Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit W&#252;rz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the &#8216;Chemicals in the Environment&#8217; (CITE) research program of the Helmholtz Association.

料理の調製、スライドとインキュベーションチェンバース<ol><li>各小宇宙に次の材料を準備します。一つの大きなプラスチック製のペトリ皿の底部（D = 10cm）に、蓋と3空洞を有する1カウントチャンバースライドで（ステップ1.2を参照）、小さなプラスチック製のペトリ皿の底の（D = 5 cm）の修正1。 </li><li>ペトリ皿の底部の所望の数の（d = 5 cm）を取る。正確にスライド（26ミリメートルエッジ長）が合うようにのこぎりでつばの部分を削除します。システムを滅菌するため、70％エタノールのO / Nでペトリ皿の底と蓋を浸漬し、UV光下での流キャビネット中で少なくとも2時間のためにそれらを乾燥させる。また、2時間UV光にさらされていた密閉プラスチック容器、ペトリ皿に保管してください。 </li><li> 70％エタノールとを含むスライドの所望の数ワイプそれらを空気乾燥する。アルミホイルでスライドをラップし、可能な汚染を除去するために、450℃で5時間マッフル炉に入れます。 </LI&gt; <li>蓋付きガラスインキュベーション室を準備します。 70％エタノールで清掃し、流キャビネット内の少なくとも2時間のUV光にオープンチャンバーを公開。 注：蓋付き大型デシケーター（30 -1付近の直径）は、この目的のために使用することができる。各デシケーターは10縮図のセットアップまで収容することができる。 </li></ol>メディアと文化の調製<ol><li> 、3; 20並列小宇宙を実行するには、修正されたトリプトン-酵母培地（MTY）の100ミリリットル14、約150ミリリットル21Cの最小培地16（MM）、最小培地寒天（0.5％、w / vのMMA）の5ミリリットルを取得ポテトデキストロース寒天培地（PDA; 1.5％、w / v）のP.用ultimum 4つのブランクプレートを、2 mgのL -1シクロヘキシミド、4アガロースプレートを含むものPDAプレート（3％、w / v）と0.3を含むグラムml -1の活性炭および2mg部のFLU 40mgの。 </li><li> MTYはカナマイシン50 mgのL -1を含む準備（カナマイシンはrequirです細菌の培養のための10 mMの酢酸を含むのeGFPレポータープラスミドを維持するために編）およびMM。マイクロコズム中の細菌の固定化に0.5％のMMAを準備し、 ピシウムultimumと小宇宙のセットアップの培養に1.5％PDAのプレート（各20ml）に注ぎ、酢酸ずにMMを使用してください。 </li><li> P.のいくつかの菌糸を接種する3新鮮PDAプレート上のultimumとは、約72時間、25℃の暗所でインキュベートする。その後、プレートは新鮮でふわふわ菌糸体によって完全に生い茂っていることを確認してください。 </li><li> Bの二つの文化を開始グリセロールストックからMTYの50ミリリットルでsartisoli RP037-MCHE。 230 rpmで回転式フラスコ運動O / Nで30℃でインキュベートする。 </li><li>メジャー文化光学密度（OD）578 nmでの遠心10分間千×gで（B. sartisoli RP037-MCHEのために、期待されるOD 578が約1.0であり、細胞が対数期にあります）。上清を捨て、細胞を再懸濁OD 0.4の578に到達するMMの適切な量で存在する。再懸 ​​濁した細胞の400μlの50 mgのL -1カナマイシンを含むMMの20ミリリットルを接種する。 230 rpmで回転式フラスコ運動O / Nで30℃でインキュベートする。 </li><li> MMにおける文化のOD 578を測定します（B. sartisoli RP037-MCHEのために、期待されるOD 578が約0.2であり、細胞が初期の指数期にあります）。遠心培養物を10分間2,000×gで0.4のODに達するためにMMの適切な量で細胞を再懸濁する。使用量になるまで50℃で2 mlチューブや店舗で暖かい、液体MMAの500μlの細胞懸濁液50μlを混ぜる。各小宇宙のためにMMAでの細胞の150μlのを使用してください。 </li><li>活性炭を含むアガロースゲルのプレートを注ぐ。アガロース溶融（3％、w / v）の蒸留水で。活性炭（0.3グラムミリリットル-1）で十分に混合し、プラスチック製のペトリ皿に混合物を注ぐの（d = 10cm）に。 </li></ol>取付3.小宇宙注：完全な縮図のセットアップを図1に概略的に示されている以下のすべての個々のステップについては図1を参照してください。。次の手順では、菌糸輸送ベクター3つの異なる制御のセットアップ（CONのAIR、CONのNEG、CONのPOS）を含むサンプル（SAM）の調製を記載している。すべての異なる設定の概要を表1に見出すことができる。 <ol><li>ペトリ皿およびスライドの所望の数を取り、30分間流キャビネットの下UV光にそれらをさらす。 </li><li>大きなものの中に小さなペトリ皿を置き、小さなペトリ皿の隙間を通ってスライドに合わせて。 MMAで暖かい細胞懸濁液の1サンプルを取り、1スライドの中央空洞に150μlを添加する。すべてのスライドの中央空洞があるまで、この手順を繰り返しますMMAでいっぱい。 MMAが固化するために、5分待ってください。 </li><li>空白のPDAプレートから円形のパッチをパンチアウトするために1cmのコルクボーラーを使用してください。小さなペトリ皿の内側MMAの隣に2ミリメートルの距離で1パッチを置きます。 （ 図1のPDA 3）セットアップ中に菌糸の成長を促進するために、これを追加します。 </li><li>機械的な障壁として湾曲したPDAのパッチをカット。清潔で無菌の小さなペトリ皿の底の部分を使用し、PDAプレートにそれを押してください。 PDA-リングになり寒天に0.5センチメートルの距離で別の小さいリングをカットするヘラを使用してください。 <ol><li>正確に小宇宙のセットアップの小さなペトリ皿の隙間に収まる部分を、切り出し、スライドの上にギャップ内に配置。 MMAと円形のPDAバリア間の距離は約2mmであることを確認してください。優しくPDA障壁にそれを押すと、小さなペトリ皿の蓋を閉じます。 </li><li>繰り返します2グラムLを含むPDAプレートと3.4と3.4.1のステップ-1シクロヘキシミドの。 注：菌糸がシクロヘキシミドによって阻害され、MMAを過剰成長しないので、これは、バイオレポーター細胞に対して空中輸送のための制御設定（CONのAIR）です。 </li></ol></li><li>空白のPDAプレートの円形のパッチをパンチアウトするために1cmのコルクボーラーを使用してください。最初のパッチの真ん中をカットするために別の0.5cmのコルクボーラーを使用してください。 PDA関門（ 図1のPDA 1）の隣に1ミリメートルの距離で生じた小さなPDAリングを置きます。 </li><li> Pと生い茂ったPDAプレートから円形のパッチをカットするPDA 1.の穴に1cmのコルクボーラーをFLU 2mgのを追加します。 ultimumと菌糸マットはFLU結晶を向くようにPDAリングにダウンボトムを（ 図1のPDA 2）1パッチを配置。 <ol><li> FLU結晶を追加することなく、前の手順を繰り返します。 注：これは、バックグラウンドを決定するために、負の制御設定（CON NEG）であるバイオレポーター細胞の蛍光。 </li></ol></li><li>活性炭を含む寒天から円形のパッチをパンチアウトするために1cmのコルクボーラーを使用してください。さらにガス状のFLU濃度（ 図1）を減少させるために各小宇宙セットアップで4つのパッチを配置します。 </li><li>ポジティブコントロール（CONのPOS）を準備します。 MMAの細胞懸濁液の200μlにいくつかのFLU結晶を追加し、空のスライドの1のキャビティに入れて。 </li><li>チャンバ内の気体のFLUの濃度を最小限にするために、インキュベーションチャンバーの底部に、活性炭のいくつかの粉末とペトリ皿の（d = 10 cm）を置く。また、チャンバー内の高湿度を維持するために、底に滅菌水で四から五50ミリリットルビーカーを置く。 <ol><li>インキュベーション室に縮図のセットアップを移し、96時間、25℃でインキュベートする。