この作品は Krembil 財団 (営業許可 CMM) によって資金を供給します。WX はカールトン マルグリット スミス学生賞の受信者です。NL は、オンタリオ州大学院奨学金を受け取った。

「ガイド ケアと使用の実験動物」に従い、トロント大学で動物ケア委員会によって承認されたこのプロトコル (2ndエディション動物の世話、カナダ評議会 2017).
1. 最小限の脊髄傷害手術
注: 手術前にすべての手術器具と材料が (図 1 a) 適切な方法で滅菌されていることを確認してください。
<ol><li>4-5 正方形のガーゼを重ね、ガーゼの固定ロールを取得する途中でそれらを一緒にテーピングして呼吸器サポート アーチを構築します。</li>
	<li>誘導チャンバーにマウスを置きし、5% イソフルレンで麻酔を開始します。プロシージャ全体だけでなく、前に、つま先ピンチ反射の有無を確認します。手術は、完了に 30 分以上かかることが、として最小限のイソフルラン暴露 (5% で 5 分) や 2-3% で残り時間を最適化します。</li>
	<li>2-3% イソフルラン維持投与量で麻酔器に接続されている鼻の円錐形にマウスを転送します。バリカンを使用して、手術のため皮膚の広い長方形領域を公開する首/耳まで半ば後ろから動物の背から毛皮を削除します。</li>
	<li>脳定位固定装置に添付のノーズコーンにその鼻を置き、イヤバーと頭蓋骨を安定させるマウスを転送します。マウスの脳定位固定装置で保護されて一度耳バーと 2-3% に戻って下の配置中にイソフルラン 5% を維持します。</li>
	<li>術前鎮痛薬を腹腔内管理 — メロキシカム (2.0 mg/kg)。気前よく潤滑目麻酔と角膜の乾燥を防ぐためにオープン マウスの目に。</li>
	<li>尾のベースを軽く引いてマウス体内と背骨を矯正しながらマウスの腹部の下に胸部サポート アーチを配置します。尾および星のような位置にすべての拡張の手足を保護するのにテープにラベル付け室を使用します。セキュリティで保護された、一度押して上部胸郭に向かってマウスの腹部からの呼吸器サポート アーチ吻方、-胸椎 (図 1 b) を支えるために。</li>
	<li>70% エタノール、ポビドン ヨードに続いて手順 1.3 の準備毛皮クリップ皮膚領域を消毒して滅菌手術野を準備します。2 回繰り返します。広い滅菌フィールドを維持する滅菌手術用ドレープを適用します。</li>
	<li>#10 メス刃を使用して、縦切開は、胸椎の曲率を両方の肩甲骨の中間点から動物の長手方向の軸線に平行ください。軟部組織と脊柱輪郭線 (図 1) を公開するために皮膚を撤回します。</li>
	<li>(これは T4/5 椎体レベルを設定) 甲の脂肪パッドの下の境界を識別します。同じ #10 刃で慎重に、力、列から裏筋腱をデタッチする椎体骨 T5-T8/9 の両側に沿ってカットします。</li>
	<li>背骨の両側に切開サイトにリトラクターの歯を挿入します。露出を調整するには、十分に収縮の筋層 (図 1) にあまり負担をかけることがなく背骨を昇格するリトラクターを拡大します。</li>
	<li>手術顕微鏡下で注意深く洗浄残留筋肉や他の軟部組織 (図 1E) の椎体の骨を公開する脊椎を覆います。脊椎が上下の歯の鉗子で椎骨の棘突起を握りしめると、わずかに移動することによって削除されますを識別します。 注: これは椎間関節を識別できるようにする必要があります、興味の脊椎骨の下に小さな開口部 (椎間孔) を公開します。</li>
	<li>露出椎間孔を摘出する椎弓板に尾の両側に鈍化デカールバサミの 1 つのヘッドを挿入して、二国間接続椎間関節を切りなさい。</li>
	<li>板を上方に持ち上げるし、分離し、骨を取り除くラミナの上部アタッチメントを断ちます。 注: これは、脊髄 (図 1 f) を含む無傷の硬膜嚢が公開されます。過剰な可能性があります影響を受ける領域の上に 1 cm × 1 cm のガーゼをプレカットや滅菌 PBS で洗浄出血を配置することによって制御できます。</li>
	<li>ランドマークとして背側正中静脈、正中線の両側に約 0.5 mm 外側で脊髄 (約 1 mm 深い) の背側表面に (針ベベルが上向き) で 30 G の針の先端の 45 ° 曲がったシャフトを挿入します。</li>
	<li>針 〜 2 mm の尾側から吻側 (正中線に平行) に移動、針の傾斜面の全体の長さがコードに挿入されます。エントリ (図 1) のパスを介してが針を抜きます。 注: 必要があります出血、脊髄組織の腫脹は、この段階で見られるかもしれない。</li>
	<li>傷を閉じるため、リトラクターを削除し、6-0 吸収性縫合糸を用いた正中線で一緒に傷害のいずれかの側に背中の筋肉を縫合します。その後穿刺部位の皮膚を閉じます 4-0 滅菌絹縫合糸を使用します。</li>
