This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.

イメージング用1. 3D細胞培養と準備<ol><li>培養に適切な細胞株、 すなわち、HCT116結腸癌細胞株、二次元、単層培養した。 </li><li>一般的には数日かかる50〜70％の集密度まで、5％CO 2インキュベーターでマッコイの5A培地+ 10％ウシ胎児血清を含むT-25フラスコにHCT 116細胞を増殖させる。 </li><li> 0.25％トリプシン-EDTA溶液で細胞を放出し、細胞密度および生存率をチェックするために、血球計数器およびトリパンブルー染色を用いて細胞の一部をカウントする。 </li><li>カウントした後、適当なウェル6000細胞/播種密度は、30,000細胞/ mlを達成するために完全培地で細胞を希釈する。 </li></ol> 2.アガロース被覆96ウェルプレートを準備します<ol><li> 50ミリリットルコニカルチューブ内の標準のメディアの10ミリリットル（メディアでの1.5％アガロース溶液）10にアガロースの0.19グラムを追加します。穏やかに混合することによって取り込みを確認してください。水浴中でアガロースオートクレーブ20分間。 </li><li>アガロース+媒体混合物の50μlをフラット60中央ウェル中に吸引する、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレート培養プレート底。プレートの周縁部におけるウェルはわずかに高い蒸発速度を有するように、200μlの1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の代わりに、これらのエッジにアガロースを加える。 </li><li>アガロース混合物は、内側のウェルに添加された後に冷却するために脇にプレートをセット〜37 細胞の添加の前にCを°。 </li></ol>三次元培養を3シードとなりがち注：複数またはより少ない細胞が関与培養の要件に応じて播種することができるが、それはこれらの条件は、培養の10〜14日後に直径約1mmの三次元細胞培養構造をもたらすことが判明した（データは示していない） 。 <ol><li>アガロース被覆に（〜6000細胞を含むように希釈された）適切な細胞溶液200μlを追加します。96ウェルプレート。プレートをカバーし、細胞増殖のために37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター内で設定。 </li><li>細胞媒体ごとに48時間の最小値を変更するか、またはメディアが表示されたときに色を変更すること。 <ol><li>慎重にアガロースの下にある（2日目までに肉眼で見える）小三次元細胞培養の周囲から古いメディアを吸引することによって、メディアを変更します。三次元細胞培養の上に静かに新鮮な培地200μlを追加します。 </li><li>これらのメディアの変更時には（オプションステップ）は、テストのための化学療法剤または他の薬剤を追加します。完全なメディアとの最終濃度になるように選択薬を希釈し、各ウェルに必要な200μlを添加する。 </li><li>三次元細胞培養物は、直径約1mmになるまで、光学顕微鏡で3次元細胞培養増殖をモニターする。 </li></ol></li></ol> 4.収穫の3D細胞培養<ol><li>優しくアガロースベッドから3D細胞培養を削除するには2ミリリットルの血清学的ピペットを使用してください。 </li> &lt;李は&gt;優しく待っている24ウェルプレートに約1mlのPBSにそれらをピペッティングすることによりPBSで3次元細胞培養物を洗ってください。 </li><li>転送は、タンパク質または代謝産物を抽出するための遠心管に、血清学的ピペットを介して三次元細胞培養物を収穫し、または画像化用途のためにスライスを支援するために、切断媒体に埋め込む。 </li></ol>ゼラチン5.埋め込みの3D細胞培養<ol><li>高純度の水で〜175 mg / mlのゼラチンの溶液を準備（18MΩ推奨）。22,23、激しくゼラチンを混ぜる。粘性および操作が困難になって解決策を守ってください。溶液が透明と吸引することが容易となるまで〜60℃の水浴中でゼラチンを含むコニカルチューブを配置し、暖かい。 注：温かいゼラチン溶液は、それが冷えると急速に硬化するため、急速に凍結する前に、次の手順をすべて実行。 </li><li>それを加熱した後、細胞培養フードに直ちにゼラチンを取る。 BEAにゼラチンでチューブを維持約60で予熱水とケル ゼラチン溶液の硬化を避けるためにC°。 </li><li> 2ミリリットルの血清学的ピペットを用いて、24平底プレートのウェル中に温かいゼラチン溶液0.6mlを堆積させる。このボリュームは、薄層の下側をカバーするのに十分である。穏やかに直ちに3D構造を破裂を避けるために異なるの2mlピペットを用いてゼラチン層の上に三次元細胞培養物を堆積させる。 注：ケアは、ゼラチンにPBSを配置していないこの段階で注意しなければならない。このような場合は、しかし、200μlのピペットを用いて、ゼラチンの上部からPBSを削除します。 </li><li>三次元細胞培養物をゼラチン層の表面上に配置された後の培養物の位置を乱さないように、慎重に、三次元細胞培養上温かいゼラチン混合物の別の0.6ミリリットルをピペット。第2層が配置された後、-80℃でゼラチン包埋3D細胞培養を凍結。 </li></ol> 6.スライスと解凍マウント番目質量分析イメージング用の電子ゼラチン包埋3D細胞培養<ol><li>冷凍庫から3D細胞培養物を含む24ウェルプレートを外します。ピンセットやメスでは、ウェルの側面ダウン優しくスライドするまで、あなたの手からの熱とプレートの底を温める。 </li><li>スムーズにセンターを解凍せずにゼラチンを解放、ピンセットやメスをスライドさせます。クライオスタットサポートに一滴の水を取り、支援にゼラチンディスクを接着するためにこれを使用する。 <ol><li>ゼラチン中に埋め込まれた三次元細胞培養物を-30℃でスライスに最も適している。使用前に70％エタノールクライオスタットブレードとガラスを清掃してください。ブレードの鈍化を防ぐために、ブレードまたは各3D細胞培養 - ゼラチンディスクの新しいブレードの別の部分を使用してください。 </li></ol></li><li> 3D細胞培養物が見えるようになるまで、クライオスタットを用いて、優しく余分なゼラチンをオフに直面している。 </li><li>この時点で、ゆっくりと12〜16ミクロンのセクションでスムーズな動きで3D細胞培養物をスライス。 注：スライスへの重要な要因は、ブレードにガラスの距離、ブレード角度、クライオスタットの温度、及び支持体上のディスクの角度を含むので、これらのすべては、一貫性のある結果を保証するためにチェックする必要があります。 </li><li>慎重にスライスを解凍し、適切に標識されたインジウムチタン酸化物（ITO）でコーティングされたガラススライド上にマウントし、デシケーターに保管してください。最高品質のために可能な限り迅速にスライスを使用してください。 </li></ol> 7.マトリックスアプリケーションおよびMALDIイメージング用サンプル調製<ol><li> MALDIイメージングに先立ち、適切なマトリックスとスライスを準備する。 <ol><li>小分子の分析のために、何回の洗浄工程は、一般的に必要とされない。無傷のタンパク質の検出のために、そのような信号をマスクする可能性脂質などの小分子を除去するために冷100％アセトン、カルノア液、または70％/ 95％イソプロパノールでスライスを洗浄し、24 - 26 </li><li>静かに時を超えない30秒間洗浄します。しないすべてのスライスを乱す。 </li></ol></li><li> 0.1％TFAと、有機溶媒と水の溶液中でマトリックスを準備する。そのようなαシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）などの小分子は、60％ACNを使用し、40％H 2 O：0.1％TFA（10 mg / mlで）。タンパク質検出のためのそのようなシナピン酸（30 mg / ml）でのように、同じ溶媒溶液を使用する。シナピン酸の最適な溶解度のため、TFAを添加する前に、アセトニトリル中で最初に溶解する：H 2 O溶液。他のマトリックスを適宜用いることができる。 注意：マトリックスは、いくつかの異なる方法で適用することができるが、それはいくつかのマトリクスが使用できなくサンプルをレンダリングする、そのようなフェルラ酸として、ゼラチンと共結晶化さが分かっている注目すべきである。小さい結晶は、複数の分子種が検出され、生物学的な違いはなく、マトリックス効果に起因することを可能にし、より一貫性のある質量スペクトルを生成する。 </li><li>メソッドをhandspottingにより行列を適用します。 <ol><li> MATRの0.5μLを適用する先の細い注射器を使用してください三次元細胞培養スライス上にix溶液とマトリックスが結晶化さ許す。 </li></ol></li><li>また、エアブラシメソッドを使用します。マトリックス溶液と商用グレードのエアブラシを埋める。 <ol><li> 8〜12インチ離れスライドから噴霧器を保持するスライスで微細な噴霧を目指しています。パス間では、1分間に最高の結晶形成を可能にするためのマトリックスを乾燥させる。エアブラシの10〜20パスまでのマトリクス22の最適な層を製造するために必要とされている。 </li></ol></li><li>また、他の場所で詳述さ昇華法を使用しています。25,27 </li><li>かかわらず行列適用の方法のMALDI-MSI、前の少なくとも30分間デシケーター中で乾燥したスライド25 </li></ol> MALDI-TOFシステムを用いた8 MALDI-MSI分析（ すなわち、オートフレックスIII） 注：このセクションでは、MALDI-TOFイメージング実験のためのパラメータを設定するための指示やアドバイスが含まれています。アドインによってはtrumentメーカーやソフトウェア使用、プロセスが異なる場合があります。 <ol><li>しっかりとイメージにITO被覆されたスライドに付着した3D細胞培養スライスを75ミリメートル×25 mmスライドを保持するために作られ、アダプタのスライドを取り付けます。機器にスライドアダプタをロードします。 </li><li>問題の質量範囲のための適切な較正標準を選択することにより、MALDI-MSIのための楽器を準備します。