにおける重度の脊髄損傷挫傷モデル

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord injury (SCI), and can form functional relays to re-connect spinal cord segments above and below a lesion. Previous studies grafting neural stem cells have been limited by incomplete graft survival within the spinal cord lesion cavity. Further, tracking of graft cell survival, differentiation, and process extension had not been optimized. Finally, in previous studies, cultured rat NSCs were typically reported to differentiate into glia when grafted to the injured spinal cord, rather than neurons, unless fate was driven to a specific cell type. To address these issues, we developed new methods to improve the survival, integration and differentiation of NSCs to sites of even severe SCI. NSCs were freshly isolated from embryonic day 14 spinal cord (E14) from a stable transgenic Fischer 344 rat line expressing green fluorescent protein (GFP) and were embedded into a fibrin matrix containing growth factors; this formulation aimed to retain grafted cells in the lesion cavity and support cell survival. NSCs in the fibrin/growth factor cocktail were implanted two weeks after thoracic level-3 (T3) complete spinal cord transections, thereby avoiding peak periods of inflammation. Resulting grafts completely filled the lesion cavity and differentiated into both neurons, which extended axons into the host spinal cord over remarkably long distances, and glia. Grafts of cultured human NSCs expressing GFP resulted in similar findings. Thus, methods are defined for improving neural stem cell grafting, survival and analysis of in vivo findings.

Fibrin matrices containing growth factors were used to retain grafted neural stem cells into sites of complete spinal cord transection. Grafted cells completely filled the lesion cavity and differentiated into multiple neural cell types, including neurons that extended axons into host spinal cord over long distances.

重度の脊髄損傷後のフィブリンおよび成長因子カクテル神経幹細胞の生存と分化の促進

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

神経科学

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical insult to secondary injury processes, including apoptosis and inflammation. Animal modeling has been valuable in the search to unravel injury mechanisms and evaluate potential neuroprotective therapies. This protocol describes the controlled cortical impact (CCI) model of focal, open-head TBI. Specifically, parameters for producing a mild unilateral cortical injury are described. Behavioral consequences of CCI are analyzed using the adhesive tape removal test of bilateral sensorimotor integration. Regarding experimental therapy for TBI pathology, this protocol also illustrates a process for transplanting cultured cells into the brain. Neural cell cultures derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were chosen for their potential to show superior functional restoration in human TBI patients. Chronic survival of hiPSCs in the host mouse brain tissue is detected using a modified DAB immunohistochemical process.

This protocol demonstrates methodologies for a mouse model of open-skull traumatic brain injury and transplantation of cultured human induced pluripotent stem cell-derived cells into the injury site. Behavioral and histologic tests of outcomes from these procedures are also described in brief.

ヒト誘導多能性幹細胞由来神経細胞の治療移植によるマウス脳損傷の制御された皮質衝撃モデル

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

発生生物学

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. Clinically, more than 50% of SCI affect the cervical spine1. As a consequence of the primary injury, a cascade of secondary mechanisms including inflammation, apoptosis, and demyelination occur finally leading to tissue scarring and development of intramedullary cavities2,3. Both represent physical and chemical barriers to cell transplantation, integration, and regeneration. Therefore, shaping the inhibitory environment and bridging cavities to create a supportive milieu for cell transplantation and regeneration is a promising therapeutic target4. Here, a contusion/compression model of cervical SCI using an aneurysm clip is described. This model is more clinically relevant than other experimental models, since complete transection or ruptures of the cord are rare. Also in comparison to the weight drop model, which in particular damage the dorsum columns, circumferential compression of the spinal cord appears advantageous. Clip closing force and duration can be adjusted to achieve different injury severity. A ring spring facilitates precise calibration and constancy of clip force. Under physiological conditions, synthetic self-assembling peptides (SAP) self-assemble into nanofibers and thus, are appealing for application in SCI5. They can be injected directly into the lesion minimizing damage to the cord. SAPs are biocompatible structures erecting scaffolds to bridge intramedullary cavities and thus, equip the damaged cord for regenerative treatments. K2(QL)6K2 (QL6) is a novel SAP introduced by Dong et al.6 In comparison to other peptides, QL6 self-assembles into &#946;-sheets at neutral pH6.14 days after SCI, after the acute stage, SAPs are injected into the center of the lesion and neural precursor cells (NPC) are injected into adjacent dorsal columns. In order to support cell survival, transplantation is combined with continuous subdural administration of growth factors by osmotic micro pumps for 7 days.

