私たちは、Pを提供するためにワシントン大学（シアトル、ワシントン州）のMatt Parsekに感謝緑膿菌とE.ストリームソフトウェアへのアクセスを提供するためのカンタベリー大学（ニュージーランド）での大腸菌の菌株とロジャー·ノークス。この作品は、国立衛生研究所からの助成金のR01AI081983、アレルギーと国立感染症研究所によってサポートされていました。共焦点イメージングは​​、ノースウェスタン生物イメージング機能（BIF）で行った。

1.フローセルセットアップおよび接種注：Song らに記載されてダブルインレットマイクロ流体フローセルを使用し、2014年14バイオフィルムを成長させる。。このフローセルは、明確に定義された滑らかな化学的勾配を作成することができる。フローセルの設計は、 図1に示されており、電池の製造は、以前Song らに記載されて流れている。、2014 14。P.を使用してここで詳細に我々の方法を緑膿菌とE.大腸菌は、バイオフィルムを形成するが、他の種にも適切であり得る。我々はPを使用構成的バイオフィルム発生のためのモデル生物として、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する緑膿菌 PAO1- のgfp。さらに、当社は、Eを使用大腸菌DH5αP.と混合種のバイオフィルムを形成するために緑膿菌。P.緑膿菌とE.大腸菌株はLB寒天プレート上で増殖させた。 <ol><li> a側にポリジメチルシロキサン（PDMS）を使用して、結合したフローセルを準備14に記載されているように、酸素プラズマ処理を介してカバーガラス。フローセルチャンバーの寸法は、0.24ミリメートル（奥行き×幅×長さ）×13ミリメートル×23ミリメートルである。 </li><li>修正されたFAB成長培地15を準備します。 、フローセル内の栄養勾配の下でのバイオフィルムの成長を観察する一つの入口で0.6μMグルコースを培地に変更FAB 15を紹介し、他の入口から任意の炭素源なしFAB培地を導入する。フィルター滅菌し（孔径=0.2μm）でのグルコースストック溶液（60 mM）のFAB培地に​​添加する前に。使用前に、また、サイクル1（121℃、17 psiの液体、15分）を有するFAB培地をオートクレーブ。 </li><li>フローシステムを滅菌する。接種の前に、流路全体（培地ボトル、チューブ、バブルトラップ、フローセル）フローセルの上流​​に位置する（使い捨て滅菌済み）プラスチック三方弁を除いて、サイクル1を用いてオートクレーブ。 （スリーウェイバルブはセルcを注入するために使用されulture、蛍光トレーサー及びマイクロビーズ。）オートクレーブする前に、アルミ箔またはオートクレーブ袋ですべてのチューブおよびコネクタの開口部をカバーし、組み立て中に汚染を避けるために。 </li><li>フローシステムを接続します。注意深くフローセルシステムの構成要素を組み立てる（フローシステムアセンブリのためのビデオを参照）、正確に流量を制御する蠕動ポンプを介してフローセルに増殖培地を提供。 </li><li> P.のコロニーを転送することによって接種のための細胞培養を準備緑膿菌またはE. LBプレートからLBブロスの3ミリリットルに大腸菌および225rpmで、37℃で培養するO / Nを振ること。接種物として最終OD 600 = 0.01に水を滅菌1ミリリットル中にO / N細胞培養物を希釈する。 （培養および汚染を避けるために、層流フード中の細菌を希釈する。） </li><li>各細菌のための同等のOD 600 = 0.01と1ミリリットル中に1：混在種のバイオフィルムを用いた実験では、1の比に2細菌培養を希釈。 </li><li>フローセルを接種する。三方弁からフローセル入口に接種物1mlを注入する。注射後、細菌細胞をカバーガラスに付着させ、1時間の流れを一時停止。 （フローセルが懸濁された細胞は、カバースリップ上に沈降させるためにカバースリップ側を下に置かれていることを確認します。） </li><li> 1時間後、フローを再開し、3日間、各入口0.03 ml /分の一定速度でフローセルに成長培地をポンピングする。 </li></ol> 2.共焦点顕微鏡を用いて栄養グラデーションに応じて、バイオフィルムの開発の特徴付け注：P.緑膿菌は、構成的に発現したGFPが、Eで画像化することができる混合種のバイオフィルム中の大腸菌は、対比によって画像化されなければならない。 <ol><li>共焦点顕微鏡を用いて3日間のバイオフィルムを観察します。代表的な結果を得るには、63Xの目的とした共焦点顕微鏡を使用してバイオフィルムを観察する。イメージング、マークの前にカバーガラス側のグリッドダブルインレットフローセル。 （このグリッドの目的は、実験者がフローセルチャンバ内の撮像領域を見つけることを可能にすることである。） </li><li> 、対比などSTYO 62などの緑色蛍光核酸染色などの細胞透過赤色蛍光核酸染色、10μlのを希釈、原液（1 mM）を990μlの滅菌水にしてから、ゆっくりとシリンジを用いて希釈染みを注入するために、上流側の三方弁からフローセルチャンバー。停滞フローセルを維持し、30分間、暗所で、その後15分間、結合していない汚れを洗い流すためにフローを再開。 </li><li>共焦点イメージングを行います。励起のための488nmアルゴンレーザーとGFP（500から535ナノメートル）と（緑色蛍光核酸染色のため、650〜750 nm）の核酸染色のためのチャネルを収集放出をアクティブにします。明るく清潔なイメージを持っているように、両方のチャネルのためのゲインおよびオフセットを調整します。 XYZと同時撮像モードを選択します。 IDENするZ-コントロールノブを使用して、フィールド内のバイオフィルムの底部と頂部をtify。 3次元画像スタックを取得するための0.5μmからのz段階を設定する。 （画像取得のための4つのラインの平均を使用して、高画質を確保するために）。 </li><li>三つにおける空間フローセル内のバイオフィルムの発達のパターン、画像、バイオフィルムをマッピングする複数の長手方向（x）のフローセル入口に沿って距離が、 図1に示すように、3つの横方向（y）に、課された栄養勾配に対する相対位置。 </li></ol>保守党蛍光トレーサーの注射によって3の特徴付け内部溶質輸送注：そのようなCy5のような保守的な蛍光トレーサー、バイオフィルム内の溶質移動パターンを特徴付けるために使用することができる。 <ol><li>ストック溶液としてミリリットルの10mg /の最終濃度まで水でのCy5（モノ反応性NHSエステル）に溶解する。 -20℃の冷凍庫でCy5の原液を保管してください。 注：Cy5標識が光sensitであるためIVEは、ストアは、希釈し、暗所にCy5のソリューションを注入する。 </li><li>蛍光トレーサーの注射の前に、（63X対物レンズを使用）共焦点顕微鏡を用いて3日間のバイオフィルムの3次元画像スタックを取る。 （バイオフィルムコロニーの広い領域は、色素の輸送での時系列の観測に最適です。）（ 図5（a）に示すように）また、イメージングのための十分に分離したコロニーを有するz平面を選択します。 </li><li>各Cy5の注入実験のために、20μg/ mlのCy5標識の濃度を有する注射溶液を得、滅菌水998μlの中のCy5ストック溶液2μlを希釈する。 </li><li>流れを一時停止し、3方弁を介して注射器を用いて、フローセルの上流​​にCy5の溶液を注入するポンプを停止する。 （これは、注入しながら流路に入るの気泡を防止することが重要である。バブルトラップが戻って注入中に開いたままにすべきである。） </li><li> Cy5の溶液を注入した後、バブルトラップを閉じる三方弁を調整し、再起動するフローセルに注入Cy5のソリューションを提供するポンプ。 </li><li> XYTする共焦点撮像モードを切り替えます。同時撮像モードの下でのCy5とGFPのチャンネルをアクティブにします。定量化のために重要である、信号の飽和を避けるために、（レーザー強度、ゲイン、オフセット）Cy5の強度に共焦点設定を調整します。 （高時間分解能は、染料浸透を可視化することが好ましい。ただし、高速走査は、画像品質を低下させる。）、撮像の時間分解能および画質のバランスをとるために、適切な走査速度とライン平均値を選択する。このプロトコルの4のライン平均0.15 60Hzのフレームレートを使用。 </li><li> （静止0.03ミリリットル/分の流速で）フローセルにCy5標識を提供するためのフローを再開。同時に時系列共焦点イメージングを開始する。 </li><li>放射状に2-Dの円形のバイオフィルムコロニー内のCy5強度を平均化することによりCy5の浸透を定量化する。