	<li>綿棒の先端を用いた術後感染症を防ぐために表面的な縫合皮膚の上部に抗生物質軟膏を適用されます。0.1 mg/kg 皮下流体 (リンゲル液の 1 mL) と共にブプレノルフィンの術後鎮痛を管理します。</li>
	<li>イソフルラン気化器と酸素をオフにします。脳定位固定装置とない寝具で清潔なケージの場所から、マウスを削除します。</li>
	<li>次の覚醒麻酔とモニターの動作から回復のための熱ランプから約 30 cm のケージにマウスを配置します。マウスは 5-10 分でウェイク アップさせる、可能な麻痺や覚醒時に尻尾の弱点と後肢の機能を持つ必要があります。</li>
	<li>次の数日間マウスの動作を監視し、適切な術後ケアと鎮痛剤 (リンゲル液ソリューション液皮下、0.1 mg/kg ブプレノルフィン 2すなわちマッシュ、一日 2-3 日間で、適切な重量の監視のために皮下に毎日 x) 回復としてに従ってローカル動物施設規制し、個別に異なる場合があります。</li>
</ol>2. Neurosphere アッセイ郭清
注: 全体で適切な無菌培養手順に従います。
<ol><li>酵素液調製法
	<ol>
<li>アルブミン オボムコイド阻害剤含有ガラス瓶と優しく渦溶解するまでに 32 mL のアールのバランスの取れた塩ソリューション (EBSS) を追加します。</li>
		<li>プリポーション パパインのバイアルに EBSS 5 mL を追加し、溶解する 37 ° C の水浴中に置きます。ソリューションになる (ソリューション 1) をオフにします。</li>
		<li>EBSS の 500 μ L を取るし、濃度が 1 mg/mL (ソリューション 2) のバイアル ガラス プリポーション DNase を追加します。前後のバイアルを傾けることによってとてもやさしく混ぜるし、ソリューション 1 にこの混合物を 250 μ L を追加します。 注: 作られたすべてのソリューション (ソリューション 1 と 2) は、組織の 2 つの部分の処理のために十分です。組織のより多くの部分を処理している場合は、詳細のソリューションの準備と対応します。</li>
	</ol></li>
	<li>ティッシュの準備と郭清
	<ol>
<li>場所研究室ワイプはマウス ケージにイソフルランに浸し、完全にマウスを麻酔する蒸気の 2 〜 3 分を許可します。次のノックアウト マウスをケージから取り外し、つま先ピンチ反射の有無を確認します。</li>
		<li>(すなわち、金属ケージのカード) に動物を安楽死させる金属鈍器で頚部転位を実行します。スプレー 70% エタノールをたっぷりと半ばにその首から euthanized 動物。</li>
		<li>頭蓋底で頭を切断し、破棄バイオの袋にはさみを使用します。正中切開は、皮膚筋や椎体骨の輪郭線 (図 2 a) を公開する背中の全体の長さに沿って。</li>
		<li>各肩甲骨の内側面を持ち上げる (すなわち。、肩甲骨-脂肪質のパッドを覆うによって識別される) (肩甲骨・椎体間の軟部組織をカットするはさみを使用。基になる脊柱を公開する完全に独立した.</li>
		<li>以下の脊柱の湾曲、上胸部開口部にはさみのペアを挿入し、リブ、筋肉、臓器 (図 2 b) を切り取ることで、脊柱を分離します。</li>
		<li>尾椎孔・開口部にはさみを挿入し、ラミナ (背側表面) の両側に椎間関節をカットします。そのままケーブルを損傷しないように注意します。続きを所望のレベルおよび/またはコードの長さまで、このプロセスが公開されます。</li>
		<li>通常人工髄液をシャーレに脊髄組織を転送する前にコードから横方向に伸びる spinal nerve(s) を慎重にカットします。(図 2) の氷のサンプルを保ちます。</li>
		<li>解剖顕微鏡の下で ~ 2 mm 吻側と尾側に損傷部位を含むように脊髄組織を切断します。そっと背側と腹側の亀裂に沿って縦 2 等分にコードを分離する鉗子の 2 つのペアを使用して (図 2')。</li>
		<li>刀、負傷した背白質をカットします。15 mL の円錐管に作品を配置します。</li>
		<li>1 つを保持鉗子、ダウン脊髄の半分はいじめるし、白質の脊髄の rostrocaudal 範囲に沿って必要な脳室周囲領域を分離する微細鉗子の別のペアを使用してを削除します。脊髄の他の半分に繰り返します。</li>
		<li>別の 15 mL の円錐管に脳室周囲組織の作品を配置します。刀を使用し、軽く円錐管の壁にティッシュをミンチします。 注: 組織解離変更、パパイン解離システム プロトコル23前述の組織準備手順24です。</li>
