The authors have no conflicts of interest to disclose.

アダルト全血から造血前駆細胞の1濃縮 NOTE：造血前駆細胞またはCD34 +細胞は、臍帯血、白血球搬出材料と密度勾配遠心分離に基づく方法を用いて全血を含む種々の供給源から誘導される末梢血単核細胞（PBMC）から精製することができる。ここに記載されている方法は、一例として、全血を使用しています。 <ol><li>全血由来のPBMCの単離： <ol><li>挿入物の中心孔を通してそれをピペッティングすることによりSepMateチューブにリンパ球分離培地の4.5ミリリットルを追加します。 </li><li> 2％ヒト血清を含有する滅菌DPBS等量の血液サンプルを希釈（v / v）である。例えば、DPBS + 2％ヒト血清5mlの試料を5mlに希釈。 </li><li>チューブの側面をそれを下にピペッティングすることによって希釈されたサンプルを追加します。中央の穴を通って直接サンプルを注ぐないように注意してください。 </li><li>室温で10分間1200×gで遠心分離する。 </li><li>慎重にPMBC層の上の上清を除去。 </li><li>新しいチューブにPBMC層（曇り）を収集します。 </li><li>ブレーキをオフにして、室温で10分間150×gでチューブと遠心分離機に2％のヒト血清を含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）の15ミリリットルを追加します。 </li><li>上清を捨て、2％ヒト血清を含有するDPBS 15mlにペレットを再懸濁。セルの数を数える。 </li><li>室温で10分間690×gで遠心分離する。チューブから全ての上清を取り除きます。 </li><li> 15 1％抗生物質を含有するイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）の溶液（v / v）を、10％ヒト血清あたり1×10 7個の細胞で細胞を再懸濁し（v / v）である。 </li><li> CD34 +細胞を単離する前に、5％CO 2インキュベーター中でO / N、37℃で細胞をインキュベートする。 </li></ol></li><li> CD34マルチソートキットを使用したPBMCからCD34 +細胞のポジティブ選択： 注：高速の仕事と冷たい細胞を作るために予め冷却したソリューションを使用し、キャッピングを防ぐキット命令当たりの細胞表面と非特異的細胞標識に対する抗体の。 <ol><li> 50ミリリットルチューブ内のすべてのPMBCを収集し、培地中の全細胞の数を数える。 </li><li> 10分間300×gで細胞を遠心します。完全にすべての上清を取り除きます。 </li><li>ビーズ緩衝液中の300μlのあたり10 8細胞（0.5％ヒト血清（v / v）のおよび2mM EDTAを含有するDPBS）まで再懸濁する。 </li><li>のFcRブロッキング試薬を100μlを追加し、CD34のMultiSortMicroBeads100μlのを追加します。 </li><li>よく混ぜ、冷蔵庫で30分間インキュベートする（2から8℃）。 </li><li> RTで10分間、300×gで10 8細胞遠心あたりのビーズ緩衝液2mlを添加して細胞を洗浄する。完全に上清を除去します。 </li><li>緩衝液500μl中に10 8細胞まで再懸濁する。 </li><li> MACSセパレーターの磁場中MACS LSカラムを配置し、ビーズバッファーの3ミリリットルですすぐことにより、カラムを準備します。 </li><li> CENTE上に細胞懸濁液を適用します列のR。未標識細胞が好ましい場合に収集することができるが流れる。 </li><li>洗浄カラムビーズ緩衝液3mlで3回洗浄する。 </li><li>セパレーターから列を削除し、15ミリリットルチューブの上に置きます。 </li><li>カラムにビーズ緩衝液5mlを加え、すぐにカラム内にプランジャーを押すことで、磁気標識された細胞を洗い流す。 </li><li>細胞懸濁液の1ミリリットルあたりのマルチソートリリース試薬20μlのを追加します。よく混ぜ、冷蔵庫で10分間インキュベートする（2から8℃）。 </li><li> 10 7個の細胞あたりのビーズ緩衝液2mlと室温で10分間300×gで細胞を遠心- 1を追加します。完全に上清を除去します。 </li><li> 10 7個の細胞あたりビーズ緩衝液50μlに再懸濁細胞。 </li><li> 10 7細胞あたりのマルチソート停止試薬30μlのを追加し、冷蔵庫で15分間インキュベートする。 </li><li>ビーズ緩衝液5mlを加え、室温で10分間300×gで細胞を遠心する。上清を捨てる。 </li></ol></li></ol> CD34 +細胞から誘導した神経幹細胞の2導出<ol><li> CD34 +細胞の培養： 注：冷蔵庫に保存した場合、新たに調製した培地は7日以内に使用する必要があります。