この作品は、医学のウェイクフォレスト大学医学部との共同研究契約の下で、RJレイノルズ·タバコ·カンパニー（RJRT）によって資金を供給されている。 GLプラサドはRJRTのフルタイムの従業員である。

注：この研究を行うための書面によるインフォームドコンセントがグッド臨床プラクティスごとに、IRBの承認の下で地元の臨床研究ユニットで得られた。血液の処理は、PBMCおよび他の細胞培養実験の単離は、微生物学的に無菌用品および試薬を用いて、無菌条件下で行われる。 1. WS-CMの準備<ol><li>以前に12を説明したように、WS-CMを生成します。 <ol><li> 35-60-2、溶液にパフボリューム、秒でパフの間隔、及びパフ時間：以下の喫煙レジメンを使用したフェノールレッドを含まない1640培地（RPMI）ロズウェルパーク記念研究所を通じて4 3R4F参照タバコから煙を渡すことで、WS-CMを準備secである。各調製物を20mlのサンプルを生成する。 </li></ol></li><li>日付、時刻完了し、タバコの名前と番号付きラベルチューブ（S）。喫煙が完了した直後にC -80℃で500μlのアリコートに保管してください。 </li><li>凍結されたWSのアリコートを分析以前12に記載のように、ニコチン、タバコ特異的ニトロソアミン、および多環式芳香族炭化水素のレベルを決定する-CM。 </li></ol> PBMCの2の分離<ol><li> （タバコ製品の非消費者である）健康なドナーからの新鮮な血液を収集ウェイクフォレストバプテスト保健IRB 15とは別の承認の下に下記のように新鮮な血液由来のPBMCを分離します。 <ol><li>血液バッグの到着前に、500mlの瓶、はさみ、分離バッファ、及びダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）（RT）、バイオセーフティーレベル2（BSL-2）細胞培養フード中で準備している。分離バッファは、光から保護されなければならない。 </li><li>逆さまに血液バッグを持って、ちょうどそれがチューブの少なくとも3センチ残してクランプされた場所の下にチューブをカット。 </li><li> 500ミリリットルボトルからキャップを外し、ボトルの口の上にチューブを保持する。血液バッグをピックアップし、血液がTにバッグから自由に流れることができるようにそれを反転袋が空になるまで、彼は、ボトル。血液が気泡を作成しないようにまっすぐとして対ボトルの内壁上に流れるようになります。 </li><li>血液の分離バッファの5：1の比率でボトル内に分離バッファを注ぐ。転倒、10回、しっかりとボトルをキャップとそっとそれを反転。室温で1時間、ライトをオフにインキュベートし、細胞培養フードで瓶のままにしておきます。 </li><li>光、麦わら色の層は血の上に構築します。 50ミリリットルコニカルチューブに25ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、この層を除去する。血液を寄付被写体によって、300mlの - 収集量は50から異なる場合があります。 </li><li> RTで10分間、200×gでチューブを遠心。 </li><li>暗い血色のペレットを残して、半透明の上清を吸引除去する。ペレットはルーズが、粘性になります。 </li><li>ピペットで15ミリリットルコニカルチューブに単離緩衝の3ミリリットル。 </li><li>再懸濁ペレットに、Sに集め麦わら色の液体のすべての50ミリリットルのためにDPBSの20ミリリットルを追加TEP 2.1.5。ボルテックスは完全に混合し、複数の管からの再懸濁した液体を統合する。この液体は、血液細胞を懸濁含ま。 </li><li>トランスファーピペットで、ステップ2.1.8において分離緩衝液3mlに転写懸濁血液細胞を5ml。 2つの別個の層を作成するために、ゆっくりと静かに細胞懸濁液が含まれている15ミリリットルコニカルチューブを傾けます。最小限の加速とブレーキなしの室温で40分間400×gでチューブを遠心。 </li><li> 50ミリリットルコニカルチューブにしたPBMCを含む得られた濁った中間層（軟膜）を除去するために、転送ピペットを使用してください。その下に他の明確なレイヤを描画することは避けてください。