ランダムに異なる成長チャンバー内の場所サンプルは場所の影響を除外します。 注：このインキュベーション時間のAP卵菌Pにプライultimum。これは、他の生物のために異なる場合があります。 </li></ol></li></ol> 4.共焦点レーザー走査顕微鏡<ol><li>理想的には正立顕微鏡とCLSMのセットアップを使用しています。 注：これは、励起のためのまたは調整可能白色レーザ光 ​​源と、例えば、488、561及び633nmのラインを提供し、従来のレーザーを装備することができる。 </li><li>画像のコレクションのために、以下の設定を使用してください：励起：490 nmの（EGFP）と585 nmの（mCherryを）適切なレーザー強度（同時励起）で。放出範囲：500から550ナノメートル（EGFP）と605から650ナノメートル（mCherryを）;対物レンズ：63X NA（その長作動距離のために）浸漬可能0.9水; Z-スタックのためのステップサイズ：0.5程度である。 </li><li>オープン縮図のセットアップやPDA 1、2、3、PDAの障壁を除去するための外科用メスを使用しています。 MMAの上にガラスカバースリップを入れて、気泡を除去するために軽く押してください。顕微鏡ステージ上にマウントスライド。目の上に水の液滴を追加します。Eカバースリップし、試料中のバイオレポーター細胞を見つけるためにmCherryを設定を使用します。 </li><li>サンプルの概要を取得し、赤のためのグロー·オーバー·アンダールックアップテーブルを用いて信号対雑音比を最適化する（mCherryを）と緑（EGFP）チャンネル。バイオレポーター蛍光を分析するために、試料上のランダムな位置を選択してください。 注：菌糸はバイオレポーターの放出（ 例えば、緑色の自己蛍光）17の範囲内の自家蛍光を示すことがある。このような場合は菌糸ない領域を選択してください。 </li><li>定義し、緑（EGFP）、赤（mCherryを）チャネル内の各位置のためのzスタックを記録します。落射光やレーザー光に長時間露光することにより、試料の漂白は避けてください。 <ol><li> 10ランダム、均等に分散ポジションの前の手順を繰り返します。 </li></ol></li><li>テストコース（SAM）、CONのAIR、CONのNEGとCONのPOSのすべてのサンプルに同じ設定を使用してすべての手順を繰り返します。 </li></oL&gt; 5.画像解析注：他のオプションの中でのフリーソフトウェアImageJを18（http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html）にすることができ、記録されたZ-スタックに赤（mCherryを）と緑（EGFP）の蛍光を分析するために、使用。 <ol><li> logi_toolプラグイン（http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/）をインストールしてください。 </li><li> ImageJの中でファイルを開きます。 「スプリットチャネル」と密接な緑のチャンネルを選択します。 zスタックに赤色蛍光の面積を定量化するために補助コードファイルとして提供マクロ」mCherryをエリア」を使用してください。マクロで好みの設定を調整します（太字で示されている）。 <ol><li>出力は、Z-スタック内の測定ピクセルの閾値を上回る（と定義された最小サイズ以上）を持つテーブルです。 注：すべての値の合計が、スタック内の赤色画素（領域）の総数である。 </li></ol></li><li> ImageJの中でファイルを開きます。 「スプリットチャネル」と密接な赤のチャンネルを選択します。マクロを使用してください<html> 216、Z-スタック内の緑色蛍光の強度を定量化するために補助コードファイルとして提供されたeGFP INT」。マクロで好みの設定を調整します（太字で示されている）。 <ol><li>出力は、zスタック内のすべての緑のオブジェクト閾値より上（と定義された最小サイズ以上）の平均強度と面積を持つテーブルです。スタック内の緑画素の全強度を計算するには、対応するエリアによって各平均強度を掛けます。 </li></ol></li><li>相対のeGFP誘導（EGFPのREL）を計算します。 <img alt="式1" src="/files/ftp_upload/52334/52334eq1.jpg" width="300px" /> （1） NOTE：mCherryを構成的に発現されているので、のeGFP 相対の結果値は、細胞の一定量で表さeGFPの量の相対測定値である。またのeGFP RELの計算の詳細については、表3を参照してください。 </li></ol>TLE &quot;&gt; 6。化学定量 NOTE：小宇宙セットアップもまたは非生物的汚染物質、ヒートシンクなしに転FLU量の化学的定量化を行うために用いることができる。 <ol><li>アルミ箔15 mlのガラスバイアルに1mlのGC / MSバイアル​​インサートを包む。をNa 2 SO 4皿を蒸発させて充填します。可能な汚染を除去するために、450℃で5時間マッフル炉ですべてを置く。活性化したデシケーターのNa 2 SO 4で内部に保管してください。 </li><li> 0.5cmの長さにPDMSコーティングされたガラス繊維をカットします。新鮮なメタノール中で4回2時間振盪することにより繊維を洗浄する。繰り返し洗浄は、超純水でさらに4回繰り返し、密封ガラスバイアル中で超純水できれいな繊維を格納する。 </li><li>トルエン/アセトン1.5Lの準備（3：1、v / v）の10μgのLはフェナントレン-1-dを10を含む。 </li><li>ステップ1、2、プロトコルの3を実行します。 biorずに小宇宙を準備FLU劣化を確認し、バイオレポーター細胞（SAM）とFLU輸送（） - - ）、およびCONのAIR（SAM（）を研究するeporter細胞。 <ol><li> （バイオレポーター細胞なし）オプション：SAMのMMA内部人工と定量化可能な汚染物質シンクとして（通常SPME実験に使用）ガラス繊維をコーティングした場所3 PDMS（ - ）は細かい鉗子を使用して。 </li><li>細かい鉗子を用いてガラス繊維を取り出し、インサートGC / MSバイアル​​にそれぞれ1を移す。 </li><li>トルエン200μlを加え、O / N縦に振ると、GC / MSを経由して分析する。 表2に設けられた設定を使用します。 </li></ol></li><li> 15ミリリットルのガラスバイアルに中央の空洞からMMAを転送し、Na 2 SO 4の3へらについて追加。スパチュラを用いて徹底的に混合し、溶剤の10ミリリットルを追加します。ボルテックス混合物を暗所で水平にO / Nを振る。 <ol><li>転送1001;インサートをGC / MSバイアル​​にサンプルのリットル。アセナフチレン-D 08（10 mgのL -1）を10μlを追加し、6.4.3に記載したのと同じプログラムを使用して、GC / MSを経由して分析する。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Holden, P. A., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+processes+in+the+vadose+zone.">Microbial processes in the vadose zone.</a> Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).</li><li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+unseen+majority.">Prokaryotes: The unseen majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).</li><li>Kieft, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+abundance+and+activities+in+relation+to+water+potential+in+the+vadose+zones+of+arid+and+semiarid+sites.">Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites.</a> Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).