小分子の尋問のために、使用されるマトリックス、α-CHCAに対応して検出された信号は、キャリブラントの一つの共通のグループである。タンパク質の分析のために、関心のある質量範囲内の既知のタンパク質標準（ すなわち、ユビキチン、トリプシノーゲン）を選択し、較正物質として3次元細胞培養に隣接してスポットする。メソッド開発を進める前に、機器を校正。 </li><li>画像化の前に、機器の製造業者が提供するソフトウェアを使用して、選択した質量範囲のためのデータ取得方法を開発する。のための図1と図2を参照してください小分子とタンパク質イメージング。小分子イメージングのために、最高の質量分解能のためのリフレクトロンモードを使用しています。 <ol><li> のm / z 100〜1,000の間と8,000- 25000 メートル/ zの間のタンパク質のための小分子データ取得のための質量範囲を調整します。楽器を持つ可能性が最も高い質量分解能を提供しながら、選択領域を包含するように質量範囲を調整します。 </li><li>レーザパワー、周波数、較正溶液と近くの「犠牲」の3D細胞培養スライスを用いたレーザーショットとスポットサイズの数を調整する。主計測器制御ソフトウェアでこれらの設定を確認します。 60％の電力、400レーザーショット、超小型スポットサイズ：推奨されるの出発点として、以下の設定を使用してください。これらの設定は、楽器やメソッド間で異なるので、それぞれ特定の楽器のための最高品質のスペクトルを与えるために、機器パラメータを最適化します。調整することができる他のパラメータは、検出器利得、サンプルレート、及び電子利得を含む。 Sイメージングソフトウェアで使用するためには、この方法をaveの（ すなわち 、自動実行方法はFlexImagingがに頼ること）。 注：検出を妨害しないように（再び計測器制御で見つかった）関心の質量範囲以下のイオンを抑制します。 </li><li>選択した質量範囲のためのタンパク質のデータ取得方法を開発する。上記で概説した同じ手順に従いますが、今回は中〜高質量範囲については、約3 kDaの上、リニア·モードを使用します。 NOTE：設定小分子法のために使用されるものとは異なる。 </li></ol></li><li>そのようなブルカーMALDI-TOFシステム用FlexImagingとして機器の製造元から提供イメージングソフトウェアを使用してセットアップ特定のMS機器パラメータ、。 <ol><li>前と保存されて開発された方法を使用して、新しいイメージングファイルとフォルダを作成します。そのようなラスタスポット（ステップ8.3.2または8.3.3にセットアップ）計測器制御方法を設定するサイズ（約200μm〜50μmのデフォルトからの変更）、およびPOSIなどの機器パラメータを選択します三次元細胞培養物を走査するる。 </li><li>順番に各レーザを移動し、試料上の3適切なティーチポイントを選択します。 「印刷画面」を使用して、MALDI-TOFレーザー制御ソフトウェアからの光学写真を入手します。 注：多くのイメージング·ソフトウェア·プログラムは、スキャナまたはしばしば器具カメラで得られるレーザが配置されている「教示」ソフトウェア、サンプルの光学写真を必要とする。 </li></ol></li><li>その後、イメージングソフトウェア（しない計測器制御）からの撮像処理を開始し、各スライスからマススペクトルを取得。特定の領域に局在ほとんどの3D細胞培養全体の質量と他の人を観察します。 </li></ol> 9.オプションデータ解析手法<ol><li>ターゲット分析のために、平均スペクトルに質量をクリックすることにより、スペクトルの手分析を行い、または（イメージングソフトウェアが自動的に特定のしきい値を超える質量を選択できるように例えば 、ABピーク）上位20％のしきい値をOVE。品質管理のため、マトリックスピークの分布や平均スペクトルを調べる。 </li><li>そのようなRやMatlabなどの数学ソフトウェアで抽出されたデータセットを統計分析を実行します。 <ol><li> ASCII形式でエクスポートシングルスペクトル、好みのソフトウェアにロードするための読み取り可能なテキストフ​​ァイル、。 </li><li> 、いくつかの異なるソフトウェアプログラムによって28読み取るためmzML形式のASCII、mzXML、個々のスペクトルに変換する- 31、または分析（.imgの）形式のファイル、MRIのような他のイメージング用途に使用される一般的なフォーマットとしてデータをエクスポート32分析のための2つのオープンソースのオプションはMSiReaderとバイオマップ32,33です。 </li><li>ファイルは、ソフトウェアによって読み取り可能なフォーマットにエクスポートされると、それぞれのソフトウェアの命令を経由してデータセットをロードします。ロード後、そのようなベースラインの除去および正規化として、取得後の処理を行う。 </li><li>このデータセットでは、statiがを実行そのようなカスタムスクリプトやMatlabなど18のようなソフトウェアでのアルゴリズムで構築いずれかを使用して、階層的クラスタリングの主成分分析としてsticalトリートメント。 </li></ol></li></ol>

