細胞の挙動に対する微小環境因子の影響は、単一の手がかりを分離する過度に単純化されたin vitroプラットフォームを使用して研究されることがよくあります。私たちのアプローチは、これらの手がかりの複数を組み合わせた細胞培養基質を作成します。このアプローチは非常に汎用性が高く、さまざまな細胞培養材料、接触誘導パターン、細胞読み出し、およびタンパク質を使用した体系的な研究を可能にします。
手順は、私たちの研究室からの2人のPSE候補者によって実証されます。CAS VAN DER PUTTEN, と MIRKO D'URSO まず、関心のあるすべての特徴を含むフェムト秒レーザーダイレクト右技術を使用して、負のガラス型を作成します。次に、ネガガラスモールドをペトリ皿の底に注意深く置き、ネガガラスモールドの上にポリジメチルシロキサンプレポリマーを注ぎ、完全に覆います。
このペトリ皿を真空デシケーターに入れ、真空ポンプを始動します。真空が達成されたら、5分間待って、金型表面とポリジメチルシロキサンプレポリマーの間の界面に存在するすべての気泡を除去します。PDMSプレポリマーを摂氏65度のオーブンで一晩硬化させます。
硬化後、スパチュラを使用してPDMSの端を持ち上げます。新しく硬化したポジティブPDMSチップをネガティブガラスモールドから取り外し、ポジティブPDMSチップがネガティブガラスモールドに付着する傾向がある場合は、持ち上げながらインプリントの端にエタノールまたは水を追加します。次に、ポジティブポリジメチルシロキサンチップを、シラン化剤の液滴を入れた小さなバイアルの隣のデシケーターに入れ、チップを真空下で一晩放置します。
PDMSプレポリマーをネガティブPDMSモールドに流し込み、厚さ5ミリメートルの複数の細胞培養チップを製造します。次に、デシケーターを使用して気泡を取り除き、摂氏65度で3時間硬化させます。かみそりの刃を使用してチップを最終的なサイズに切断し、チップを室温で保管します ピンセットを使用した基板パッシベーションの場合は、チップをプラズマアッシャーのバスケットに入れます。
次に、酸素プラズマを使用してチップ表面のヒドロキシル基を活性化し、窒素を使用して灰室を通気します。バスケットからチップを取り出し、小さなポリジメチルシロキサン容器に入れます。次に、パスツールピペットを使用してチップの上部に500マイクロリットルのポリ-L-リジンを追加し、表面を溶液に完全に浸し、室温で30分間インキュベートします。
次に、450マイクロリットルのPoly-L-リジンをピペットで細胞培養チップから取り出します。次に、チップ表面を500マイクロリットルの0.1モルHEPESバッファーですすいでください。ポリジメチルシロキサンチップ上に少量の液体を残して最終的なパターン品質を維持し、サンプルの乾燥を防ぎます。
使用直前に、細胞培養チップ当たり0.1モルヒープ緩衝液中の500マイクロリットルの50ミリグラム/ミリリットルのメトキシポリエチレングリコシンシアナミド吉草酸塩溶液を調製し、その中にサンプルを60分間インキュベートする。マイクロピペットを使用して、450マイクロリットルのメトキシポリエチレングリコシングシアナミダル吉草酸溶液を除去する。チップ表面をPBSでピペッティングインおよびピペッティングアウトして5回洗浄します。
バインドされていないすべてのmPEG-SVAを削除します。蛍光蛍光ペン付きのスライドガラスを顕微鏡の光路に置きます。顕微鏡で蛍光モードに切り替え、プリモ画像に注意深く焦点を合わせ、ロゴとテキストの両方に焦点が合っていることを確認します。
次へをクリックしてキャリブレーションデータとパターンを表示し、キャリブレーション手順を終了します。キャリブレーション時にステージのZ位置を書き留め、この位置をプロトコルの後半で参照として使用します。キャリブレーションスライドをステージから取り出した後、光開始剤の液滴を含むスライドガラスをステージ上に置き、PDMS細胞培養基板を逆さまに置き、光開始液滴を入れた。