</li><li>Wang, G., Or, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+films+limit+bacterial+cell+motility+and+colony+expansion+on+partially+saturated+rough+surfaces.">Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces.</a> Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).</li><li>Griffin, D. M., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 141-151 (1981).</li><li>Papendick, R. I., Camprell, G. S., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 1-22 (1981).</li><li>Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+consequences+of+nutrient+translocation+in+mycelial+fungi.">Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi.</a> J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).</li><li>Jennings, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+solutes+in+fungi.">Translocation of solutes in fungi.</a> Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).</li><li>Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+root+exudates+in+rhizosphere+interactions+with+plants+and+other+organisms.">The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).</li><li>Furuno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycelia+promote+active+transport+and+spatial+dispersion+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbons.">Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons.</a> Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).</li><li>Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbuscular+mycorrhizal+fungal+hyphae+contribute+to+the+uptake+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+by+plant+roots.">Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots.</a> Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).</li><li>Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioavailability+of+hydrophobic+organic+contaminants+in+soils:+fundamental+concepts+and+techniques+for+analysis.">Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis.</a> Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).</li><li>Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-tagged+fluorescent+bacterial+bioreporter+for+the+study+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbon+diffusion+and+bioavailability.">Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability.</a> Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).</li><li>Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+green+fluorescent+protein-based+bacterial+biosensor+for+analysing+phenanthrene+fluxes.">A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes.</a> Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).</li><li>Schamfuss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+mycelia+on+the+accessibility+of+fluorene+to+PAH-degrading+bacteria.">Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria.</a> Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).</li><li>Smibert, R. M., Krieg, R. M., Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of methods for general bacteriology. 19, 409-443 (1981).</li><li>Wu, C. H., Warren, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+autofluorescence+in+fungi+and+its+correlation+with+viability.">Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability.</a> Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Pedersen, C., Sylvia, D., Mukerji, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+8+Concepts+in+Mycorrhizal+Research.">Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research.</a> Handbook of Vegetation Science. Vol. 19, 195-222 (1996).</li><li>Furuno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+mycelia+allow+chemotactic+dispersal+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbon-degrading+bacteria+in+water-unsaturated+systems.">Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems.</a> Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