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G. a., Eng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+open+representation+of+mass+spectrometry+data+and+its+application+to+proteomics+research.">A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research.</a> Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).</li><li>Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+mzXML+good+for.">What is mzXML good for.</a> Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).</li><li>Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -. J., Binz, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+the+data+explosion.+A+report+on+the+HUPO-PSI+Workshop.+August+2008,+Amsterdam,+The+Netherlands.">Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands.</a> Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).</li><li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSiReader:+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform.">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction.</a> Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).</li></ol>

This article is part of a special issue on Multimodal Pre-Clinical Imaging, sponsored by Bruker Biospin. The MALDI-TOF system used to obtain the representative results is a Bruker AutoFlex III.

上記に概説した方法を用いて、三次元細胞培養物を増殖させ、MALDI-MSIを分析することができる。ときに適切。9,10ケア、すなわち、何回も通過した低継代番号がされていない細胞を培養するために取られるべきで培養多くの不死化細胞株は、3D構造を形成する。一般的に、10および下部の継代数を有する細胞は、3次元細胞培養物を成長させるために最適である。従来のアガロース支持体に3次元細胞培養物を成長させることは、このシステムを試して三次元細胞培養物中の興味の研究グループのための費用効果の高い方法を提供する。この方法は、ほとんどの哺乳動物細胞培養室でない既にいくつかのコンポーネントを利用する。 3D細胞培養物は大きさや形状が一致しているように、細心の注意を払うことが、成長のためのアガロースプレートの準備に支払わなければならない。細心の注意を必要とするいくつかの態様は、気泡を混合物に捕捉されていないことを確認し、適切なメニスカスがそれぞれワットの底部に形成されていることが挙げられるエル。メニスカスが正常に形成されない場合、細胞は、非回転楕円形状又は小塊に成長することができる。また、ケアはスフェロイドとゼラチンにPBSを配置しないように注意する必要があります。この問題が発生した場合は、200μlのピペットを用いて、ゼラチンの上部からPBSを削除します。コストが要因ではない場合には、超低結合丸底プレートは、市販されており、これらの工程の簡略化を提供する。他の組織に埋め込む方法も費用がかかり、非質量分析両立させることができる一方で、ゼラチン - 埋め込みは、安価で汎用性の両方であることが示されている。上に概説準備戦略は、最高品質のデータを取得する3次元の細胞培養のために最適化されている。ゼラチン埋め込み質量分析と適合性であることが示されているが、このプロセスは、共結晶化に使用可能なマトリックスを狭めない。凍結したら、三次元細胞培養物は、それらが凍結融解されないようにヶ月間安定である。ゼラチンは凍結時に不透明になり、3Dセル培養は、類似した色であるので、スライスを補助するために、3D細胞培養の配置を記録するため、凍結前に推奨される。 スライドを調製する場合、マトリックスは、いくつかの異なる方法で適用することができるが、それはいくつかのマトリクスが使用できなくサンプルをレンダリングする、そのようなフェルラ酸として、ゼラチンと共結晶化さが分かっていることに留意すべきである。小さなマトリックス結晶は、より一貫性のある質量スペクトルを生成する。 handspottingマトリックスアプリケーションの最も単純な方法であるが、より大きな溶媒容量は、大きな結晶サイズと有意な分析物の移行をもたらすことができる。 