重要なCD34細胞損失は、24時間後に観察することができたが、細胞数が連続的に減少または全く増殖がない場合、細胞の有意な増殖は、特に5日後に、顕著であるべきで、それは悪い培地またはCD34の細胞質と細胞のいずれかを意味する次のステップのために使用すべきではありません。 <ol><li>再懸濁し、培養CD34 + CD34の細胞は（ステムスパンSFEMヒトトロンボポエチンを含む培地（TPO、100 ng / ml）を、fms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）リガンド（100 ng / ml）を培地に維持し、幹細胞因子（SCF、 24ウェルプレート中で100 ng / ml）を、インターロイキン-6（IL-6を20ng / ml）およびインターロイキン-7（IL-7、20 ng / ml）を）（3×10 5 /ウェルまで5％CO 2インキュベーター中で37℃にてウェルあたり1mlの培地）。 </li><li> AFTER 24時間は、浮遊細胞を収集し、接続されているすべての細胞と細胞の破片を取り除くために、室温で110×gで細胞を遠心する。上清を捨て、さらに5日間で5％CO 2インキュベーター中、37℃で新しい24ウェルプレート（ウエルまでの1×10 5 /）に新鮮なCD34の維持培地と種子の1ミリリットル中に細胞を懸濁します。 </li><li> CD34 +細胞がウェル（ 図1A）の底に浮かんでいる間に慎重に上清の上半分を吸引することにより、一日おきに培地の半分を交換してください。 </li></ol></li><li>センダイウイルストランスフェクション： <ol><li> 5日目に、CD34の細胞を採取し、室温で10分間170×gで細胞を遠心する。上清を捨てる。 </li><li>培地1ml中、1×10、5 /ウェルで24ウェルプレート中の新鮮な培地中に細胞を再懸濁。 </li><li>最初の10秒間37℃の水浴中でチューブの底部に浸漬することによりcytotune-のiPS仙台書き換えキットを解凍した後、完全に解凍T RT。簡単に言えば、チューブを遠心し、氷の上に置く。該当ロットの分析証明書（COA）に記載されている各ウイルスの推奨される量を混合することにより、センダイウイルス液を調製する。 MOI 15を推奨します。 </li><li> CD34細胞の各ウェルにセンダイウイルスミックスを追加します。静かに振とうして井戸を混ぜる。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。 </li><li> 24時間後にトランスフェクション効率を観察します。細胞集合体と球の形成に成功したトランスフェクション（ 図1B）のための指標であることに注意してください。 </li><li>慎重によく別の媒体の上半分を転送することにより、培地の半分を変更します。新しいウェル中の細胞球が存在する場合、新鮮な培地と同じ量を追加する。 </li><li>ステップ2.2.6を繰り返して、他の日ごとに培地を変更します。 </li></ol></li><li>神経幹細胞の誘導。 注：細胞条件に依存して、約5または7日間トランスフェクション後、単層接着細胞30に到達する -50％のコンフルエンス（ 図1C）。 <ol><li>栄養混合物F-12 1X N2サプリメント、0.1％（w / v）のウシ血清アルブミンを含む（DMEM / F12）、（：（ダルベッコ改変イーグル培地浮遊細胞と球を含有する上清を外し、神経前駆培地の1ミリリットルを追加BSA）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）の1％（v / v）の抗生物質、20ng / mlの、および上皮成長因子（EGF）の20 ng / ml）を接着細胞に。 </li><li>必要に応じて、静かにピペッティングして細胞球を解離し、10分間170×gで細胞を遠心する。上清を除去し、アップするなどのバック命令あたりのマトリゲルでコーティングされた新しい24ウェルプレート中の神経前駆培地1mlで細胞を懸濁します。 </li><li>通常1週間後に、80％コンフルエント - 細胞が60に達するまで、一日おきに培地を変更します。 </li><li>上清を捨て、神経幹細胞培地（無血清培地、NSC SFM）の1ミリリットルを追加。続いて、細胞スクレーパーを用いて細胞を解離非常に穏やかにピペッティングすることによって。 </li><li>細胞を除去し、6ウェルプレートの1ウェルにそれらのすべてをシードする。神経幹細胞培地の別の1mlを各ウェルに2mlのメディアを作るために加える。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。 </li><li>先日の媒体ごとに変更します。 </li><li> 2.3.4と2.3.6の手順に従って：3の比率の細胞が60％コンフルエンスに達したとき、1で細胞を解離し、replate。 </li></ol></li><li>神経幹細胞の凍結。 <ol><li>神経幹細胞培地に、20％ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加することにより凍結培地神経幹細胞を調製する。氷上で凍結培地にしてく​​ださい。 </li><li>穏やかにピペッティングし、その後、細胞スクレーパーを用いて、6ウェルプレート中の細胞を解離する。細胞を数える。 RTで10分間、170×gで細胞を集める。上清を捨てる。 </li><li> 1×10 6 / mlの濃度で神経幹細胞培地中で細胞を再懸濁。細胞に凍結培地の同じボリュームを追加します。 </li><li> 1ミリリットル（5×1を追加します。クライオバイアル内の細胞の0〜5の全細胞）。命令の次氏Froster冷凍コンテナを用いて細胞を凍結する。 </li></ol></li></ol> 3.神経細胞の分化<ol><li>神経細胞の分化： <ol><li>神経幹細胞が80％コンフルエンスに達したときに、ラバーポリスマンを用いて神経幹細胞を剥離した後、穏やかにピペッティングすることにより解離する。 </li><li>細胞をカウントし、神経幹細胞培地中で1×10 5 / mlに濃度を調整する。 </li><li>ニューロン分化のために、1×10で5 /ウェルで24ウェルプレートにカバースリップをコーティングし、ポリ-D-リジン/ラミニン上で細胞をプレー。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。 </li><li>神経分化培地で培地を交換して1×N2サプリメント、1×B27サプリメント、300 / mlのcAMPを、0.2mMのビタミンC、10ng / mlの脳由来神経栄養因子（BDNF）と派生10ng / mlのグリア細胞を含む（DMEM / F12神経栄養因子（GDNF））のaf24時間TER。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。 </li><li> 2週間、週に2回の神経分化培地を変更します。 </li></ol></li><li>アストログリア分化： <ol><li>ピペッティングにより神経幹細胞を解離する。 </li><li>細胞を計数し、5×10 4細胞/ mlに細胞濃度を調整する。 24ウェルプレート上に細胞を播種する。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。 </li><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM / F12に培地を交換し、5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベートする。 </li><li> 2週間、週に2回培地を変更します。細胞は2週間前に合流に達した場合は、ステップ3.2.1と3.2.2以下の細胞をreplate。 </li></ol></li><li>オリゴデンドロサイト分化： <ol><li>ピペッティングにより神経幹細胞を解離する。 </li><li>オリゴデンドロサイトdifferenti 1mlの細胞および種子ポリ-L-オルニチンコーティングした24ウェルプレートに1×10 5個の細胞を計数、N2補充を含むDMEM / F12の血小板由来成長因子AA（PDGF-AA）、10ng / mlの、ニューロトロフィン-3（NT-3）の2 ng / mlの、ソニックヘッジホッグの2 ng / mlのからなるATION培地（ SHH）、及びトリヨードサイロニン（T3の3 nM）を有する。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。 </li><li> 2週間、週に2回培地を変更します。 </li><li> 1xN2サプリメントとミエリン塩基性タンパク質（MBP）生産のためのT3と文化の3 nMの追加の週のための細胞を含むDMEM / F12を含む培地を交換してください。 </li></ol></li></ol> 4.免疫蛍光染色<ol><li> 4％パラホルムアルデヒド（PFA）でメディアを交換してください。 RTで10分間インキュベートする。 </li><li> PFAを破棄し、PBS、0.1％トリトンX-100（PBS-T）で3回、5分毎に時刻を含む洗浄する。 </li><li> PBSで室温で10分間、0.5％トリトンX-100を含有する細胞を透過。 </li><li> PBS-Tを室温で20分間、4％ヤギ血清を含むPBSで細胞をブロックする。 </li><li>対応する主antiboで細胞をインキュベート低温室でRTまたはO / Nで2時間、0.1％BSAを含むPBS-Tで希釈したダイ。 </li><li> PBS-Tで3回、5分毎の時間のために細胞を洗浄する。暗所にてシェーカー上で1時間0.1％BSAを含むPBS-Tで希釈400：1を用いて蛍光色素と結合した二次抗体に対応する細胞をインキュベートする。 </li><li> RTで10分間、4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を含有するPBS-Tで細胞を洗浄する。 </li><li> RTで5分間ずつPBS-Tで細胞を2回以上洗う。 </li><li>顕微鏡を用いて標識された細胞を観察し、撮影した写真（ 図3）。 </li></ol>