提示縮図のセットアップは菌糸体による取り込みおよび輸送の後に生物を劣化させることに空間的に分離され、化学物質の生物学的利用能を研究するのに適して証明した。部分的に揮発性化合物の潜在的気相輸送が防止され、細菌のバイオレポーター細胞が重要なシステムの最小の妨害で、従って精巧なサンプル調製を必要とせずに可視化することができる。同時に、サンプルの化学分析が?...

土壌は、高密度に細菌などの微生物1,2の広い範囲によって入力されます。しかし、この生息地の条件は特に水の利用可能3換算で、挑戦的である。細菌は、恒久的に異機種環境4に最適な条件を探索する必要がありますが、連続した水膜の不在は、自由に広げるために、それらを妨げる制限されたモビリティ5になるさ。また、溶質の拡散速度（ 例えば、栄養素）は、不飽和条件6の下に低下する。そのため、細菌や栄養素は、多くの場合、物理的に分離され、栄養のアクセシビリティは3に制限されている。結果として、連続的な水相を必要としない化学化合物のための輸送ベクターは、これらの制限を克服するのに役立つ可能性がある。実際には、そのような真菌および卵菌などの多くの微生物がそれによって達するとmobiは空気で満たされた孔隙を通して成長できるようにすること糸状成長形を開発したlizingも物理的な長距離での栄養素7と炭素質8物質を分離した。彼らは細菌9に糖及び他のエネルギー源を提供し、生物学的輸送ベクターとして作用することができる。菌糸生物における取り込みと輸送はまた、このようなピシウムultimum 10またはアーバスキュラー菌根菌11で中の多環芳香族炭化水素（PAH）などの疎水性有機汚染物質のために示されている。 PAHは、ユビキタスと難水溶性汚染物質の土壌中の12であるため、菌糸体媒介輸送は、潜在的な細菌の分解者のための汚染物質の生物学的利用能を高めるために役立つかもしれない。汚染物質輸送の総量は化学によって直接定量することができるのに対し、分解細菌および他の生物に菌糸体によって輸送汚染物質の生物学的利用能を容易に評価することができない、10を意味する。 以下のプロトコルmyceの影響を評価するための方法を提示する直接的な方法で細菌の分解者への汚染物質の生物学的利用能にLIA。それは微生物の生態系への汚染物質の時空間への影響に関する情報を収集することができます。私たちは、菌糸輸送ベクターを経由してPAH分解バイオレポーター細菌と物理的に分離されたPAHの点光源をリンクすることによって土壌中の空気 - 水界面を模倣精巧な不飽和縮図システムを設定する方法について説明します。空中輸送が除外されているため、細菌PAHのバイオアベイラビリティに菌糸ベースの輸送の効果は、単離された方法で研究することができる。より詳細には、3環のPAHフルオレン、菌糸生物ピシウムultimumとバイオレポーター細菌バークホルデリアsartisoli RP037-MCHE 13を説明小宇宙の設定で適用した。細菌B. sartisoli RP037-MCHE、もともとセル14にフェナントレンフラックスを研究するために構築されたとするPAHフラックスの結果として、緑色蛍光タンパク質（eGFP）を発現増強赤の蛍光を発するmCherryをを構成的に発現される細胞。レポーター構築に関する詳細な情報はTecon らによって与えられている。予備試験では13、細菌は水泳とだけ非常に遅い群がる能力を認められなかった。それは、菌糸の上に高密度の懸濁液として適用された場合にピシウムultimumの菌糸にゆっくり移動することができました。細菌は以下のプロトコルでアガロースに包埋したので、菌糸上のマイグレーションが発生しなかった。 共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を用いて、バイオレポーター細菌はマイクロコズムで直接可視化することができるし、eGFPの発現は、ソフトウェアのImageJの助けを借りて（mCherryを信号に比​​例した）細胞の量に関連して定量することができる。これは、異なるシナリオに定性的生物学的利用能を比較することができ（ すなわち、より高いまたはより低い）。 FLUはP.によって菌糸輸送後に生物学的に利用可能であることが見出されたultimum（すなわち、それは、）陰性対照よりも高かった。さらに、プロトコルは、化学的な手段を介して菌糸体媒介輸送の総量を定量化すると、同一のマイクロコズムにおけるシリコンコーティングされたガラス繊維（SPME繊維）を使用して、汚染物質の生物学的利用能を確認する方法について説明します。この小宇宙のセットアップを使用して結果が公表され、Pの組み合わせのために議論されてきたultimum、フルオレン及びB. sartisoli RP037-MCHE 15。ここでは、焦点は、潜在的なさらなる用途のためにこの知識を提供するために、詳細な方法の説明とプロトコルの潜在的な落とし穴の同定に位置しています。さらにアプリケーションは、さまざまな真菌、（汚染されたサイトからの例えば、）細菌種、および他の汚染物質（ 例えば、殺虫剤）または汚染物質の供給（ 例えば、高齢の土壌）を含むことができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1158">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:523px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td>TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD</td>
			<td>Agilent</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td>an equivalent GC/MS may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">GC capillary column J&#38;W 121-5522&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Cork borer</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12863952</td>
			<td>or any other</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Cover slips</td>
			<td style="width:195px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:128px;">107222</td>
			<td>High performance, No.1.5H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">GC/MS insterts</td>
			<td style="width:195px;">WICOM</td>
			<td style="width:128px;">WIC 47080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">GC/MS vials 2 ml</td>
			<td style="width:195px;">WICOM</td>
			<td style="width:128px;">WIC 41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Lids / septa for screw cap vials</td>
			<td style="width:195px;">DIONEX</td>
			<td>49463 / 049464&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Lids for GC/MS vials</td>
			<td style="width:195px;">WICOM</td>
			<td style="width:128px;">WIC 43948/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Objective Slides</td>
			<td style="width:195px;">Menzel</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td>ordinary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">PDMS coated glass fibers</td>
			<td style="width:195px;">Polymicro Technologies, Inc.</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td>V (PDMS) = 13.55 &#177; 0.02 &#181;L m-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Petri Dishes small / big</td>
			<td style="width:195px;">Greiner</td>
			<td style="width:128px;">633-102 / 628-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Screw cap vials 40 ml</td>
			<td style="width:195px;">DIONEX</td>
			<td>48783</td>
			<td>other glass vials may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Screw cap vials 60 ml</td>
			<td style="width:195px;">DIONEX</td>
			<td>48784</td>
			<td>other glass vials may be used</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:313px;">Acenaphthylene d08</td>
			<td style="width:195px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:128px;">C 20510100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Acetone</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">9372.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Activated carbon</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">242276-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Agarose</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td align="right">2267.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Fluorene</td>
			<td style="width:195px;">Fluka</td>
			<td style="width:128px;">46880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">T832.2</td>
			<td>50 mg L-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Methanol</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">P7171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Minimal Medium:</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td>100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">&#160; Solution 1</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">&#160;&#160;&#160; Ammonium sulfate&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">3746.1</td>
