Name: direct induction of human neural stem cells from peripheral blood hematopoietic progenitor cells
Uploaded: 2015-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
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The authors have no conflicts of interest to disclose.

アダルト全血から造血前駆細胞の1濃縮 NOTE：造血前駆細胞またはCD34 +細胞は、臍帯血、白血球搬出材料と密度勾配遠心分離に基づく方法を用いて全血を含む種々の供給源から誘導される末梢血単核細胞（PBMC）から精製することができる。ここに記載されている方法は、一例として、全血を使用しています。 <ol><li>全血由来のPBMCの単離： <ol><li>挿入物の中心孔を通してそれをピペッティングすることによりSepMateチューブにリンパ球分離培地の4.5ミリリットルを追加します。 </li><li> 2％ヒト血清を含有する滅菌DPBS等量の血液サンプルを希釈（v / v）である。例えば、DPBS + 2％ヒト血清5mlの試料を5mlに希釈。 </li><li>チューブの側面をそれを下にピペッティングすることによって希釈されたサンプルを追加します。中央の穴を通って直接サンプルを注ぐないように注意してください。 </li><li>室温で10分間1200×gで遠心分離する。 </li><li>慎重にPMBC層の上の上清を除去。 </li><li>新しいチューブにPBMC層（曇り）を収集します。 </li><li>ブレーキをオフにして、室温で10分間150×gでチューブと遠心分離機に2％のヒト血清を含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）の15ミリリットルを追加します。 </li><li>上清を捨て、2％ヒト血清を含有するDPBS 15mlにペレットを再懸濁。セルの数を数える。 </li><li>室温で10分間690×gで遠心分離する。チューブから全ての上清を取り除きます。 </li><li> 15 1％抗生物質を含有するイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）の溶液（v / v）を、10％ヒト血清あたり1×10 7個の細胞で細胞を再懸濁し（v / v）である。 </li><li> CD34 +細胞を単離する前に、5％CO 2インキュベーター中でO / N、37℃で細胞をインキュベートする。 </li></ol></li><li> CD34マルチソートキットを使用したPBMCからCD34 +細胞のポジティブ選択： 注：高速の仕事と冷たい細胞を作るために予め冷却したソリューションを使用し、キャッピングを防ぐキット命令当たりの細胞表面と非特異的細胞標識に対する抗体の。 <ol><li> 50ミリリットルチューブ内のすべてのPMBCを収集し、培地中の全細胞の数を数える。 </li><li> 10分間300×gで細胞を遠心します。完全にすべての上清を取り除きます。 </li><li>ビーズ緩衝液中の300μlのあたり10 8細胞（0.5％ヒト血清（v / v）のおよび2mM EDTAを含有するDPBS）まで再懸濁する。 </li><li>のFcRブロッキング試薬を100μlを追加し、CD34のMultiSortMicroBeads100μlのを追加します。 </li><li>よく混ぜ、冷蔵庫で30分間インキュベートする（2から8℃）。 </li><li> RTで10分間、300×gで10 8細胞遠心あたりのビーズ緩衝液2mlを添加して細胞を洗浄する。完全に上清を除去します。 </li><li>緩衝液500μl中に10 8細胞まで再懸濁する。 </li><li> MACSセパレーターの磁場中MACS LSカラムを配置し、ビーズバッファーの3ミリリットルですすぐことにより、カラムを準備します。 </li><li> CENTE上に細胞懸濁液を適用します列のR。未標識細胞が好ましい場合に収集することができるが流れる。 </li><li>洗浄カラムビーズ緩衝液3mlで3回洗浄する。 </li><li>セパレーターから列を削除し、15ミリリットルチューブの上に置きます。 </li><li>カラムにビーズ緩衝液5mlを加え、すぐにカラム内にプランジャーを押すことで、磁気標識された細胞を洗い流す。 </li><li>細胞懸濁液の1ミリリットルあたりのマルチソートリリース試薬20μlのを追加します。よく混ぜ、冷蔵庫で10分間インキュベートする（2から8℃）。 </li><li> 10 7個の細胞あたりのビーズ緩衝液2mlと室温で10分間300×gで細胞を遠心- 1を追加します。完全に上清を除去します。 </li><li> 10 7個の細胞あたりビーズ緩衝液50μlに再懸濁細胞。 </li><li> 10 7細胞あたりのマルチソート停止試薬30μlのを追加し、冷蔵庫で15分間インキュベートする。 </li><li>ビーズ緩衝液5mlを加え、室温で10分間300×gで細胞を遠心する。上清を捨てる。 </li></ol></li></ol> CD34 +細胞から誘導した神経幹細胞の2導出<ol><li> CD34 +細胞の培養： 注：冷蔵庫に保存した場合、新たに調製した培地は7日以内に使用する必要があります。重要なCD34細胞損失は、24時間後に観察することができたが、細胞数が連続的に減少または全く増殖がない場合、細胞の有意な増殖は、特に5日後に、顕著であるべきで、それは悪い培地またはCD34の細胞質と細胞のいずれかを意味する次のステップのために使用すべきではありません。 <ol><li>再懸濁し、培養CD34 + CD34の細胞は（ステムスパンSFEMヒトトロンボポエチンを含む培地（TPO、100 ng / ml）を、fms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）リガンド（100 ng / ml）を培地に維持し、幹細胞因子（SCF、 24ウェルプレート中で100 ng / ml）を、インターロイキン-6（IL-6を20ng / ml）およびインターロイキン-7（IL-7、20 ng / ml）を）（3×10 5 /ウェルまで5％CO 2インキュベーター中で37℃にてウェルあたり1mlの培地）。 </li><li> AFTER 24時間は、浮遊細胞を収集し、接続されているすべての細胞と細胞の破片を取り除くために、室温で110×gで細胞を遠心する。上清を捨て、さらに5日間で5％CO 2インキュベーター中、37℃で新しい24ウェルプレート（ウエルまでの1×10 5 /）に新鮮なCD34の維持培地と種子の1ミリリットル中に細胞を懸濁します。 </li><li> CD34 +細胞がウェル（ 図1A）の底に浮かんでいる間に慎重に上清の上半分を吸引することにより、一日おきに培地の半分を交換してください。 </li></ol></li><li>センダイウイルストランスフェクション： <ol><li> 5日目に、CD34の細胞を採取し、室温で10分間170×gで細胞を遠心する。上清を捨てる。 </li><li>培地1ml中、1×10、5 /ウェルで24ウェルプレート中の新鮮な培地中に細胞を再懸濁。 </li><li>最初の10秒間37℃の水浴中でチューブの底部に浸漬することによりcytotune-のiPS仙台書き換えキットを解凍した後、完全に解凍T RT。簡単に言えば、チューブを遠心し、氷の上に置く。該当ロットの分析証明書（COA）に記載されている各ウイルスの推奨される量を混合することにより、センダイウイルス液を調製する。 MOI 15を推奨します。 </li><li> CD34細胞の各ウェルにセンダイウイルスミックスを追加します。静かに振とうして井戸を混ぜる。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。 </li><li> 24時間後にトランスフェクション効率を観察します。細胞集合体と球の形成に成功したトランスフェクション（ 図1B）のための指標であることに注意してください。 </li><li>慎重によく別の媒体の上半分を転送することにより、培地の半分を変更します。新しいウェル中の細胞球が存在する場合、新鮮な培地と同じ量を追加する。 </li><li>ステップ2.2.6を繰り返して、他の日ごとに培地を変更します。 </li></ol></li><li>神経幹細胞の誘導。 注：細胞条件に依存して、約5または7日間トランスフェクション後、単層接着細胞30に到達する -50％のコンフルエンス（ 図1C）。 <ol><li>栄養混合物F-12 1X N2サプリメント、0.1％（w / v）のウシ血清アルブミンを含む（DMEM / F12）、（：（ダルベッコ改変イーグル培地浮遊細胞と球を含有する上清を外し、神経前駆培地の1ミリリットルを追加BSA）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）の1％（v / v）の抗生物質、20ng / mlの、および上皮成長因子（EGF）の20 ng / ml）を接着細胞に。 </li><li>必要に応じて、静かにピペッティングして細胞球を解離し、10分間170×gで細胞を遠心する。上清を除去し、アップするなどのバック命令あたりのマトリゲルでコーティングされた新しい24ウェルプレート中の神経前駆培地1mlで細胞を懸濁します。 </li><li>通常1週間後に、80％コンフルエント - 細胞が60に達するまで、一日おきに培地を変更します。 </li><li>上清を捨て、神経幹細胞培地（無血清培地、NSC SFM）の1ミリリットルを追加。続いて、細胞スクレーパーを用いて細胞を解離非常に穏やかにピペッティングすることによって。 </li><li>細胞を除去し、6ウェルプレートの1ウェルにそれらのすべてをシードする。神経幹細胞培地の別の1mlを各ウェルに2mlのメディアを作るために加える。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。 </li><li>先日の媒体ごとに変更します。 </li><li> 2.3.4と2.3.6の手順に従って：3の比率の細胞が60％コンフルエンスに達したとき、1で細胞を解離し、replate。 </li></ol></li><li>神経幹細胞の凍結。 <ol><li>神経幹細胞培地に、20％ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加することにより凍結培地神経幹細胞を調製する。氷上で凍結培地にしてく​​ださい。 </li><li>穏やかにピペッティングし、その後、細胞スクレーパーを用いて、6ウェルプレート中の細胞を解離する。細胞を数える。 RTで10分間、170×gで細胞を集める。上清を捨てる。 </li><li> 1×10 6 / mlの濃度で神経幹細胞培地中で細胞を再懸濁。細胞に凍結培地の同じボリュームを追加します。 </li><li> 1ミリリットル（5×1を追加します。クライオバイアル内の細胞の0〜5の全細胞）。命令の次氏Froster冷凍コンテナを用いて細胞を凍結する。 </li></ol></li></ol> 3.神経細胞の分化<ol><li>神経細胞の分化： <ol><li>神経幹細胞が80％コンフルエンスに達したときに、ラバーポリスマンを用いて神経幹細胞を剥離した後、穏やかにピペッティングすることにより解離する。 </li><li>細胞をカウントし、神経幹細胞培地中で1×10 5 / mlに濃度を調整する。 </li><li>ニューロン分化のために、1×10で5 /ウェルで24ウェルプレートにカバースリップをコーティングし、ポリ-D-リジン/ラミニン上で細胞をプレー。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。 </li><li>神経分化培地で培地を交換して1×N2サプリメント、1×B27サプリメント、300 / mlのcAMPを、0.2mMのビタミンC、10ng / mlの脳由来神経栄養因子（BDNF）と派生10ng / mlのグリア細胞を含む（DMEM / F12神経栄養因子（GDNF））のaf24時間TER。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。 </li><li> 2週間、週に2回の神経分化培地を変更します。 </li></ol></li><li>アストログリア分化： <ol><li>ピペッティングにより神経幹細胞を解離する。 </li><li>細胞を計数し、5×10 4細胞/ mlに細胞濃度を調整する。 24ウェルプレート上に細胞を播種する。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。 </li><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM / F12に培地を交換し、5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベートする。 </li><li> 2週間、週に2回培地を変更します。細胞は2週間前に合流に達した場合は、ステップ3.2.1と3.2.2以下の細胞をreplate。 </li></ol></li><li>オリゴデンドロサイト分化： <ol><li>ピペッティングにより神経幹細胞を解離する。 </li><li>オリゴデンドロサイトdifferenti 1mlの細胞および種子ポリ-L-オルニチンコーティングした24ウェルプレートに1×10 5個の細胞を計数、N2補充を含むDMEM / F12の血小板由来成長因子AA（PDGF-AA）、10ng / mlの、ニューロトロフィン-3（NT-3）の2 ng / mlの、ソニックヘッジホッグの2 ng / mlのからなるATION培地（ SHH）、及びトリヨードサイロニン（T3の3 nM）を有する。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。 </li><li> 2週間、週に2回培地を変更します。 </li><li> 1xN2サプリメントとミエリン塩基性タンパク質（MBP）生産のためのT3と文化の3 nMの追加の週のための細胞を含むDMEM / F12を含む培地を交換してください。 </li></ol></li></ol> 4.免疫蛍光染色<ol><li> 4％パラホルムアルデヒド（PFA）でメディアを交換してください。 RTで10分間インキュベートする。 </li><li> PFAを破棄し、PBS、0.1％トリトンX-100（PBS-T）で3回、5分毎に時刻を含む洗浄する。 </li><li> PBSで室温で10分間、0.5％トリトンX-100を含有する細胞を透過。 </li><li> PBS-Tを室温で20分間、4％ヤギ血清を含むPBSで細胞をブロックする。 </li><li>対応する主antiboで細胞をインキュベート低温室でRTまたはO / Nで2時間、0.1％BSAを含むPBS-Tで希釈したダイ。 </li><li> PBS-Tで3回、5分毎の時間のために細胞を洗浄する。暗所にてシェーカー上で1時間0.1％BSAを含むPBS-Tで希釈400：1を用いて蛍光色素と結合した二次抗体に対応する細胞をインキュベートする。 </li><li> RTで10分間、4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を含有するPBS-Tで細胞を洗浄する。 </li><li> RTで5分間ずつPBS-Tで細胞を2回以上洗う。 </li><li>顕微鏡を用いて標識された細胞を観察し、撮影した写真（ 図3）。 </li></ol>