各50ミリリットルコニカルチューブにせいぜい25ミリリットルを転送します。 </li><li>細胞を洗浄するために（50ミリリットルコニカルチューブの全体の残りの容量を埋めるために、またはそれ以上）の低温のランニングバッファーの25ミリリットルを追加します。 4℃で10分間400×gで細胞を遠心します。 </li><li>ランニング緩衝液10mlのペレットを再懸濁。これはPBMCを含まれています。細胞をカウントし、IMを使用凍結氷の上に置くmediatelyか。 </li></ol></li></ol> 3.凍結とのPBMCを解凍<ol><li>遠心分離機400×gで10分間のステップ2.1.13に回収したPBMCを。 </li><li>製造者の指示に従ってイソプロピルアルコールで冷凍コンテナを埋める。注意：イソプロピルアルコールは可燃性および急性毒性である。 </li><li> 20％ウシ胎児血清（FBS）および10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含有するRPMI 1640培地（4℃）でペレットを再懸濁する。これは凍結培地RPMI 1640である。約5×10 7細胞/ mlを有するサスペンションをもたらす凍結培地の量でペレットを再懸濁する。凍結のために利用可能な細胞の数が異なります。 </li><li>の2mlクリオチューブに細胞懸濁液の1mlアリコートを分配し、冷凍コンテナにクライオチューブを置き。 O / Nを格納し、クリオチューブを削除し、に格納する転送するために-80℃の冷凍庫にクライオチューブに冷凍コンテナを置きます-190℃〜-150℃の極低温冷凍機。 </li><li>低温貯蔵からのクライオチューブを外し、37℃の水浴中で穏やかに撹拌しながら急速に解凍。 </li><li>直ちに10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％L-グルタミンを含有する10ミリリットルRPMI 1640完全培地（4℃）にて15mlコニカルチューブにクライオチューブ中で解凍したPBMCを転送する。解凍したクライオチューブの内容物は、最大の細胞生存率15を得ることができる限り速やかに転送されるべきである。 </li><li> 10分間400×gでのPBMCを遠心。 </li><li> 5ミリリットルRPMI 1640完全培地でペレットを再懸濁し、細胞を数える。 </li><li>トリパンブルー排除法のような確立された方法により細胞生存率を測定する。 95％ - 一般に、この方法では、細胞生存率は約90である。 PBMCを今の実験で使用する準備が整いました。 </li></ol> 4.細胞死の決定注：ここに記載されている希釈はこのSTUのためのものでありDY。希釈は、それに応じて変更することができる。 <ol><li>以下に示すように、100μl/ウェルの全体積のRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMまたはニコチンを希釈する。 </li><li>以下の濃度にWS-CMを希釈：0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、（WS-CM中のニコチン含有量に基づく）、等のニコチン単位の5μg/ mlの12。 </li><li> 100、200、500、750、1000,2000、および3000 / mlの以下の濃度にRPMI培地中でニコチンを希釈する。注意：ニコチンは急性毒性と環境に有害である。 </li><li>よく1×10 6細胞の濃度で/各ウェルにRPMI完全培地に懸濁したPBMCを100μlを追加。細胞+ WS-CMやニコチンの総容量は200μl/ウェルとなります。 </li><li>本研究の目的のために、上記のようにプレートの二組を準備。プレートを覆い、24時間、37℃で3時間、5％CO 2のための一つのプレートに1つのプレートをインキュベートする。必要に応じて時間点を調整します。 </li&gt; <li>氷冷ランニングバッファー200μlで細胞を再懸濁最終的に、3分間300×gで遠心分離し、上清を吸引し、カバープレートとプレートの底をボルテックスとすることにより、室温で細胞を洗浄し、洗浄工程をもう一度繰り返します。 </li><li> 100μl/ウェルの総容積のために各ウェルに7-アミノD（7AAD）5μlのに続いてバッファを実行しているの95を添加する。室温で15分間、暗所でプレートをインキュベートする。 </li><li>クラスターチューブにバッファを実行している100μlのを追加します。クラスターチューブ、プレートの各ウェルからの細胞懸濁液のボリューム全体を転送し、フローサイトメーターでサンプルを取得する。 </li><li>解析ソフトウェアフローサイトメトリーを使用して、7AAD陽性細胞の割合を決定します。 </li></ol> 5. EC 50の決定<ol><li> WS-CMとニコチンのEC 50値は、PBMCの7AAD陽性染色によって決定される。 </li><li> EC 50値は、濃として定義されentrationれる細胞の50％が24時間のアッセイにおいて、もはや生存可能ではなく、値は、等ニコチン単位/ mlのμgのように表現される。 </li><li>この研究の目的のために、EC 50値は、それぞれ、WS-CM及びニコチン1.56 / mlのと1650μgの/ mlであると決定された。 </li></ol> 6.分泌されたサイトカイン注：ここに記載されている希釈液を本研究の目的のためのものです。希釈は、それに応じて調整することができる。 <ol><li> 0.3、1.56、3の濃度、及び、等ニコチン単位を5μg/ mlの100μl/ウェルの全体積にRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMを希釈する。 </li><li>以下の濃度にニコチンを希釈：100、200、500、750、1000,2000、及び3000μg/ mlの。注意：ニコチンは急性毒性と環境に有害である。 </li><li>よく1×10 6細胞の濃度で/各ウェルにRPMI完全培地に懸濁したPBMCを100μlを追加。細胞+ WS-CMやニコチンの総容量は200μl/ウェルとなります。 </li><li>プレートを覆い、37℃で3時間および5％CO 2でインキュベート。 </li><li> 、3分間300×gで遠心分離し、上清を吸引し、カバープレートとプレートの底をボルテックスし、最後の氷冷200μlのバッファーを実行し、洗浄工程をもう一度繰り返しで細胞を懸濁して室温で細胞を洗浄。 </li><li> RPMI完全培地200μlを追加し、洗浄工程をもう一度繰り返します。 </li><li>各ウェルに10μg/ mlのLPS培地200μlを追加します。 </li><li>プレートを覆い、4時間、24時間、48時間、または37℃で72時間、5％CO 2でインキュベート。必要に応じてインキュベーション時間を調整します。 </li><li> 3分間300×gでプレートを遠心します。 </li><li>ステップ7および8でアッセイを実行するために-80℃の冷凍庫でよく各店舗からの上清175μlをしてください。 </li></ol> 7.サイトメトリービーズアレイアッセイ &lt;OL&gt; <li> ステップ6.10とCBAアッセイでの使用から調製した細胞上清を解凍する。製造業者の指示に従ってサイトメトリービーズアレイ（CBA）アッセイを実行します。 </li></ol> 8. IL-8 ELISA <ol><li> ステップ6.10から細胞上清を解凍し、IL-8 ELISAで使用しています。製造業者の指示に従ってELISAアッセイを実行します。 </li></ol> 9.細胞内染色およびフローサイトメトリー注：ここに記載されている希釈液を本研究の目的のためのものです。希釈は、それに応じて調整することができる。 <ol><li> 0.3、1.56、3の濃度、及び、等ニコチン単位を5μg/ mlの100μl/ウェルの全体積にRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMを希釈する。 </li><li> 2、10、50、100、500、2000、及び4000 / mlの：同じプレートにおいて、以下の濃度にニコチンを希釈する。注意：ニコチンは急性毒性があり、環境にハザルdous。 </li><li> /ウェル1×10 6細胞の濃度でRPMI完全培地に懸濁したPBMCを100μlを追加。