			<td>5 g L-1&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:313px;">&#160;&#160;&#160; Magnesium chloride x 6 H2O</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">2189.1</td>
			<td>1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:313px;">&#160;&#160;&#160; Calcium nitrate x 4 H2O</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">P740.1</td>
			<td>0.5 g L-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">&#160; Solution 2</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">&#160;&#160;&#160; Disodium phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">P030.1</td>
			<td>55.83 g L-1</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">&#160;&#160;&#160; Monopotassium phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">3904.1</td>
			<td>20 g L-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">&#160; Solution 3</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td>pH 6.0</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160; Disodium EDTA</td>
			<td style="width:195px;">MERCK</td>
			<td style="width:128px;">1084180250</td>
			<td>0.8 g L-1</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160; Iron(II) chloride x 4 H2O</td>
			<td style="width:195px;">MERCK</td>
			<td style="width:128px;">1038610250</td>
			<td>0.3 g L-1</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160; Cobalt(II) chloride x 6 H2O</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">T889.3</td>
			<td>4 mg L-1</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160; Manganese(II) chloride x 1 H2O&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">&#160; 4320.2</td>
			<td>10 mg L-1</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160; Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">&#160;P023.1</td>
			<td>1 mg L-1</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">&#160;&#160;&#160; Sodium molybdate x 2 H2O</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">&#160;0274.1</td>
			<td>3 mg L-1</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160; Zinc chloride</td>
			<td style="width:195px;">MERCK</td>
			<td style="width:128px;">1088160250</td>
			<td>2 mg L-1</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160; Lithium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">P007.1</td>
			<td>0.5 mg L-1</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160; Tin(II) chloride x 2 H2O</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">4473.1</td>
			<td>0.5 mg L-1</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160; Boric acid</td>
			<td style="width:195px;">Riedel-de-Haen&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:128px;">11606</td>
			<td>1 mg L-1</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160; Potassium bromide</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">A137.1</td>
			<td>2 mg L-1</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160; Potassium iodide</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">6750.1</td>
			<td>2 mg L-1</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160; Barium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">4453.1</td>
			<td>0.5 mg L-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">MMA</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td>Minimal medium + agarose 0.2 %</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:313px;">Phenanthrene d10</td>
			<td style="width:195px;">Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td style="width:128px;">C 20920100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">Potato Dextrose Agar:</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td>24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">&#160;&#160;&#160; Potato Dextrose broth</td>
			<td>Difco/ Beckton Dickinson</td>
			<td style="width:128px;">254920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">&#160;&#160;&#160; Bacto-agar</td>
			<td>Difco/ Beckton Dickinson</td>
			<td align="right">214040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Sodium acetate x 3 hydr.</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:128px;">6779.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Sodium sulfate</td>
			<td style="width:195px;">MERCK</td>
			<td style="width:128px;">&#160;1066495000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Toluene</td>
			<td style="width:195px;">MERCK</td>
			<td style="width:128px;">1083252500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">mTY medium:</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td>3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">&#160;&#160;&#160; Yeast extract</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td>1037530500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">&#160;&#160;&#160; Tryptone</td>
			<td style="width:195px;">Serva</td>
			<td>4864702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">&#160;&#160;&#160; Sodium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">imageJ with logi tool plugin</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:523px;">http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Pythium ultimum strain 67-1</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:523px;">Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Burkholderia sartisoli RP037-mChe</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:523px;">Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a whole cell bioreporter approach to assess transport and bioavailability of organic contaminants in water unsaturated systems