<ol>
	<li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny.">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS ONE. 6, e20941 (2011).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroblast+assay:+an+assay+for+the+generation+and+enrichment+of+neuronal+progenitor+cells+from+differentiating+neural+stem+cell+progeny+using+flow+cytometry.">The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Human+Huntington's+Disease+Cell+Model+from+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells.</a> PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li><li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+patient+specific+iPS+cells+as+a+novel+approach+to+study+the+pathophysiology+of+multiple+sclerosis.">Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis.</a> Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li><li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons.">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).</li><li>Lee, S. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Generation+of+Neurosphere-Like+Cells+from+Human+Dermal+Fibroblasts.">Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts.</a> PLoS ONE. 6, e21801 (2011).</li><li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+Fibroblasts+into+Stably+Expandable+Neural+Stem+Cells.">Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., S&#252;dhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+neural+stem+cells+from+human+adult+peripheral+CD34++cells+for+an+autologous+model+of+neuroinflammation.">Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 8, e81720 (2013).</li><li>Jin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Sendai+virus+provides+a+highly+efficient+gene+transfer+into+human+cord+blood-derived+hematopoietic+stem+cells.">Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells.</a> Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).</li><li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+(iPSCs)+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors.">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).</li><li>Goolsby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitors+express+neural+genes.">Hematopoietic progenitors express neural genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).</li></ol>