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

実験的子宮頸脊髄損傷における神経前駆細胞と自己組織化ペプチドの相乗使用

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the spinal cord, tumor resections, or tissue defects resulting from traumatic accidents can aid in facilitating general tissue repair as well as regenerative growth of nerve fibers into and beyond the affected area. Two experimental treatment strategies are presented: (1) implantation of a novel microconnector device into an acutely and completely transected thoracic rat spinal cord to readapt severed spinal cord tissue stumps, and (2) polyethylene glycol filling of the SCI site in chronically lesioned rats after scar resection. The chronic spinal cord lesion in this model is a complete spinal cord transection which was inflicted 5 weeks before treatment. Both methods have recently achieved very promising outcomes and promoted axonal regrowth, beneficial cellular invasion and functional improvements in rodent models of spinal cord injury.
The mechanical microconnector system (mMS) is a multi-channel system composed of polymethylmethacrylate (PMMA) with an outlet tubing system to apply negative pressure to the mMS lumen thus pulling the spinal cord stumps into the honeycomb-structured holes. After its implantation into the 1 mm tissue gap the tissue is sucked into the device. Furthermore, the inner walls of the mMS are microstructured for better tissue adhesion.
In the case of the chronic spinal cord injury approach, spinal cord tissue - including the scar-filled lesion area - is resected over an area of 4 mm in length. After the microsurgical scar resection the resulting cavity is filled with polyethylene glycol (PEG 600) which was found to provide an excellent substratum for cellular invasion, revascularization, axonal regeneration and even compact remyelination in vivo.

Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

急性および慢性病変後に損傷した脊髄に大きな組織ギャップを埋めるための実験的戦略

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the ...

Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap

Among various models for spinal cord injury in rats, the contusion model is the most often used because it is the most common type of human spinal cord injury. The complete transection model, although not as clinically relevant as the contusion model, is the most rigorous method to evaluate axon regeneration. In the contusion model, it is difficult to distinguish regenerated from sprouted or spared axons due to the presence of remaining tissue post injury. In the complete transection model, a bridging method is necessary to fill the gap and create continuity from the rostral to the caudal stumps in order to evaluate the effectiveness of the treatments. A reliable bridging surgery is essential to test outcome measures by reducing the variability due to the surgical method. The protocols described here are used to prepare Schwann cells (SCs) and conduits prior to transplantation, complete transection of the spinal cord at thoracic level 8 (T8), insert the conduit, and transplant SCs into the conduit. This approach also uses in situ gelling of an injectable basement membrane matrix with SC transplantation that allows improved axon growth across the rostral and caudal interfaces with the host tissue.

This article describes a technique to insert a hollow conduit between the spinal cord stumps after complete transection and fill with Schwann cells (SCs) and injectable basement membrane matrix in order to bridge and promote axon regeneration across the gap.

シュワンの移植細胞のギャップを渡って軸索の再生を促進するために切断のラット脊髄切り株をブリッジする PVDF ・ セッション導管内

Among various models for spinal cord injury in rats, the contusion model is the most often used because it is the most common type of human spinal cord ...

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied in vitro using the neurosphere assay. This colony-forming assay is a powerful tool to study the response of NSCs to exogenous factors in a dish; however, this can also be used to study the effect of in vivo manipulations with the proper understanding of the strengths and limitations of the assay. One manipulation of the clinical interest is the effect of injury on endogenous NSC activation. Current models of spinal cord injury provide a challenge to study this as the severity of common contusion, compression, and transection models cause the destruction of the NSC niche at the site of the injury where the stem cells reside. Here, we describe a minimal injury model that causes localized damage at the superficial dorsolateral surface of the lower thoracic level (T7/8) of the adult mouse spinal cord. This injury model spares the central canal at the level of injury and permits analysis of the NSCs that reside at the level of the lesion at various time points following injury. Here, we show how the neurosphere assay can be utilized to study the activation of the two distinct, lineally-related, populations of NSCs that reside in the spinal cord periventricular region - primitive and definitive NSCs (pNSCs and dNSCs, respectively). We demonstrate how to isolate and culture these NSCs from the periventricular region at the level of injury and the white matter injury site. Our post-surgical spinal cord dissections show increased numbers of pNSC and dNSC-derived neurospheres from the periventricular region of injured cords compared to controls, speaking to their activation via injury. Furthermore, following injury, dNSC-derived neurospheres can be isolated from the injury site &#8212; demonstrating the ability of NSCs to migrate from their periventricular niche to sites of injury.

Here, we demonstrate the performance of a minimal spinal cord injury model in an adult mouse that spares the central canal niche housing endogenous neural stem cells (NSCs). We show how the neurosphere assay can be used to quantify activation and migration of definitive and primitive NSCs following injury.

最小限の脊髄損傷のマウス モデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

Development of Combinatorial Therapeutics for Spinal Cord Injury using Stem Cell Delivery

Traumatic spinal cord injury (SCI) induces permanent sensorimotor deficit below the site of injury. It affects approximately a quarter million people in the US, and it represents an immeasurable public health concern. Research has been conducted to provide effective therapy; however, SCI is still considered incurable due to the complex nature of the injury site. A variety of strategies, including drug delivery, cell transplantation, and injectable biomaterials, are investigated, but one strategy alone limits their efficacy for regeneration. As such, combinatorial therapies have recently gained attention that can target multifaceted features of the injury. It has been shown that extracellular matrices (ECM) may increase the efficacy of cell transplantation for SCI. To this end, 3D hydrogels consisting of decellularized spinal cords (dSCs) and sciatic nerves (dSNs) were developed at different ratios and characterized. Histological analysis of dSCs and dSNs confirmed the removal of cellular and nuclear components, and native tissue architectures were retained after decellularization. Afterward, composite hydrogels were created at different volumetric ratios and subjected to analyses of turbidity gelation kinetics, mechanical properties, and embedded human adipose-derived stem cell (hASC) viability. No significant differences in mechanical properties were found among the different ratios of hydrogels and decellularized spinal cord matrices. Human ASCs embedded in the gels remained viable throughout the 14-day culture. This study provides a means of generating tissue-engineered combinatorial hydrogels that present nerve-specific ECM and pro-regenerative mesenchymal stem cells. This platform can provide new insights into neuro-regenerative strategies after SCI with future investigations.