質量分析計では、最初の分析に必要な専門知識が低下しているMALDI-MSIの技術の進歩。データ収集と分析は、初心者でもITO被覆スライドから高品質の情報を取得することができ、ほとんどのシステムでは単純である。近くの非画像値する3D細胞culturに最適化された機器パラメータを慎重に選択、エスは、高品質のデータを得るために重要である。例えば、レーザパワーを大きくするとピーク強度を増加させることができるが、レーザパワーの減少は、解像度を向上させ、より対称的なピーク形状を与えることができる。三次元細胞培養物は、最適なサンプルの品質を確保するためにスライスした後すぐに使用されるべきである。タンパク質シグナルの劣化（20 kDaの上記）、特に高質量領域において、適切なストレージ（デシケータ/ -80°Cの冷凍庫）なしで週以内に見ることができる。による需要のために、多くの異なる可視化ソフトウェアプログラムが開発され、研究公衆に自由にされている。ほとんどのイメージング質量分析計は、それぞれの機器で使用して独自のフォーマットを持つ単一の塊を可視化するために必要なソフトウェアがインストールされている。これらのソフトウェアプログラムは、単一の質量の画像を取得し、データをエクスポートするために使用することができる。ほとんどのソフトウェアはまた、目的の2つ以上の質量のオーバーレイを可能にする。さらに、MSIデータのための多くの異なった視聴者は、そのようなMSiReader ANとして、ダウンロードして無料ですのdバイオマップ。得32,33質量分析データは、最前線に有用な情報をもたらし、容易に取得後に処理することができる。 医薬品からの脂質へのタンパク質の、上記で概説したシステムは、三次元細胞培養構造全体で目的の分子の分布を評価するためのデータの迅速な取得を可能にする。連続切片は、3D細胞培養のスライスの各2D画像から構築することにより、画像全体の三次元構造をとることができる。プロトコルにおける技術やノートは、単層培養および動物モデル間のブリ​​ッジとしての三次元細胞培養を開始したい研究者に使用されるであろう。一度習得し、これらの技術は、彼らが選択したいずれかのサンプル画像への研究を可能にする、三次元細胞培養物、組織、および細胞培養物の複数のタイプに適用することができる。

Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.1&#8211;4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.5&#8211;7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.8&#8211;11
3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.10 Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.10 There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.7 However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.12&#8211;14
All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.12,15&#8211;21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCT116 Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-247</td>
			<td>Potential hazard, handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16600-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin, unflavored</td>
			<td>Knox</td>
			<td>--</td>
			<td>Available at most grocery stores in single-packets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITO-coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Limited</td>
			<td>CG-90IN-S115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sinapic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.3mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set</td>
			<td>RoyalMax Airbrush</td>
			<td>--</td>
			<td>Many options available on sites such as Amazon.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3d cell culture models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