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.

ここに示す結果は、すでに15以前を発表されている。詳細な機構的および環境的な議論のための記事を参照してください。 CLSMを介して画像記録した後、最大強度投影は、サンプルの第1の視覚的印象を制御（ 図2）を得るために、各顕微鏡ソフトウェアまたはImageJをを用いて行うことができる。その後、データセットは、特定の可視化ソフトウェアに...

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A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

バークホルデリアsartisoli RP037-MCHEと全細胞バイオレポーターアッセイは、水飽和モデル系内の空気で満たされた細孔を橋渡し菌糸体により能動輸送後の細菌による分解に利用可能な有機汚染物質（ すなわち、フルオレン）の画分を検出するために開発されました。

水不飽和システムにおける有機汚染物質の輸送および生物学的利用能を評価するために、全細胞バイオレポーターアプローチ

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

a-whole-cell-bioreporter-approach-to-assess-transport-bioavailability

Research

JoVE Journal

Environment

10.3K ビュー.  Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ.  バークホルデリアsartisoli RP037-MCHEと全細胞バイオレポーターアッセイは、水飽和モデル系内の空気で満たされた細孔を橋渡し菌糸体により能動輸送後の細菌による分解に利用可能な有機汚染物質（ すなわち、フルオレン）の画分を検出するために開発されました。 