		<li>組織サンプルに新ソリューション 1 (ステップ 2.1.3) の 2.5 mL を追加し、30 分の 37 ° C でロッカーに配置。</li>
		<li>そっとカップ刻んだ 1,000 μ L ピペット チップ ソリューションで組織。300 x g 5 分間室温で曇り細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
		<li>アールの平衡塩類溶液, オボムコイド阻害剤ソリューション (ステップ 2.1.1) の 300 μ L 2.7 ml ソリューション 3 を準備と DNase の 150 μ L 私ソリューション (ステップ 2.1.3)。</li>
		<li>ステップ (ステップ 2.2.13) から上澄みを廃棄し、前の手順 (手順 2.2.14) からソリューション 3 の 1.5 mL で再懸濁します。</li>
		<li>レイヤーの ovoimucoid 阻害剤溶液 (ステップ 2.1.1) 不連続密度勾配を作成する新しい 15 mL の円錐管に 5 mL の上にこの新しいセル中断 (ステップ 2.2.15)。300 × gで遠心するルートで 5 分間</li>
		<li>上澄みを廃棄し、neurobasal メディアの 2 mL で再懸濁します。300 × gで遠心する室温 3 分</li>
		<li>上澄みを廃棄し、neurobasal メディアの 1 つの mL で再懸濁します。5 mL の容量のためのメディアの 4 mL に続いて 20 μ m の細胞ストレーナーを使用して懸濁液をフィルター処理します。</li>
	</ol></li>
	<li>めっき
	<ol>
<li>表皮の成長因子 (20 ng/mL) と neurobasal メディアを補完 neurosphere 成長培地を準備/線維芽細胞増殖因子 (20 ng/mL)/ヘパリン (2 μ g/mL) [の決定的な NSCs] または [プリミティブ NSCs] の leukemina 抑制的な要因 (10 ng/mL)。25 mL の培養フラスコにいずれかのメディアの 10 mL を追加します。</li>
		<li>検定とトリパン ブルー色素を使用して25(ステップ 2.2.18) から懸濁液中の細胞数を計算します。計算された、(ステップ 2.3.1) で作製した培養フラスコにセルを追加 24 h (37 ° C、湿度 95%、5% CO2) のためのインキュベーターに追加されたセル 10 細胞/μ L と場所組織培養フラスコの栄養密度。 注: カウント手法の例のとおりです: 10 μ L トリパン ブルー色素の細胞懸濁液とミックスの取る 10 μ L。診断にこの混合物の 10 μ L を追加します。光学顕微鏡 X 10、[生きているセルの数をカウントし、内 4 x 4 象限の 4 カウントのすべてのセルを合計します。数式を使用して: 2 x 10 x 1,000 x 100,000/[(X cells/4)] クローン密度 (10 細胞/μ L) を確保するため各 25 mL の培養フラスコにめっきされる細胞を懸濁液の量を与える。</li>
		<li>24 h 後優しくフラスコを旋回し、15 mL の円錐管に内容を注ぐ。300 × gで遠心するルートで 5 分間</li>
		<li>上澄みを廃棄し、新鮮な neurobasal メディアの 1-2 mL のセルを再度中断します。</li>
		<li>2.3.2 補われるそれぞれのマイトジェン メディア (決定的な NSC 成長 EFH) と原始的な NSC 成長の LIF の 500 μ を含む 24 ウェル培養プレートのクローンの密度で懸濁液とプレートのセルのセルの数をカウントする手順を繰り返します。 注: 2 x 10 x 1,000 x 適応式 (5,000/[セル/4 X) を使用して) よく 500 μ L のメディアを含む各メッキに細胞懸濁液の体積を計算します。</li>
		<li>7 日間 (37 ° C、湿度 95%、5% CO2) 成長するインキュベーター内のセルを含んでいる版を配置します。</li>
	</ol></li>
	<li>カウント
	<ol>
<li>次の 7 日間培養プレートを削除し、光学顕微鏡で見る。球状のコロニーをカウントすることによって神経幹細胞を定量化する > dNSCs 文化の直径約 80 μ m と > 50 μ m 径 pNSCs 文化。 注: 必要な場合、神経幹細胞は継代26さらにすることができます。 または差別化します。セルが必要なくなった場合は、培地の色が黄色に変わり、20 分間 (約 1 mL) の井戸に加速の過酸化水素を追加することによって処分します。破棄します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