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The study is funded by NIH intramural funds.

直接末梢造血前駆細胞から神経幹細胞を生成するための詳細なプロトコルが提供される。 線維芽細胞と比較して、ヒト末梢血よりアクセス可能である。提示プロトコル以上1×10 5、造血前駆細胞、またはCD34陽性細胞を用いて、全血を10mlから濃縮することができる。血小板の汚染は、通常、予防されないが、それは容易に低速遠心分離によって低減することができ...

in vitroで神経細胞培養物は、神経疾患の研究のための基本的なツールとして使用されてきた。主要な動物（主にげっ歯類）神経培養1,2および神経膠腫又は他の腫瘍に由来するヒト神経細胞株は、最も一般的に使用されるような研究である。しかし、げっ歯類およびヒト細胞の間に有意な差があることが認識されている。げっ歯類に基づいた多くの発見は、ヒトに翻訳することができません。さらに、大量のゲノム情報と、比較的容易な遺伝子編集と全ゲノム配列の解析の急速な発展に、傾向はますますギヤード少数の人間の神経細胞を作るもの、病気がちの遺伝子を発見し、特定の疾患で、その機能と役割の輪郭を描くのです。細胞株は、唯一の利用が限られている。理論的には、患者の神経系のサンプル由来のヒト初代神経培養は、最良の選択であるが、それらを得ることは不可能である。したがって、代替メタODSが必要である。近年、いくつかのアプローチは、2つの最も識別可能で、追求されてきた。マウスおよびヒトの体細胞の3、4を用いて誘導多能性幹細胞（IPSC）を生成する技術の開発に続いて、神経細胞は、さらにそれら5-7と区別することができた。しかし、生成しIPSCを特徴づけることは労働集約的、技術、および時間の入力を要求し、時には法外。直後に、別のアプローチは、直接体細胞8,9から神経細胞を形質転換するために開発された。得られた神経細胞は非増殖性であるので、それは、大量の細胞を必要とする、集中的な研究及び薬物スクリーニングにおけるその適用を制限している。両方の技術の利点を取るためには、体細胞から神経幹/前駆細胞の直接の導出は、いくつかのグループによって10〜12を検討されている、IPSCの生成および特性の退屈なプロセスをバイパスし、それでも専らいるDES後で神経分化のための神経幹細胞のまともな数。我々は以前、造血前駆細胞への山中転写因子の導入に続いて、神経幹細胞は直接培地13を選択する神経前駆細胞を用いて生成することができることを示している。ここでは、詳細に方法を報告している。

<table><tbody><tr><td>Lymphocyte separation medium</td><td>Lonza</td><td>17-829E</td><td>1x</td></tr><tr><td>SepMate</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15415</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Human serum</td><td>Invitrogen</td><td>34005-100</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>1%</td></tr><tr><td>CD34 MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-056-701</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Cellgro</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MACS LS column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9650</td><td>1x</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112-035-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Flt-3</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IPS Sendai Reprogramming Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>CryoTube vials</td><td>Thermo</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty container</td><td>Thermo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12400-024</td><td>1x</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>1x</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2934</td><td>0.1% (w/v)</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>NSC serum free medium</td><td>Life Technologies</td><td>A1050901</td><td>1x</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine/laminin coated cover slips</td><td>BD Bioscences</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A9501</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>Vitamin C</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td>0.2 mM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>1x</td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>Shh</td><td>Peprotech</td><td>1314-SH/CF</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>3 nM</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>4%</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-Nestin</td><td>Millipore</td><td>AB5922</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Anti-SOX2 antibody</td><td>Applied Stemcell</td><td>ASA0120</td><td>Ready to use</td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;beta;III-tubulin antibody</td><td>Promega</td><td>G712A</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFAP antibody</td><td>Sigma</td><td>G4546</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>Anti-O4 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1326</td><td>IgM; 1 ng/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody</td><td>Life techniologies</td><td>A11012</td><td>1:400 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody</td><td>Life techniologies</td><td>A11001</td><td>1:400 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody</td><td>Life techniologies</td><td>A21042</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &amp;mu;g/ml</td></tr></tbody></table>

direct induction of human neural stem cells from peripheral blood hematopoietic progenitor cells