ビデオ: A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

環境学

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be subsampled throughout the experiment1&#8211;7. Subsampling of large volumes can be problematic for several reasons: 1) it causes variation in the total volume and the surface area:volume ratio of the culture during the experiment; 2) pseudo-replication (i.e., replicate samples from the same treatment flask8) is often employed rather than true replicates (i.e., sampling from replicate treatments); 3) the duration of the experiment is limited by the total volume; and 4) axenic cultures or the usual bacterial microbiota are difficult to maintain during long-term experiments as contamination commonly occurs during subsampling.
The use of microtiter plates enables 1 ml culture volumes to be used for each replicate, with up to 48 separate treatments within a 12.65 x 8.5 x 2.2 cm plate, thereby decreasing the experimental volume and allowing for extensive replication without subsampling any treatment. Additionally, this technique can be modified to fit a variety of experimental formats including: bacterial-algal co-cultures, algal physiology tests, and toxin screening9&#8211;11. Individual wells with an alga, bacterium and/or co-cultures can be sampled for numerous laboratory procedures including, but not limited to: WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry, microscopy, bacterial colony forming unit (cfu) counts and flow cytometry. The combination of the microtiter plate format and WATER-PAM fluorometry allows for multiple rapid measurements of photochemical yield and other photochemical parameters with low variability between samples, high reproducibility and avoids the many pitfalls of subsampling a carboy or conical flask over the course of an experiment.

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.

水 - パルス振幅変調（WATER-PAM）蛍光測定を用いて細菌/植物プランクトンの共培養を評価するために小音量バイオアッセイ

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Soil Lysimeter Excavation for Coupled Hydrological, Geochemical, and Microbiological Investigations

Studying co-evolution of hydrological and biogeochemical processes in the subsurface of natural landscapes can enhance the understanding of coupled Earth-system processes. Such knowledge is imperative in improving predictions of hydro-biogeochemical cycles, especially under climate change scenarios. We present an experimental method, designed to capture sub-surface heterogeneity of an initially homogeneous soil system. This method is based on destructive sampling of a soil lysimeter designed to simulate a small-scale hillslope. A weighing lysimeter of one cubic meter capacity was divided into sections (voxels) and was excavated layer-by-layer, with sub samples being collected from each voxel. The excavation procedure was aimed at detecting the incipient heterogeneity of the system by focusing on the spatial assessment of hydrological, geochemical, and microbiological properties of the soil. Representative results of a few physicochemical variables tested show the development of heterogeneity. Additional work to test interactions between hydrological, geochemical, and microbiological signatures is planned to interpret the observed patterns. Our study also demonstrates the possibility of carrying out similar excavations in order to observe and quantify different aspects of soil-development under varying environmental conditions and scale.

This study presents an excavation method for investigating subsurface hydrological, geochemical, and microbiological heterogeneity of a soil lysimeter. The lysimeter simulates an artificial hillslope which was initially under homogeneous condition and had been subjected to approximately 5,000 mm of water over eight cycles of irrigation in an 18-month period.

結合水文学、地球化学、および微生物学的調査のための土壌ライシメータ発掘

Studying co-evolution of hydrological and biogeochemical processes in the subsurface of natural landscapes can enhance the understanding of coupled ...

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) for the Real-driving Emissions (RDE) Regulation in Europe

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. However, on the road, ambient and driving conditions can vary over a wide range, sometimes causing emissions to be higher than those measured in the laboratory. For this reason, the European Commission has developed a complementary Real-Driving Emissions (RDE) test procedure using the Portable Emissions Measurement Systems (PEMS) to verify gaseous pollutant and particle number emissions during a wide range of normal operating conditions on the road. This paper presents the newly-adopted RDE test procedure, differentiating six steps: 1) vehicle selection, 2) vehicle preparation, 3) trip design, 4) trip execution, 5) trip verification, and 6) calculation of emissions. Of these steps, vehicle preparation and trip execution are described in greater detail. Examples of trip verification and the calculations of emissions are given.

Implementation of Portable Emissions Measurement Systems PEMS for the Real-driving Emissions RDE Regulation in Europe

The European Commission has developed a Real-Driving Emissions (RDE) test procedure to verify pollutant emissions during real-world vehicle operation using the Portable Emissions Measurement Systems (PEMS). This paper presents the experimental procedures required by the newly-adopted RDE test.

欧州でのReal-駆動排出量（RDE）規制のためのポータブル排出量測定システム（PEMS）の実装

Vehicles are tested in controlled and relatively narrow laboratory conditions to determine their official emission values and reference fuel consumption. ...