手術中に、研究者が最適な結果を取得し、動物間のばらつきを最小限に抑えるのために特に注意を払う必要がありますいくつかの重要なステップがあります。注意が必要 (イソフルラン) 吸入麻酔と手術中に麻酔が長時間27神経保護効果が示されていると。したがって、損傷脊髄の再生能力を学習の際の努力として迅速かつ効率的に交絡変数を防ぐために可能な限り手術を行?...

中枢神経系には、すべて異なる成熟した神経細胞の種類1,2,3,4に上昇を与える能力を持っている自己更新多能性幹細胞の集団が含まれています。これらの神経の幹細胞 (NSCs) は、脳や脊髄の専門にされたニッチに存在し、増殖、移行、および成熟神経細胞に分化する損傷アクティブすることができます。NSCs と彼らの子孫は、大脳皮質損傷モデル5,6傷害のサイトに移行する示されています。脳の側脳室から、グリア瘢痕形成7に貢献しているアストロ サイトに分化し、損傷部位に移行する NSCs を示されています。脊髄、ただし、いくつかの研究の脊髄損傷回復を促進するためこれらの同じ内因性 NSCs に利用できるかどうかを求めるに行われています。確かに、現在、脊髄における幹細胞のプールの活性化が中心管8を並べる脳室周囲ニッチの直接の物理的損傷を必要かどうかまたは脊髄へのダメージ コード (茎を残して実質のかどうかに議論は細胞ニッチそのまま) で内因性 NSCs9を有効にするに十分です。
脊髄損傷 (SCI) モデルの数は、急性および慢性の傷害の病態生理を研究に使用されています。これらのモデルは、神経保護、抗炎症、および開発細胞移植/交換戦略10、11,13SCI を治療するために潜在的な療法をテストする使用されています。現在のモデルには、コード14,15で大規模な機能障害と同様に広範な病変とキャビテーションが発生する圧縮および/または挫傷の傷害が含まれます。結果グリア瘢痕脊髄16の幅/円周の大半と共にいくつかの脊髄セグメントをまたがることができます。したがって、これらのモデルは臨床的に関連性の高い、彼らは損傷内因性 NSCs の応答を勉強する重要な課題を与えます。中央運河17を割くことができる傷害の穏やかな形態をさせるために適応することができます損傷の化学モデルがあります。しかし、これらのタイプの損傷の SCI に関連付けられている脱髄に焦点を当てるし、外傷性理に関連付けられている物理的および/または機械的損傷の臨床的に関連するモデルではないです。
現在の損傷モデルの制限に対処するため、我々 は針トラック最小限 SCI モデル、もともと、ラット9、成体マウス モデルのアプリケーションのために開発を適応しています。適応傷害モデルはマウスの脊髄の背外側領域の一貫した病変を作成でき、予備の損傷のレベルで中心街にある運河。このモデルの利点は、NSC の速度論の研究を許可する損傷部位への損傷とその潜在的な放射状の移住、次します。マウス モデルの使用は、内因性 NSCs と傷害に続く彼らの子孫の系譜追跡を許可するトランスジェニック マウスの使用もできます。NSCs のプロパティは、このプロトコルで導入された体外neurosphere アッセイの変更フォームを使用してさらに評価できます。
Neurosphere アッセイは、生体外でコロニー形成試金マイトジェン存在 NSCs の隔離を可能にします。クローン メッキ密度個々 NSCs は NSCs の小さな個体の前駆細胞18,19の大半で構成される細胞の浮遊球コロニーを生じさせるのに増殖します。我々 のプロトコルで脊髄の脳室周囲の地域から 2 つの異なる、後月関連 NSCs の分離を示す — 基準条件と私たちの最小限の SCI のモデル。決定的な神経幹細胞 (dNSCs) 特急ネスチンとグリア線維性酸性蛋白 (GFAP) と上皮成長因子 (EGF)、繊維芽細胞成長因子 (FGF) やヘパリン (EFH と呼ばれる一緒に)20存在下で栽培されています。これらの dNSCs は生体外で非常に少ない神経幹細胞に上昇を与える素朴な脊髄にまれです。ただし、次の脳室周囲地域21由来神経幹細胞の数を拡大して、最小限の SCI dNSCs をアクティブ化を示します。原始的な神経幹細胞 (pNSCs) は、神経幹細胞系列の dNSCs の上流。pNSCs 多能性マーカー Oct4、という極めてまれな、特急の低水準で、白血病の抑制的な要因 (LiF) 応答22。pNSCs は、成体マウス脊髄初代培養; ミエリン塩基性タンパク質 (MBP) の存在のためにから分離したときの神経幹細胞を形成しません。pNSC 神経幹細胞は、MBP 欠損マウスから分離することができ、その数は拡大続く傷害-dNSCs21に似ています。最後に、我々 は dNSC 由来の神経幹細胞を早く次の最小限の大回で損傷部位から分離することができます表示これらの結果は示して私たち損傷モデルと試金が増殖して損傷に応答を移行する能力などの脳室周囲 NSCs の活性化特性を評価できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Agricola Retractor</td>
			<td style="width:201px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:197px;">17005-04</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved)</td>
			<td style="width:201px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:197px;">15370-50</td>
			<td style="width:215px;">Customize when ordering to get blunted tips</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Graefe Forceps (Straight, 1x2 Teeth)</td>
			<td style="width:201px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:197px;">11053-10</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated)</td>
			<td style="width:201px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:197px;">11152-10</td>
			<td style="width:215px;">Or any other forceps for suturing</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Hartman Hemostats (Straight)</td>
			<td style="width:201px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:197px;">13002-10</td>
			<td style="width:215px;">Or any other appropriate for suturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Scalpel Handle #3</td>
			<td style="width:201px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:197px;">10003-12</td>
			<td style="width:215px;">Or any other appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:203px;">Hair clippers</td>
			<td style="width:201px;">amazon.ca</td>
			<td style="width:197px;">https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA</td>
			<td style="width:215px;">or any other appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Stereotaxic instrument</td>
			<td style="width:201px;">Stoeling</td>
			<td align="right">51500</td>
			<td style="width:215px;">or any other appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>or any appropirate sanctioned my animal care facility</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Meloxicam</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:215px;">or any appropriate sanctioned by animal care facility</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:203px;">Tears Naturale P.M.</td>
			<td style="width:201px;">Alcon</td>
			<td style="width:197px;">https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE</td>
			<td style="width:215px;">or any other appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:201px;">Baxter International Inc</td>
			<td style="width:197px;">DIN 02225875</td>
			<td style="width:215px;">or any other appropriate for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:203px;">Q-tips Cottom Swabs</td>
			<td style="width:201px;">amazon.ca</td>
			<td style="width:197px;">https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&#38;psc=1&#38;refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Cotton Gauze</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">30G Needles</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:197px;">305106</td>
			<td>For Injury</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">25G Needles</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:197px;">305122</td>