The study is funded by NIH intramural funds.

直接末梢造血前駆細胞から神経幹細胞を生成するための詳細なプロトコルが提供される。 線維芽細胞と比較して、ヒト末梢血よりアクセス可能である。提示プロトコル以上1×10 5、造血前駆細胞、またはCD34陽性細胞を用いて、全血を10mlから濃縮することができる。血小板の汚染は、通常、予防されないが、それは容易に低速遠心分離によって低減することができ...

in vitroで神経細胞培養物は、神経疾患の研究のための基本的なツールとして使用されてきた。主要な動物（主にげっ歯類）神経培養1,2および神経膠腫又は他の腫瘍に由来するヒト神経細胞株は、最も一般的に使用されるような研究である。しかし、げっ歯類およびヒト細胞の間に有意な差があることが認識されている。げっ歯類に基づいた多くの発見は、ヒトに翻訳することができません。さらに、大量のゲノム情報と、比較的容易な遺伝子編集と全ゲノム配列の解析の急速な発展に、傾向はますますギヤード少数の人間の神経細胞を作るもの、病気がちの遺伝子を発見し、特定の疾患で、その機能と役割の輪郭を描くのです。細胞株は、唯一の利用が限られている。理論的には、患者の神経系のサンプル由来のヒト初代神経培養は、最良の選択であるが、それらを得ることは不可能である。したがって、代替メタODSが必要である。近年、いくつかのアプローチは、2つの最も識別可能で、追求されてきた。マウスおよびヒトの体細胞の3、4を用いて誘導多能性幹細胞（IPSC）を生成する技術の開発に続いて、神経細胞は、さらにそれら5-7と区別することができた。しかし、生成しIPSCを特徴づけることは労働集約的、技術、および時間の入力を要求し、時には法外。直後に、別のアプローチは、直接体細胞8,9から神経細胞を形質転換するために開発された。得られた神経細胞は非増殖性であるので、それは、大量の細胞を必要とする、集中的な研究及び薬物スクリーニングにおけるその適用を制限している。両方の技術の利点を取るためには、体細胞から神経幹/前駆細胞の直接の導出は、いくつかのグループによって10〜12を検討されている、IPSCの生成および特性の退屈なプロセスをバイパスし、それでも専らいるDES後で神経分化のための神経幹細胞のまともな数。我々は以前、造血前駆細胞への山中転写因子の導入に続いて、神経幹細胞は直接培地13を選択する神経前駆細胞を用いて生成することができることを示している。ここでは、詳細に方法を報告している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="584">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Material List</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Name</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:72px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Lymphocyte Separation Medium</td>
			<td style="width:171px;">Lonza</td>
			<td style="width:135px;">17-829E</td>
			<td style="width:72px;">1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">SepMate</td>
			<td style="width:171px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:135px;">15415</td>
			<td style="width:72px;">15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Human Serum</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">34005-100</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">15240-062</td>
			<td align="right" style="width:72px;">1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">CD34 MultiSort Kit</td>
			<td style="width:171px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-056-701</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Cellgro</td>
			<td style="width:135px;">46-034-Cl&#160;</td>
			<td style="width:72px;">2mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">MACS LS Column</td>
			<td style="width:171px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-042-401</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">StemSpan SFEM Medium</td>
			<td style="width:171px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:135px;">9650</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IMDM</td>
			<td style="width:171px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:135px;">112-035-101</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">TPO</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">300-18</td>
			<td style="width:72px;">100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Flt-3</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">300-19</td>
			<td style="width:72px;">100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">SCF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">300-07</td>
			<td style="width:72px;">100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IL-6</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">200-06</td>
			<td style="width:72px;">20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IL-7&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">200-07</td>
			<td style="width:72px;">20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IPS Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">A1378001</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:171px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:135px;">83.183</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">DMSO</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">D2650</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">CryoTube vials</td>
			<td style="width:171px;">Thermo</td>
			<td align="right" style="width:135px;">368632</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Mr. Frosty container</td>
			<td style="width:171px;">Thermo</td>
			<td style="width:135px;">5100-0001</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">12400-024</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">N2 supplement</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A2934</td>
			<td style="width:72px;">0.1% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">bFGF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">100-18B</td>
			<td style="width:72px;">20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">EGF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-15</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">17504-044</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">NSC serum free medium</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">A1050901</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:208px;">Poly-D-lysine/laminin coated cover slips</td>
			<td rowspan="2" style="width:171px;">BD Bioscences</td>
			<td align="right" rowspan="2" style="width:135px;">354087</td>
			<td rowspan="2" style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">cAMP</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A9501</td>
			<td style="width:72px;">300 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A0278</td>
			<td style="width:72px;">0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">BDNF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">450-02</td>
			<td style="width:72px;">10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">GDNF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">450-10</td>
			<td style="width:72px;">10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Poly-L-Ornithine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P4957</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">PDGF-AA</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">100-13A</td>
			<td style="width:72px;">10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">NT-3</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">450-03</td>
			<td style="width:72px;">2 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Shh</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">1314-SH/CF</td>
			<td style="width:72px;">2 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">T3</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T6397</td>
			<td style="width:72px;">3 nM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">PFA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P6148</td>
			<td align="right" style="width:72px;">4%</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:208px;">PBS</td>
			<td style="width:171px;">Quality Biological</td>
			<td style="width:135px;">119-069-101</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Goat serum</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G9023</td>
			<td align="right" style="width:72px;">4%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T9284</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Mouse monoclonal anti-Nestin</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">AB5922</td>
			<td style="width:72px;">1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Anti-SOX2&#160; antibody</td>
			<td style="width:171px;">Applied Stemcell</td>
			<td style="width:135px;">ASA0120</td>
			<td style="width:72px;">Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Mouse anti-&#946;III-tubulin antibody</td>
			<td style="width:171px;">Promega</td>
			<td style="width:135px;">G712A</td>
			<td style="width:72px;">1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:208px;">Rabbit anti-GFAP antibody</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G4546</td>
			<td style="width:72px;">1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Anti-O4 antibody</td>
			<td style="width:171px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">MAB1326</td>
			<td style="width:72px;">IgM; 1 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:208px;">Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:171px;">Life techniologies</td>
			<td style="width:135px;">A11012</td>
			<td style="width:72px;">1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:208px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:171px;">Life techniologies</td>
			<td style="width:135px;">A11001</td>
			<td style="width:72px;">1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody</td>
			<td style="width:171px;">Life techniologies</td>
			<td style="width:135px;">A21042</td>
			<td style="width:72px;">1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">DAPI</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">D9542</td>
			<td style="width:72px;">1 ug/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct induction of human neural stem cells from peripheral blood hematopoietic progenitor cells

