我々のプロトコルは、脳損傷後のヒト誘発多能性幹細胞の治療効果をテストするための包括的な前臨床ワークフローを示している。この外傷性脳損傷モデルは、機械的な力のパラメータを厳密に制御し、明確に定義された傷害を提供することによって、高度な汎用性と再現性を提供します。これらの手順は、他の脳領域における傷害および回復過程を研究するために使用することができ、移植方法は、多くの細胞タイプで使用することが可能である。
頭蓋掘削は、適切な圧力、速度、深さ、滑らかな動きを習得するために手作業の器用さが必要であるため、困難です。すべてのイベントを記録し、広範囲に練習します。一方的なクラニエクトミーを行うために、麻酔マウスのつまみつまみに対する応答の欠如を確認し、ステレオタキシックフレームでマウスを固定します。
抗生物質の眼軟膏を、剃った頭皮領域に無菌綿棒とヨウ素ベースの溶液で目に塗布する。70%エタノールでヨウ素を取り除き、フェネレートされた外科用ドレープで動物を覆います。頭皮に1.5〜2センチメートルの中線切開を行い、生殖不能綿棒を使用して傷をきれいにし、ブレグマで中線の左の鼻隠しをクリアします。
エコンサイクサプローブを使用してクラニエクトミーサイトを識別し、xがゼロに等しく、yはゼロステレオタキシック基準点をbregmaに設定します。プローブを正線の左 2 ミリメートルに横に調整します。微細な先端の外科的に安全なマーカーを使用して、推定衝撃領域の周りに直径5ミリメートルの円をランドマーク化します。
エコンターを上げて回転させて5ミリの円を完成させます。5ミリメートルの円の精度を確認するために、インコンサイターを簡単に位置に戻します。次に、インコンパクタを位置から上げ、回転させ、円形の先端0.6または0.8ミリメートルのバリドリルビットを装備した高速回転式マイクロモーターキットハンドツールを使用して、70〜80%の最高速度で頭蓋骨に開いた穴を作ります。
この境界内の 5 ミリメートル周縁の輪郭に沿ってドリルしながら、頭蓋骨に光圧を適用し、鉗子を使用して得られたボーン フラップを持ち上げます。縫合線を通して掘削は骨が中断され、追加の圧力を必要とするので、追加の困難を提示するかもしれない。血管は密接に関連している可能性があるため、出血イベントが発生する可能性があります。
軽度の制御された皮質衝撃損傷を誘発するには、無菌アルコール準備パッドでインシクタプローブを洗浄し、露出した皮質の上の位置にインポジションプローブを戻します。プローブをデュラマーターサーフェスに触れるまで下げ、この位置を z がゼロに等しいマークします。ピストンを引き出し、z等しいマイナス1ミリメートルに移動し、コルテックスに影響を与えるためにピストンを排出します。
すぐにピストンを上げ、位置から腕を動かし、生理食い物の寛大なボリュームで皮質を灌漑し、頭皮の切開を閉じるために簡単な中断されたステッチと5-0シルク縫合糸を使用します。その後、スクラフに皮下注射によってシクロスポリンAのキログラム当たり10ミリグラムを提供し、完全な回復まで監視してきれいな前温めの術後ケージにマウスを置きます.クラニエクトミーの約24時間後、マウスをステレオタキシックフレームに戻します。
フェネストされた外科のドレープでマウスを覆う。切開部位を滅菌生理的に洗浄し、部位をきれいにし、縫合糸を緩める。70%エタノール浸漬綿棒を使用して、切開部位を優しく殺菌し、細かいピンセットと眼科用はさみを使用して縫合糸を取り除きます。
その後、豊富な無菌生理学で手術とクラニエクトミー部位を灌漑します。細胞培養バイオセーフティフードでは、細胞のチューブを穏やかに旋回またはタップして、均質な細胞懸濁を確実にします。マイクロピペットを使用して、プランジャーエンドを通して約7.5マイクロリットルの細胞をハミルトン注射器にロードします。