			<td>For Drug injections</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">1mL Syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:197px;">3090659</td>
			<td>for drug injections</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">3mL Syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:197px;">309657</td>
			<td>for fluid injections</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">4-0 Suture</td>
			<td style="width:201px;">uoftmedstore.com</td>
			<td>2297-VS881</td>
			<td>for skin suturing</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">6-0 Suture</td>
			<td style="width:201px;">uoftmedstore.com</td>
			<td>VS889</td>
			<td>for muscle suturing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Polysporin ointment</td>
			<td style="width:201px;">amazon.ca</td>
			<td align="right">102051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Isoflurane Vaporizer</td>
			<td style="width:201px;">VetEquip</td>
			<td align="right" style="width:197px;">901806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">15mL conical tubes</td>
			<td style="width:201px;">ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:201px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>any appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:201px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>Any</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:201px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>Any appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:201px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>Any appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Standard Dissection Tools</td>
			<td style="width:201px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Dissection Microscope</td>
			<td style="width:201px;">Zeiss</td>
			<td style="width:197px;">Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Counting Microscope</td>
			<td style="width:201px;">Olympus</td>
			<td style="width:197px;">CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Neural Basal-A Medium</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:197px;">10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">B27</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:197px;">17404-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Penicillin- Streptomycin</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:197px;">15070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">L- Glutamine</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:197px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">DMEM</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:197px;">12100046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">F12</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:197px;">12700075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">30% Glucose</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">G6152</td>
			<td>1M- 9.01g in 100mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">1M Glucose</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">7.5% NaHCO3</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">S5761</td>
			<td>155mM- 1.30g in 100mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">155mM NaHCO3</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">H3375</td>
			<td>23.83 g in 100mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Apo-Transferrin</td>
			<td style="width:201px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:197px;">3188-AT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Putrescine&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">P7505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Insulin</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Selenium</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Progesterone</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">P6149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Papain Dissociation System&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:197px;">PDS</td>
			<td>1 vial of papain can be used for 2 samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:197px;">PMG8041</td>
			<td>Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Fibroblast Growth Factor</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:197px;">PHG0226</td>
			<td>Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Heparin</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td style="width:201px;">In House</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">24 well Plates</td>
			<td style="width:201px;">NUNC</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">2M NaCl</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">S5886</td>
			<td>11.69g in 100mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">1M KCL</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">P5405</td>
			<td>7.46g in 100mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">1M MgCl2</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">M2393</td>
			<td>20.33g in 100mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">108mM CaCl2</td>
			<td style="width:201px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:197px;">C7902</td>
			<td>1.59g in 100mL dH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a neurosphere assay to evaluate endogenous neural stem cell activation in a mouse model of minimal spinal cord injury