In this study, nerve-mimetic composite hydrogels were developed and characterized that can be utilized to investigate and capitalize on the pro-regenerative behavior of adipose-derived stem cells for spinal cord injury repair.

幹細胞送達を用いた脊髄損傷の併用療法の開発

Traumatic spinal cord injury (SCI) induces permanent sensorimotor deficit below the site of injury. It affects approximately a quarter million people in ...

生物工学

脊髄器官型培養におけるh-SC-NES細胞の長期生着

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches is based on stem cell transplantation to replace lost tissue and promote functional recovery. This approach should be further explored better in vitro and ex vivo for safety and efficacy before proceeding with more expensive and time-consuming animal testing. In this work, we show the establishment of a long-term platform based on mouse spinal cord (SC) organotypic slices transplanted with human neural stem cells to test cellular replacement therapies for SCIs.
Standard SC organotypic cultures are maintained for around 2 or 3 weeks in vitro. Here, we describe an optimized protocol for long-term maintenance (&#8805;30 days) for up to 90 days. The medium used for long-term culturing of SC slices was also optimized for transplanting neural stem cells into the organotypic model. Human SC-derived neuroepithelial stem (h-SC-NES) cells carrying a green fluorescent protein (GFP) reporter were transplanted into mouse SC slices. Thirty days after the transplant, cells still show GFP expression and a low apoptotic rate, suggesting that the optimized environment sustained their survival and integration inside the tissue. This protocol represents a robust reference for efficiently testing cell replacement therapies in the SC tissue. This platform will allow researchers to perform an ex vivo pre-screening of different cell transplantation therapies, helping them to choose the most appropriate strategy before proceeding with in vivo experiments.

著者スポットライト:脊髄再生療法を進めるための長期脊髄スライス培養

In this paper, we provide a reproducible method to generate and maintain long-term spinal cord organotypic slices transplanted with neural stem cells as an ex vivo model for testing cellular replacement therapies.

脊髄損傷における細胞移植を検証するためのプラットフォームとしての長期マウス脊髄器官型スライス培養

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches ...

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

要約

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筋萎縮性側索硬化症や外傷性脊髄損傷では頚椎前角をターゲットとするための髄腔内細胞移植

ラットにおける重度の脊髄損傷挫傷モデル

重度の脊髄損傷後のフィブリンおよび成長因子カクテル神経幹細胞の生存と分化の促進

ヒト誘導多能性幹細胞由来神経細胞の治療移植によるマウス脳損傷の制御された皮質衝撃モデル

実験的子宮頸脊髄損傷における神経前駆細胞と自己組織化ペプチドの相乗使用

急性および慢性病変後に損傷した脊髄に大きな組織ギャップを埋めるための実験的戦略

シュワンの移植細胞のギャップを渡って軸索の再生を促進するために切断のラット脊髄切り株をブリッジする PVDF ・セッション導管内

最小限の脊髄損傷のマウスモデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ

幹細胞送達を用いた脊髄損傷の併用療法の開発

脊髄損傷における細胞移植を検証するためのプラットフォームとしての長期マウス脊髄器官型スライス培養

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

要約

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筋萎縮性側索硬化症や外傷性脊髄損傷では頚椎前角をターゲットとするための髄腔内細胞移植

ラットにおける重度の脊髄損傷挫傷モデル

重度の脊髄損傷後のフィブリンおよび成長因子カクテル神経幹細胞の生存と分化の促進

ヒト誘導多能性幹細胞由来神経細胞の治療移植によるマウス脳損傷の制御された皮質衝撃モデル

実験的子宮頸脊髄損傷における神経前駆細胞と自己組織化ペプチドの相乗使用

急性および慢性病変後に損傷した脊髄に大きな組織ギャップを埋めるための実験的戦略

シュワンの移植細胞のギャップを渡って軸索の再生を促進するために切断のラット脊髄切り株をブリッジする PVDF ・ セッション導管内

最小限の脊髄損傷のマウス モデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ

幹細胞送達を用いた脊髄損傷の併用療法の開発

脊髄損傷における細胞移植を検証するためのプラットフォームとしての長期マウス脊髄器官型スライス培養

シュワンの移植細胞のギャップを渡って軸索の再生を促進するために切断のラット脊髄切り株をブリッジする PVDF ・セッション導管内

最小限の脊髄損傷のマウスモデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