最初のバイオクラスターのエッジを識別する、平均化するために、クラスタの2-D区間の距離マップを生成する、最後にCy5の強度の平均半径方向のパターンが浸透曲線（ 図6参照）を生成する。 <ol><li>計算上3.8ステップ実現するために、Biospa社（バイオフィルム空間パターン解析）ソフトウェアパッケージ（リクエストに応じて利用可能未発表、ソフトウェアパッケージとマニュアル）、または他の画像解析プログラムを使用しています。 </li><li> Biospa社を使用するには、まずBiospa社に設定した画像をインポートします。その後、バイナリイメージを作るために、GFPおよびCy5チャンネルのための適切なしきい値を選択します。分析/計算メニューで、高度な分析と、その後拡散分析を選択します。クラスタのエッジを定義し、関心領域（ROI）のような1つのクラスタを選択するために、多角形ツールを使用してGFPチャネルを使用。 </li><li>二重拡散分析を実行するために選択されたバイオフィルムのクラスタをクリックします。拡散分析結果を保存し、検量線を用いてCy5の濃度にCy5の強度を較正する。 <ol><li>のCy5 conceにわたってCy5の強度を測定し、Cy5の濃度の較正曲線を生成する共焦点顕微鏡下ntration勾配。 （Cy5の強度と濃度は線形の関係を有する。） </li></ol></li></ol></li></ol> 4.追跡蛍光粒子によって周囲の流れ場の特徴付け注：蛍光ビーズのような蛍光粒子は、バイオフィルムの周りの流れ場を特徴付けるために使用することができる。バイオフィルムの周りの流れ場は、粒子追跡速度測定ソフトウェアを使用して、パーティクルの位置の時系列観測値から算出することができる。ここに示す結果はストリーム2.02ソフトウェアパッケージ16（ソフトウェアのダウンロードとで利用できるユーザーガイドを用いて得られた<a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ）。 <ol><li> 0.2％の最終固形分濃度が0.5 mlの最終容積に滅菌水で蛍光マイクロビーズ（直径約1ミクロン）で希釈する。渦は、マイクロビーズがいることを確認するよく分散されている。 </li><li>ステップ3.3から3.5から手順以下のフローセルに希釈された蛍光マイクロビーズを注入してお届けします。粒子経路の正確なトラッキングを可能にするために、比較的低流量（0.01ミリリットル/本論文では、粒子追跡結果のための時間）を使用します。 </li><li> 1のzスライスにおける粒子の動きを追跡し、時系列画像を撮影するモードをXYT共焦点設定を切り替える。 （1ヘルツのフレームレートは、この論文に示されている代表的な結果を得るために使用した。）を繰り返して、粒子噴射し、画像を別のzの位置における3次元流れ場を生成する。 </li><li>前工程の時系列（上利用可能なソフトウェアのダウンロードとマニュアルのImageJを使用してバックグラウンドの蛍光シグナル（画像セットの最初の取得画像内の信号）を減算することによって共焦点画像<a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/を</a> ）または他のプログラム。 </li><li> ImageJのでは、画像セットの最初の画像を開き、画像セットをインポートします。プロセスの下で/画像のCalculator、画像セットから最初の画像を差し引く。前処理された画像セットを保存します。 </li><li>ストリーム2.02においてフローベクトル、インポート時系列の共焦点画像を算出する。 「オープン·プロセスビュー」の下で、「粒子の識別」を選択し、実行します。粒子を識別するために、適切なしきい値を使用してください。 1ミクロンの粒子の最小値と最大直径のしきい値として0.5と5μmのを使用してください。 </li><li>その後、「オープンプロセスビュー」の下に、粒子のパスを生成するために、「PTV解析パイプライン」を選択して実行。彼らは、粒子の動きを表現するかどうかを確認するために、粒子のパスを確認してください。最後に、選択して、フローベクトルマップを生成する「速度場の作成」を実行します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