ヒトの疾患の特定の神経細胞培養は、人間の神経疾患のためのin vitroモデルの生成に不可欠である。しかし、初代ヒト成体神経の文化へのアクセスの欠如が固有の課題を提起する。誘導多能性幹細胞（IPSC）における最近の開発は、患者固有のIPSCを通して皮膚線維芽細胞からの神経培養物を導出するための別のアプローチを提供するが、このプロセスは労働集約的で、特別な専門知識と大量のリソースを必要とし、数ヶ月かかることがあります。これは神経疾患の研究にこの技術の幅広いアプリケーションを防ぎます。これらの問題のいくつかを克服するために、我々は、IPSC導出処理をバイパスして、直接ヒト成人末梢血から神経幹細胞を誘導するための方法を開発した。ヒト成人末梢血から濃縮造血前駆細胞をin vitroで培養し、転写因子Sox2の、10月を含むセンダイウイルスベクターでトランスフェクト3/4、Klf4及びc-Myc。さらに、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および血管内皮増殖因子（VEGF）を含むヒト神経前駆細胞培地を用いて選択された細胞の形態変化でのトランスフェクションの結果。得られた細胞は、ネスチンおよびSOX2などの神経幹細胞マーカーについての発現によって特徴づけられる。これらの神経幹細胞は、さらに指定された分化培地でニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞に分化することができる。簡単にアクセスできるヒト末梢血サンプルを用いて、この方法は、神経疾患のin vitroモデル化のための神経細胞へのさらなる分化のために神経幹細胞を誘導するために使用することができ、これらの疾患の病因及び治療 ​​に関連した研究を進めることができる。

<html> CD34細胞の品質は、神経幹細胞の形質導入の成功のために重要である。高品質のCD34細胞は、培養の日の最初のカップルの間に増殖し、ちょうど培養容器（ 図1A）の底の上にフローティング、非粘着性、均一に円形細胞として表示されます。拡大と関連が緩んでいる非特定の細胞凝集体は、細胞培養中に発生する可能性がありながら、時間（ 図1B）上で展開する細...

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Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.4K ビュー.  National Institutes of Health. この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。 

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Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro is essential for mechanistic studies of the endothelial-hematopoietic transition and hematopoietic specification. Here, we describe a method for the efficient induction of HE from human pluripotent stem cells (hPSCs) by way of overexpression of different sets of transcription factors. The combination of ETV2 and GATA1 or GATA2 TFs is used to induce HE with pan-myeloid potential, while a combination of GATA2 and TAL1 transcription factors allows for the production of HE with erythroid and megakaryocytic potential. The addition of LMO2 to GATA2 and TAL1 combination substantially accelerates differentiation and increases erythroid and megakaryocytic cells production. This method provides an efficient and rapid means of HE induction from hPSCs and allows for the observation of the endothelial-hematopoietic transition in a culture dish. The protocol includes hPSCs transduction procedures and post-transduction analysis of HE and blood progenitors.

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

発生生物学

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine induced differentiation of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells to the four myeloid lineage cells. CD34+ cells are isolated from human umbilical cord blood and co-cultured with MS-5 stromal cells in the presence of cytokines. Immunophenotypic characterization of the stem and progenitor cells, and the differentiated myeloid lineage cells are described. Using this protocol, CD34+ cells may be incubated with small molecules or transduced with lentiviruses to express myeloid disease mutations to investigate their impact on myeloid differentiation.

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Here, we present a protocol for immunophenotypic characterization and cytokine induced differentiation of cord blood derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells to the four myeloid lineages. The applications of this protocol include investigations on the effect of myeloid disease mutations or small molecules on myeloid differentiation of the CD34+ cells.

ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞のパンミエロイド分化

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

神経科学

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

生物学

Generation of Neuronal Cells from Blood-Derived Pluripotent Stem Cells

Source: Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61634">GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates a technique to generate neuronal cells from blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs). The BD-PSCs are obtained via reprogramming blood progenitor cells. The undifferentiated BD-PSCs are cultured on cell culture substrate-coated coverslips using a neural induction medium and a neural differentiation medium, triggering differentiation into cells with a neuronal phenotype.

血液由来多能性幹細胞からの神経細胞の生成

Ethic approvals were obtained when performing the experiments.
1. Isolation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs)

	Ensure that all donors ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

神経細胞培養技術

一次神経細胞培養

Generation of Induced Neural Stem Cells (iNSCs) from Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMNCs): A Sendai Virus-based Procedure to Reprogram PBMNCs into iNSCs

Source: Zheng, W. et al. <a href="https://www.jove.com/video/59690" target="_blank">Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019)
This video demonstrates the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) into induced neural stem cells (iNSCs) using Sendai virus. Sendai virus is a non-integrating virus that offers an efficient and safe vehicle for reprogramming cells.