プランジャの端を下にして120度の角度でシリンジを保持し、サスペンションとプランジャーチップの間に気泡を導入しないように気をつけてプランジャーを挿入します。ガスケットアセンブリをピペット針に取り付け、針を注射器に取り付けます。プランジャーを押して細胞懸濁液をピペット針に移動させ、シリンジを立体性シリンジポンプに取り付けます。
プランジャーを進めて、シリンジポンプアセンブリが正常に動作していることを確認し、注射用の座標に針を移動します。針先をブレグマに合わせ、x 座標と y 座標を 0 に設定します。針の先端を針切除術の上に2ミリメートル横向きに移動し、後方から1ミリメートルを引いた後方をブレグマに移動し、針の先端を硬膜の表面に触れます。
針を少し上げて、針が接触した場所で硬膜に小さな切開を行います。ステレオタキシック座標をz等しいゼロに設定し、プランジャーを押して細胞懸濁液が適切に流れているか確認してから、針を脳に導入します。深皮質の灰色物質/白質の境界に移植片を配置するためにz等しいzの深さに脳に針を導入します。
シリンジポンプを起動して、15分間にわたって細胞懸濁液を注入します。長い作動距離の顕微鏡を使用して、組織の水分補給を維持するために、注射中に生殖不能生理食塩水で手術部位を灌漑する細胞懸濁液流出を監視する。すべての細胞が送達されたら、移植針をゆっくりと引き出し、新しい縫合糸で切開を閉じる前に追加の生理的な生理布で手術部位を灌漑する。
その後、実証されているように術後のケアを提供します。粘着テープの取り外し試験では、まず小さなカミソリナイフを使用して、滑らかなガラス表面に3×5ミリメートルのストリップに黄色と赤の電気テープをカットします。マウスを試験の前に少なくとも30分間行動検査室に持ち込み、ハンドリングクロスを使用して首と背中の擦り傷でマウスを拘束し、マウスが前足を体と頭から遠ざけます。
ピンセットを使用して各前足の足底面に粘着ストリップを配置し、繊細で一貫した指圧を使用して足にストリップを固定します。マウスがプラスチック製の試験ボックスに4本の足をすべて持っている場合は、マウスを素早くプラスチックシリンダーに入れ、2つのストップウォッチを開始します。その後、左足通知、左足の除去、右足の通知と右足の除去のための遅延を記録するために2つのストップウォッチを使用しています。
本試験実験では、前肢機能をクラニエクトミー単独で比較し、皮質衝撃損傷およびナイーブマウスを制御した。手術を受けたマウスは、手術直後から1〜3日間の粘着刺激に気づくために一時的な遅延が増加し、イピラテラジラエポーからの粘着除去における一過性術後の欠損を示した。しかし、制御された皮質の影響を受けたマウスは、術後28日目のナイーブマウスと比較して、前足の運動性能に有意な欠陥を示した。
ヒト核抗原に対するマウス脳切片の免疫染色は、ヒト細胞移植片がSHAM傷害および制御された皮質影響脳における宿主組織と明確に区別できることを明らかにする。培養ヒト細胞を扱う場合や、げっ歯類や免疫抑制薬に接触する注射針を扱う場合は、標準的な検査室の安全手順を遵守する必要があります。脳組織切片は、移植片が宿主組織傷害反応に及ぼす影響を知ることは価値があるため、神経炎症マーカーの発現について分析することができる。
私たちは、傷害後の行動の結果に微妙な性差を見つけて驚きました。私たちは現在、性が脳損傷に対する神経免疫反応に役割を果たしているかどうかを調査しています。安定した手、忍耐、そして練習は良いクラニエクトミー技術を開発するために重要です。
不適切なクラニエクトミーによる副次的損傷は、細胞移植の対象とする領域を損なう可能性があります。