バイオフィルムの化学勾配に応じて、周囲の流れの微小環境上のバイオフィルムの成長、および内部輸送の制限に起因するバイオフィルムの不均一性の影響：私たちは三つの重要なバイオフィルムと環境の相互作用を特徴づけるための方法のスイートを実証した。 まず、バイオフィルム発生のために明確に定義された化学勾配を課すことは、新規なマイクロ流体フロー?...

細胞外ポリマーマトリックス1で囲まれた細胞凝集物-微生物は、表面およびフォームバイオフィルムに付着する。バイオフィルムは、内部溶質移動の制限と細胞代謝2,3における空間的変化の組み合わせから得られる劇的な空間的不均一性を持っているので、バイオフィルムは、非常に異なる個別の微生物細胞から振る舞う。酸素と栄養素濃度が大幅にバイオフィルムと流体と、さらにバイオフィルム2における内枯渇取得周囲の間の界面に減少する。バイオフィルム呼吸およびタンパク質合成の空間変動もローカライズ酸素および栄養素利用2に対する応答として生じ得る。 水生および土壌環境では、ほとんどの細菌はバイオフィルムに住む。ナチュラルバイオフィルムは、炭素と窒素を循環し、金属4,5の削減などの重要な生物地球化学的処理を行う。臨床的には、バイオフィルム形成はRESPONSです長期の肺と尿感染症の6のためible。バイオフィルム中の細胞はそれらのプランクトン様の対応物6と比較して、抗菌剤に対して極めて高い耐性を有するので、バイオフィルム関連感染症は非常に問題である。バイオフィルムは、多様な設定において重要であるため、研究のかなりの量は、バイオフィルム活性とバイオフィルム中の空間的不均一性と、周囲の微小環境を制御する環境要因を理解することに焦点を当ててきた。 以前の研究では、バイオフィルムの開発が強く環境要因の数によって調節されることを見出した：バイオフィルムは、種々の流動条件下で、異なる形態を開発する。酸素と栄養素の可用性に影響を与えるバイオフィルム形態。と流体力学的せん断応力が表面に浮遊性細胞の付着とバイオフィルム7-9からの細胞の脱離に影響を与えます。また、外部フロー条件は、基板のintの配信に影響を与えるO及びバイオフィルム10内。バイオフィルムの成長はまた、物理的および化学的条件を囲む変える。例えば、バイオフィルムの成長は、酸素と栄養2のローカル枯渇をもたらす。バイオフィルムは、周囲の環境11からの無機および有機化合物を蓄積。とバイオクラスターは流れをそらすと表面摩擦12,13を増やす。バイオフィルムは、非常に複雑な方法でその周囲の環境と相互作用するので、同時にバイオフィルムの特性および環境条件についての情報を得ることが重要であり、学際的なアプローチが包括的にバイオフィルム環境の相互作用を特徴付けるために使用される必要がある。 ここでは、課せられた栄養勾配の下でのモノ種とデュアル種のバイオフィルム内の微生物の増殖に空間パターンを特徴づけるために統合された一連の方法を提示し、局所的な化学的および流体微小環境の結果の変更を観察する。我々モミstは明確な化学勾配下バイオフィルムの成長を観察するための最近開発されたダブルインレットマイクロ流体フローセルの使用を記載している。次に、栄養条件の範囲の下でバイオフィルム中の細菌は、 緑膿菌、大腸菌 、2種の成長を観察するために、このマイクロ流体フローセルの使用を示す。我々は、バイオフィルムコロニーへの蛍光トレーサーの伝播のインサイチュ可視化定量的バイオフィルムにおける溶質輸送のパターンを評価するために使用できる方法を示す。最後に、共焦点顕微鏡下で行う、どのマイクロ粒子追跡速度測定を示し、成長したバイオフィルムの周りに局所的な流れ場を得るために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>Peristaltic Pump</td><td>Gilson</td><td>Miniplus 3</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Pump Tubing 0.50&amp;nbsp;mm OVC, Orange/Yellow</td><td>Gilson</td><td>F117934</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock</td><td>Smiths Medical&amp;nbsp;</td><td>MX9311L</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels</td><td>ML Solar LLC</td><td></td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Pyrex Medium Bottle, 1&amp;nbsp;L, GL45</td><td>VWR</td><td>16157-191</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>C-FLEX Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>06422-02</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>1 ml TB Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Polymer Tubing</td><td>IDEX</td><td>1520G</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Sterile Intramedic Luer Stub Adapter</td><td>Clay Adams</td><td>427564</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>HACH</td><td></td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Syringe filters - sterile (0.2 &amp;mu;m)</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719A</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>MAXQ Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Ammonium sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20908-A7</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Monobasic potassium phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Magnisium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Calcium sulfate dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3771</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Iron(II) sulfate heptahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215422</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Manganese(II) sulfate monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Copper(II) sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451657</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Zinc sulfate heptahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z0251</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Cobalt(II) sulfate heptahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Sodium molybdate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>243655</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>TCS SP2 Confocal Microscopy</td><td>Leica</td><td></td><td>Fluorescent imaging</td></tr><tr><td>SYTO 62</td><td>Life Technology</td><td>S11344</td><td>Fluorescent imaging</td></tr><tr><td>Cy5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>PA15100</td><td>Fluorescent imaging</td></tr><tr><td>Red Fluorescent (580/605) FluoSphere</td><td>Life Technology</td><td>F-8801</td><td>Fluorescent imaging</td></tr><tr><td>BioSPA</td><td>Packman Lab</td><td></td><td>Image Processing</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image Processing</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Image Processing</td></tr><tr><td>Streams 2.02</td><td>University of Cantebury</td><td></td><td>Image Processing</td></tr></tbody></table>

methods for characterizing the co-development of biofilm and habitat heterogeneity