大人の哺乳類の脊髄における神経幹細胞 (NSCs) は、勉強できる体外neurosphere アッセイを用いた脳室周囲細胞の有糸分裂比較的静止人口です。このコロニー形成アッセイは NSCs の料理で外因性の要因に対する反応を研究するための強力なツールしかし、これも使える強みの適切な理解と分析の限界と生体内での操作の影響を検討します。臨床的関心の 1 つの操作は、活性化 NSC 内因性傷害の効果です。脊髄損傷の現在のモデルは、挫傷、圧縮、および断裂の一般的なモデルの重大度は、幹細胞が存在する傷害のサイトで NSC ニッチの破壊を引き起こすこの研究への挑戦を提供します。ここでは、成体マウスの脊髄 (T7/8) の下位胸椎レベルの表面的な背側表面でローカライズされた損傷を引き起こす最小損傷モデルをについて説明します。この損傷モデルは傷害のレベルで中心部の運河をスペアし、傷害に続く様々 な時点で病変のレベルで存在する NSCs の解析が可能します。ここで、NSCs プリミティブと決定的な NSCs 脊髄脳室周囲地域内に存在する 2 つの異なる、後月関連集団の活性化を研究する neurosphere アッセイを利用できる方法を紹介 (pNSCs と dNSCs、それぞれ)。我々 は分離し、傷害および白質傷害のサイトのレベルで脳室周囲領域からこれらの NSCs を文化をデモンストレーションします。私たち手術後脊髄の解剖は、pNSC とコントロール、けがを介して、活性化に話すと比較して負傷したコードの脳室周囲の地域から dNSC 由来神経幹細胞の数の増加を示します。さらに、外傷後に、dNSC 由来の神経幹細胞分離できます傷害のサイトから-彼らの脳室周囲のニッチから傷害のサイトに移行する NSCs の能力を示します。