MSI画像は、3D細胞培養物中の多数の異なる分子量分布を明らかにする可能性がある。上記で概説した方法を用いて、小分子（ 図1）からの大きなタンパク質（ 図2）の種は、培養にわたって追跡することができる。これらの結果は、MSiReader図32の結果は、関心領域全体走査領域のいずれかで可視化ソフトウェアで3D細胞培養を横切る単一の注目イオンを分析することができる無料のツールと単一イオンの視覚化を示す。さらに、ほとんどのソフトウェアは自動的に発見の努力を支援する可能性がある、ユーザーが設定した一定の閾値を超えるイオンを可視化します。単一イオンマップが得られると、ほとんどのソフトウェアは、イオンの共局在を表示するために画像をオーバーレイする能力を含む。いずれかのアプローチを発見ベースまたは標的化様式で、質量分析イメージングは​​、3次元細胞培養物を分析するための強力なツールである。 図3D細胞培養増殖および切片。左）収穫前に14日目に見て、無傷の結腸直腸HCT-116三次元細胞培養構造の光学画像の1代表的な結果 。右大腸3D細胞培養雪解けの約赤道スライスの）光学画像は、撮影用のITO被覆スライド上にマウントした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" /> 低質量（小分子）の範囲でα-CHCAを用いて達成図3D細胞培養の赤道部分の小分子MALDI-MSIの2。代表的な結果。トップ）の平均質量スペクトル。の下）代表的な画像単一の質量：主に3次元細胞培養及び主に3D細胞培養の縁に局在429.7 メートル/ zの内部に局在327.8 メートル/ zの 。破線は回転楕円体のおおよそのエッジを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" /> 図3D細胞培養。トップ）は、より高い（タンパク質）の質量範囲内シナピン酸を用いて達成さの平均質量スペクトルの赤道部分のMALDI-MSIによるタンパク質イメージングの3代表的な結果 。ボトム）単一の質量の代表的な画像：主に回転楕円体の端に局在10871 メートル/ z、およびより多くの回転楕円体の内部に向かってローカライズされた12184 メートル/ zの 。破線は回転楕円体のおおよそのエッジを示し。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

不死化された癌細胞株は、3次元細胞培養物、生物学的研究のための貴重なモデルとして成長させることができる。このプロトコルは、サンプル調製プラットフォームの改善を含む、三次元細胞培養物の質量分析イメージングを記述する。このプロトコルの目的は、質量分析イメージング解析のために3次元細胞培養物を調製するためにユーザーに指示することである。

3次元細胞培養モデルの質量分析イメージング用試料調製の戦略

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

sample-preparation-strategies-for-mass-spectrometry-imaging-3d-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.0K ビュー.  University of Notre Dame. 不死化された癌細胞株は、3次元細胞培養物、生物学的研究のための貴重なモデルとして成長させることができる。このプロトコルは、サンプル調製プラットフォームの改善を含む、三次元細胞培養物の質量分析イメージングを記述する。このプロトコルの目的は、質量分析イメージング解析のために3次元細胞培養物を調製するためにユーザーに指示する...

ビデオ: Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

生物工学

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

幹細胞培養アプリケーションのための3Dフィブリン足場の調製

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析法による生体組織のイメージング

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

近赤外Photoimmunotherapy法を用いた混合3D文化からの選択的な細胞除去

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

赤外線マトリックス支援レーザー脱離エレクトロスプレーイオン化することにより、全身質量分析イメージング（IR-MALDESI）

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

癌細胞培養から採取した培地における液体クロマトグラフィー-質量分析法による選択キヌレニンの同時定量化

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Establishing the 3D Stromal-Endothelial Cell Co-Culture

To begin, take the pellet of the GFP-HUVECs grown to a confluence level of 80 to 100%and resuspend the cells in an appropriate volume of basal medium to achieve a concentration of one times 10 to the seventh cells per milliliter of stock solution. Prepare 50-milliliter conical centrifuge tubes containing the required volume of basal medium supplemented with the respective growth factors. Add the GFP-HUVECs from the stock solution at a dilution of one to 66.67 to achieve a concentration of 1.5 times 10 to the fifth cells per microliter.Then aspirate the medium from the plate containing the stromal monoculture and add 200 microliters per well of the prepared GFP-HUVECs suspension. Incubate at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide in a humidified atmosphere, changing the medium every three to four days. Monitor the development of the culture by bright-field and fluorescence microscopy using a five times objective.Differences between the cultures could be observed from the bright-field and fluorescence images showing only the GFP-HUVECs. The cultures appeared less developed without any growth factor, However, faster development was observed in the presence of FGF-2. In contrast, the bright-field images showed the densest cultures in the presence of BMP-2.However, vascular like networks formed in both growth factor-containing conditions and the most extensive and interconnected networks were formed with FGF-2.

3D間質-内皮細胞共培養の確立

3D音響アセンブリデバイスを用いた均一細胞スフェロイドのスケーラブルな生成

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

著者スポットライト:高品質3D細胞スフェロイド培養のためのスキャフォールドフリー音響アセンブリ法の開発 

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

細胞スフェロイドの量産のための3次元音響組立装置

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...