ヒトの疾患の特定の神経細胞培養は、人間の神経疾患のためのin vitroモデルの生成に不可欠である。しかし、初代ヒト成体神経の文化へのアクセスの欠如が固有の課題を提起する。誘導多能性幹細胞（IPSC）における最近の開発は、患者固有のIPSCを通して皮膚線維芽細胞からの神経培養物を導出するための別のアプローチを提供するが、このプロセスは労働集約的で、特別な専門知識と大量のリソースを必要とし、数ヶ月かかることがあります。これは神経疾患の研究にこの技術の幅広いアプリケーションを防ぎます。これらの問題のいくつかを克服するために、我々は、IPSC導出処理をバイパスして、直接ヒト成人末梢血から神経幹細胞を誘導するための方法を開発した。ヒト成人末梢血から濃縮造血前駆細胞をin vitroで培養し、転写因子Sox2の、10月を含むセンダイウイルスベクターでトランスフェクト3/4、Klf4及びc-Myc。さらに、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および血管内皮増殖因子（VEGF）を含むヒト神経前駆細胞培地を用いて選択された細胞の形態変化でのトランスフェクションの結果。得られた細胞は、ネスチンおよびSOX2などの神経幹細胞マーカーについての発現によって特徴づけられる。これらの神経幹細胞は、さらに指定された分化培地でニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞に分化することができる。簡単にアクセスできるヒト末梢血サンプルを用いて、この方法は、神経疾患のin vitroモデル化のための神経細胞へのさらなる分化のために神経幹細胞を誘導するために使用することができ、これらの疾患の病因及び治療 ​​に関連した研究を進めることができる。

<html> CD34細胞の品質は、神経幹細胞の形質導入の成功のために重要である。高品質のCD34細胞は、培養の日の最初のカップルの間に増殖し、ちょうど培養容器（ 図1A）の底の上にフローティング、非粘着性、均一に円形細胞として表示されます。拡大と関連が緩んでいる非特定の細胞凝集体は、細胞培養中に発生する可能性がありながら、時間（ 図1B）上で展開する細...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells at JoVE.com

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

direct-induction-human-neural-stem-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.4K ビュー.  National Institutes of Health. この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。 

ビデオ: Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

発生生物学

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro is essential for mechanistic studies of the endothelial-hematopoietic transition and hematopoietic specification. Here, we describe a method for the efficient induction of HE from human pluripotent stem cells (hPSCs) by way of overexpression of different sets of transcription factors. The combination of ETV2 and GATA1 or GATA2 TFs is used to induce HE with pan-myeloid potential, while a combination of GATA2 and TAL1 transcription factors allows for the production of HE with erythroid and megakaryocytic potential. The addition of LMO2 to GATA2 and TAL1 combination substantially accelerates differentiation and increases erythroid and megakaryocytic cells production. This method provides an efficient and rapid means of HE induction from hPSCs and allows for the observation of the endothelial-hematopoietic transition in a culture dish. The protocol includes hPSCs transduction procedures and post-transduction analysis of HE and blood progenitors.

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

ひと臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の分離

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.