Vegetated Treatment Systems for Removing Contaminants Associated with Surface Water Toxicity in Agriculture and Urban Runoff

Urban stormwater and agriculture irrigation runoff contain a complex mixture of contaminants that are often toxic to adjacent receiving waters. Runoff may be treated with simple systems designed to promote sorption of contaminants to vegetation and soils and promote infiltration. Two example systems are described: a bioswale treatment system for urban stormwater treatment, and a vegetated drainage ditch for treating agriculture irrigation runoff. Both have similar attributes that reduce contaminant loading in runoff: vegetation that results in sorption of the contaminants to the soil and plant surfaces, and water infiltration. These systems may also include the integration of granulated activated carbon as a polishing step to remove residual contaminants. Implementation of these systems in agriculture and urban watersheds requires system monitoring to verify treatment efficacy. This includes chemical monitoring for specific contaminants responsible for toxicity. The current paper emphasizes monitoring of current use pesticides since these are responsible for surface water toxicity to aquatic invertebrates.

This article summarizes the design attributes and the effectiveness of treatment systems that treat urban stormwater and agriculture irrigation runoff to remove pesticides and other contaminants associated with aquatic toxicity.

農業および都市流出における地表水毒性に伴う汚染物質除去のための植物処理システム

Urban stormwater and agriculture irrigation runoff contain a complex mixture of contaminants that are often toxic to adjacent receiving waters. Runoff may ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonate (CaCO3) profiles. The objective is to describe a simple conceptual model and detailed protocol for repeatable field and laboratory measurements of these quantities. Here, accurate elevation is measured using a ground-based differential global positioning system (GPS); other data acquisition methods could be applied to the same basic method. Soil samples are collected from prescribed depth intervals and analyzed in the lab using an efficient and precise modified pressure-calcimeter method for quantitative analysis of inorganic carbon concentration. Standard statistical methods are applied to point data, and representative results show significant correlations between changes in soil surface layer CaCO3 and changes in elevation consistent with the conceptual model; CaCO3 generally decreased in depositional areas and increased in erosional areas. Maps are derived from point measurements of elevation and soil CaCO3 to aid analyses. A map of erosional and depositional patterns at the study site, a rain-fed winter wheat field cropped in alternating wheat-fallow strips, shows the interacting effects of water and wind erosion affected by management and topography. Alternative sampling methods and depth intervals are discussed and recommended for future work relating soil erosion and deposition to soil CaCO3.

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonates. Repeatable methods for field and laboratory measurements of these quantities and data analysis methods are described here.

測定と土壌侵食と堆積土炭酸濃度農業経営に関連のパターンのマッピング

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Improving Infrared Spectroscopy Characterization of Soil Organic Matter with Spectral Subtractions

Soil organic matter (SOM) underlies numerous soil processes and functions. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy detects infrared-active organic bonds that constitute the organic component of soils. However, the relatively low organic matter content of soils (commonly &#60; 5% by mass) and absorbance overlap of mineral and organic functional groups in the mid-infrared (MIR) region (4,000-400 cm-1) engenders substantial interference by dominant mineral absorbances, challenging or even preventing interpretation of spectra for SOM characterization. Spectral subtractions, a post-hoc mathematical treatment of spectra, can reduce mineral interference and enhance resolution of spectral regions corresponding to organic functional groups by mathematically removing mineral absorbances. This requires a mineral-enriched reference spectrum, which can be empirically obtained for a given soil sample by removing SOM. The mineral-enriched reference spectrum is subtracted from the original (untreated) spectrum of the soil sample to produce a spectrum representing SOM absorbances. Common SOM removal methods include high-temperature combustion (&#39;ashing&#39;) and chemical oxidation. Selection of the SOM removal method carries two considerations: (1) the amount of SOM removed, and (2) absorbance artifacts in the mineral reference spectrum and thus the resulting subtraction spectrum. These potential issues can, and should, be identified and quantified in order to avoid fallacious or biased interpretations of spectra for organic functional group composition of SOM. Following SOM removal, the resulting mineral-enriched sample is used to collect a mineral reference spectrum. Several strategies exist to perform subtractions depending on the experimental goals and sample characteristics, most notably the determination of the subtraction factor. The resulting subtraction spectrum requires careful interpretation based on the aforementioned methodology. For many soil and other environmental samples containing substantial mineral components, subtractions have strong potential to improve FTIR spectroscopic characterization of organic matter composition.

SOM underlies many soil functions and processes, but its characterization by FTIR spectroscopy is often challenged by mineral interferences. The described method can increase the utility of SOM analysis by FTIR spectroscopy by subtracting mineral interferences in soil spectra using empirically obtained mineral reference spectra.

スペクトル減算と土壌有機物の赤外分光特性の向上

Soil organic matter (SOM) underlies numerous soil processes and functions. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy detects infrared-active organic ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

シングル スループット複雑な天然有機物の混合物の評価の補完的な高解像度分析の手法

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

15窒素分析のためのマイクロプロット設計と植物および土壌サンプル調製

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...