バイオフィルムは、複雑な構造を持ち、重要な空間的不均一性を生成する表面結合微生物群集である。バイオフィルムの開発が強く、周囲の流れおよび栄養環境によって調節される。バイオフィルムの成長はまた、複雑な流れ場と溶質輸送パターンを生成することによって、局所微小環境の不均一性を増大させる。バイオフィルムとそのローカルマイクロ生息地間のバイオフィルムとの相互作用における異質の開発を調査するために、我々は緑膿菌とP.のデュアル種のバイオフィルムのモノ種のバイオフィルムを成長したマイクロ流体フローセル中の栄養勾配下緑膿菌、大腸菌 。我々は、フローセル内の栄養勾配を作成するために成長し、これらの条件下で、バイオフィルム発生を可視化するための詳細なプロトコルを提供する。また私たちは現在、バイオフィルム構造で空間パターンを定量化するための光学的方法の一連のためのプロトコル、フローdistriバイオフィルム上butions、および大量輸送の周りや生物膜コロニー内。これらのメソッドは、バイオフィルムと生息地の異質の共同開発の総合的な調査をサポートしています。

ダブルインレットマイクロ流体フローセルは、フローチャンバー内の2つの溶液を混合することにより形成された、明確に定義された化学勾配下でのバイオフィルムの成長の観察を可能にする。得られた化学勾配が以前の染料注入により観察し、Song ら 14により詳細に特徴付けた。 図1に示すように、滑らかな濃度勾配は、横方向に形成された。濃度プロファイルは?...

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Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K ビュー.  Northwestern University. Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies. 

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Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

遺伝学

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

環境学

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

免疫・感染学

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

ハイスループットの使用<em&gt;インビトロ</emオーラル多種バイオフィルムを開発するために&gt;マイクロ流体システム

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

生物工学

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

研究のための方法論<em&gt; B。枯草菌</em小分子バイオフィルム阻害剤を特徴付けるためのモデルとしての&gt;バイオフィルム

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

しわコロニーの開発を使用したバイオフィルム形成を評価するための半定量的アプローチ

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

生物学

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural integrity. The nosocomial pathogen, Pseudomonas aeruginosa, is known to adopt a biofilm mode of growth, causing chronic pulmonary infection in patients with cystic fibrosis (CF). The computer program, COMSTAT, is a useful tool for quantifying antimicrobial-induced changes in P. aeruginosa biofilm architecture by extracting data from three-dimensional confocal images. However, standardized operation of the software is less commonly addressed, which is important for optimal reporting of biofilm behavior and cross-center comparison. Thus, the aim of this protocol is to provide a simple and reproducible framework for quantifying in vitro biofilm structures under varying antimicrobial conditions via COMSTAT. The technique is modeled using a CF P. aeruginosa isolate, grown in the form of biofilm replicates, and exposed to tobramycin and the anti-Psl monoclonal antibody, Psl0096. The step-by-step approach aims to reduce user ambiguity and minimize the chance of overlooking crucial image-processing steps. Specifically, the protocol emphasizes the elimination of subjective variations associated with the manual operation of COMSTAT, including image segmentation and the selection of appropriate quantitative analysis functions. Although this method requires users to spend additional time processing confocal images prior to running COMSTAT, it helps minimize misrepresented biofilm heterogenicity in automated outputs.

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Antimicrobial-induced changes to Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture differ among clinical isolates cultured from patients with cystic fibrosis and chronic pulmonary infection. Following confocal microscopy, COMSTAT software can be utilized to quantify variations in biofilm architecture (e.g., surface area, thickness, biomass) for individual isolates to assess the efficacy of anti-infective agents.

COMSTATソフトウェアを使用した In vitro バイオフィルムアーキテクチャに対する抗菌剤の影響の定量化

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural ...

Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While in-house grown 2D epithelial monolayers lack true representation of the in vivo situation, commercially available tissue models are often overlooked due to their cost and practicality. However, with careful planning, such models provide reproducible platforms for a vast array of different applications. Here, we report the use of epithelial models that can be utilized for a wide variety of experimental purposes to investigate host-pathogen interactions in various ecological niches, such as the oral cavity, skin, and vaginal mucosa. From simple planktonic cells to complex biofilm co-culture, epithelial models are used to assess microbial adherence and invasion, and to evaluate the host response at a transcriptional and/or protein level, with scope for more detailed profiling using different omics approaches. Furthermore, these biological systems can be used as more accurate test beds for evaluating conventional and novel antimicrobial activity in a complex host-pathogen microenvironment in vitro. The protocols described herein document how models are handled upon arrival and prepared in the laboratory for co-culture stimulation with biofilm communities. The methods detail how experimental outputs are achieved from the model systems, including the processing of tissue, the co-culture setup, and data generation. These experiments include host gene expression through single- and multiplex qPCR analyses and inflammatory protein detection using ELISAs. In conclusion, epithelial models provide useful in vitro systems for preclinical investigatory studies into simple or complex host-pathogen interactions.

The present protocol outlines the application of organotypic tissue models for investigating host-pathogen interactions in vitro. Specifically, the model system described uses a multi-layered oral epithelium exposed to microorganisms associated with biofilms (dental plaque) within the context of oral health versus disease.

In Vitroでの宿主-病原体相互作用の研究のための器官型組織モデルシステム

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While ...

A Bead Movement Based Computational Framework for 3-Dimensional Analysis of Biofilm Material Heterogeneity

Differences in the material properties of bacterial biofilms have been observed in biofilms of different bacterial species, within the same species under different growth conditions and after treatment with matrix modifying molecules. To better quantitate the material properties of 3D biofilms, an experimental and computational workflow was developed and applied to examine differences between Enterococcus faecalis, Salmonella enterica serotype Typhimurium and Escherichia coli biofilms as well as the role of the amyloid curli in confirming rigidity to Enterobacteriaceae biofilms. The spatio-temporal dynamics of 1 &#181;m carboxylate beads in biofilms were tracked in 20 &#181;m 3D biofilms over 20 minutes. The 4D image stacks were processed using the Mosaic plugin in ImageJ to produce 3D trajectory data of bead movement. This trajectory data was analyzed with a newly developed Bead Evaluator toolbox, where movement data, including trajectory lifespans, bead velocities, cell densities along trajectories, and bounding box information were computed and stored in csv-files. This paper presents the workflow from experimental setup and image recording to bead trajectory computation and analysis. The structure of curli-containing biofilms resulted in more stable bead interactions and less bead movement than in curli-mutant and Enterococcal biofilms. Bead movement did not appear strongly dependent on cell density when measuring the bead velocity and trajectory bounding box volume, supporting the hypothesis that other material properties of the biofilms control the bead dynamics. This technique is widely applicable to quantitating differences in biofilms of different matrix compositions as well as biofilms before and after matrix-modifying treatments.

We describe a method for analyzing and quantifying the movement pattern of 1 &#181;m carboxylate beads through heterogeneous bacterial biofilms. Comparison of the movement patterns can be used to quantitate differences in material properties of biofilms.

Differences in the material properties of bacterial biofilms have been observed in biofilms of different bacterial species, within the same species under ...

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

要約

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微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

フローサイトメトリーによる水生バイオフィルムの特性

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

ハイスループットの使用

研究のための方法論

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

しわコロニーの開発を使用したバイオフィルム形成を評価するための半定量的アプローチ

COMSTATソフトウェアを使用した In vitro バイオフィルムアーキテクチャに対する抗菌剤の影響の定量化

In Vitroでの宿主-病原体相互作用の研究のための器官型組織モデルシステム

A Bead Movement Based Computational Framework for 3-Dimensional Analysis of Biofilm Material Heterogeneity

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

要約

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微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

ハイスループットの使用

研究のための方法論

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

しわコロニーの開発を使用したバイオフィルム形成を評価するための半定量的アプローチ

COMSTATソフトウェアを使用した In vitro バイオフィルムアーキテクチャに対する抗菌剤の影響の定量化

In Vitroでの宿主-病原体相互作用の研究のための器官型組織モデルシステム

A Bead Movement Based Computational Framework for 3-Dimensional Analysis of Biofilm Material Heterogeneity

フローサイトメトリーによる水生バイオフィルムの特性