細胞培養基板の表面の3Dフィーチャーがスライドガラスに面し、フォトイニシエーターに完全に沈んでいることを確認して、適切なパターン化を確保します。凸構造または凹構造の上部または下部にそれぞれ焦点を当て、原稿に記載されているように、適切な位置にあるチップの領域に焦点を合わせます。機能に応じてパターニング設定を調整し、ミリリットルあたり1000ミリジュールの用量を選択します。
画面右下の再生ボタンをクリックして、パターン化を開始します。終了したら、緑色で表示されているパターンを確認します。マイクロピペットを使用して、20マイクログラムのローダミン標識フィブロネクチンのバイアルに2ミリリットルのPBSを加え、1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度を得た。
タンパク質の塊を避け、光から保護するために、ピペットを穏やかに動かします。マイクロピペットを使用して、200〜500マイクロリットルのタンパク質溶液を細胞培養チップに加えます。選択したタンパク質に応じてインキュベーション時間と温度を調整し、サンプルを必ずカバーしてください。
タンパク質溶液を取り出し、チップを500マイクロリットルの滅菌PBSで5回洗浄します。細胞培養チップのすべての関連機能の上にPBSを複数回ピペットで上下にピペットして、結合していないタンパク質を除去してください。細胞懸濁液が調製されたら、PBSを取り出し、1ミリリットルの細胞懸濁液をチップに加える。
その後、摂氏37度で60分間インキュベートします。パターン細胞培養チップ上の細胞の接着を明視野顕微鏡で確認する。線パターンの場合は細長い細胞形態を探します。
また、細胞がパターン領域の外側に接着し始めた場合は、基板上の細胞の真上で培地を上下にピペッティングしてこれらを取り除きます。染色後、染色したサンプルを逆さまにスライドガラス上のPBSの液滴に入れます。次に、必要な詳細レベルに応じて、適切な対物レンズとZ間隔を使用してZスタックを作成し、適切な画像取得を保証します。
3Dレンダリングソフトウェアを使用してZスタックの3Dレンダリングを作成します。タンパク質の光誘起分子吸収を用いて凹状のピットをパターン化し、最大強度投影と直交図を可視化した。強度プロファイルは、パターン化された領域とパターン化されていない領域の間で高いパターン分解能の鋭い遷移と一貫したタンパク質強度を示しました。
単焦点面法と2焦点面法、3焦点面法を用いたパターニングでは、特徴の上にパターンが完全に揃っていることが示されました。凹型半円筒、凸型半円筒、サドル表面およびPIDは、様々な幅の線または同心円を使用してパターン化された。ヒト角化細胞の骨格内部への影響をフォリデンを用いて染色し、可視化する。
皮膚線維芽細胞をパターン化された凹状の半円筒上で培養し、可視化した。細胞はマルチキュー細胞培養基質を感知して接着し、F-アクチン、ビンキュリン、および核によって視覚化されるように、時間の経過とともに生存可能なままでした。また、細胞は主にフィブロネクチン株上に限局性接着を形成した。
ローダミンフィブロネクチンの存在下でパターン化された凹面シリンダー上で培養されたヒト皮膚線維芽細胞は、マルチキュー基板に接着し、接触誘導パターンに従って配向応答を示した。アラインメント応答と細胞生存率は、培養期間全体にわたって維持されます。このプロトコルを実行する際に最も重要なことは、細胞培養チップの表面が乾燥するのを防ぐことです。
異なる基質材料、タンパク質コーティング、細胞タイプを使用すると、追加の最適化が必要になる場合があります。3Dで複数の環境手がかりを提供することで、複雑なエンジニア組織の細胞組織を操縦する新しい可能性を開くことができます。