術後では、マウス尾と 24 h までの可能な限りの後肢麻痺を含む最小限の運動障害を体験してください。この後、マウスを体験する後肢麻痺麻痺や歩行の変化は最小限。
図 3は、最小限の脊髄損傷後 5 日 neurosphere アッセイから代表的な結果を示しています。(EFH 産) dNSC 由来神経幹細胞の絶対数が傷害?...

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A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

最小限の脊髄損傷のマウス モデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ

ここでは、我々 は、スペアの中央運河ニッチ住宅内因性神経幹細胞 (NSCs) 大人のマウスの最小限の脊髄損傷モデルの性能を発揮します。Neurosphere アッセイを使用してアクティブ化および傷害に続く決定的な原始的な NSCs の移行を定量化する方法を紹介します。

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

a-neurosphere-assay-to-evaluate-endogenous-neural-stem-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.8K ビュー.  University of Toronto. ここでは、我々 は、スペアの中央運河ニッチ住宅内因性神経幹細胞 (NSCs) 大人のマウスの最小限の脊髄損傷モデルの性能を発揮します。Neurosphere アッセイを使用してアクティブ化および傷害に続く決定的な原始的な NSCs の移行を定量化する方法を紹介します。

ビデオ: A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

神経科学

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

神経コロニー形成細胞アッセイ：神経前駆細胞から善意の神経幹細胞を区別するアッセイ

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

横方向の流体のパーカッション：マウスにおける外傷性脳損傷のモデル

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

アン<em&gt;エクスビボ</em&gt;レーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

マウスにおける線込みおよび脊髄窓移植

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

マウスにおける完全なトランセクション型脊髄損傷の誘導

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

最小限の脊髄損傷のマウス モデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ

最小限の脊髄損傷のマウスモデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