細胞+ WS-CMやニコチンの総容量は200μl/ウェルとなります。 </li><li>プレートを覆い、37℃で3時間、5％CO 2でインキュベート。 </li><li>氷冷ランニングバッファー200μlで細胞を再懸濁最終的に、3分間300×gで遠心分離し、上清を吸引し、カバープレートとプレートの底をボルテックスとすることにより、室温で細胞を洗浄し、洗浄工程をもう一度繰り返します。 </li><li>プレートにRPMI完全培地200μlを追加し、洗浄ステップをもう一度繰り返します。 </li><li> RPMI完全培地を使用した2μL/ mlのGolgiPlugの使用濃度および10μg/ mlのLPSを準備し、各ウェルに200μlを添加する。 </li><li> 37℃で6時間、5％CO 2、プレートをインキュベートする。 </li><li>ステップ9.8の終了時に、バッファー（4℃）を実行し、300で回転で細胞を洗浄4℃で3分間XG。 </li><li>各ウェルにのCytofix100μlのを追加し、4℃で20分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で3分間300×gで1倍Permwash（4℃）でステップ9.9で説明したように、細胞を3回洗浄する。 </li><li>に以下の抗体の1の各5μlの各ウェルに45μLの1x Cytopermをの追加各ウェル：TNF-α-アレクサフルオロ488、IFN-γV500、MIP-1αPE。 30分間4℃でインキュベートする。 </li><li> 1X Permwash（4℃）、4℃で3分間300×gでバッファー（4℃）を実行していると1時間にステップ9.9で説明したように、細胞を2回洗浄します。 </li><li> 2％パラホルムアルデヒド（4℃）200μlで細胞を再懸濁。 12×75mmのチューブに細胞を移し、フローサイトメーターでサンプルを分析する。注意：ホルムアルデヒドは急性毒性と健康被害、腐食性がある。 </li></ol> 10. K562キリングアッセイ NOTE：K562細胞を増殖されるべきであるRPMI完全培地で37℃、5％CO 2での培養では、それらは、アッセイの前に80％のコンフルエンスに達するまで。 <ol><li>バイアルにDMSOを18μLを追加することによって、スクシンイミジルエステル（CFSE）原液カルボ5 mMのを準備します。 </li><li>各ウェルに対して所望の等ニコチン単位またはニコチン濃度を達成するために、100μl/ウェルの全体積にRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMまたはニコチンを希釈する。注意：ニコチンは急性毒性と環境に有害である。 </li><li> /ウェル1.5×10 6細胞の濃度でRPMI完全培地にPBMCの100μlのを追加。 WS-CMまたはニコチンでの細胞の総容積は200μl/ウェルであろう。 </li><li>プレートを覆い、37℃で3時間、5％CO 2でインキュベート。 </li><li>室温で8分間400×gでDPBSと遠心機の10ミリリットルを追加することによって、K562細胞を洗浄。 </li><li> DPBS 10mlの細胞を再懸濁し、K562細胞を数える。 </li><li> CFSE workiを準備1ミリリットルのDPBSにCFSEストック溶液1μlを追加することでNGソリューション。 </li><li> 2×10 7細胞- 1を含むK562細胞懸濁液1mlにCFSEワーキング溶液1mlを加える。ボルテックスし、室温で2分間正確にインキュベートする。 </li><li>すぐにFBSの200μlを添加する。ボルテックスし、室温で2分間正確にインキュベートする。 </li><li> RPMI完全培地の10ミリリットルを加え、室温で8分間400×gでチューブを遠心する。 </li><li> RPMI上清を除去し、ペレットを破るし、RPMI完全培地10mlで細胞を再懸濁し、CFSE標識K562細胞を数える。 </li><li> RTで3分間300×gでプレートを遠心分離することによりPBMCを洗浄する。液体をデカントすることによって、上清を吸引除去する。カバーを取り付け、プレートの底をボルテックス。 RPMI完全培地200μlを加え、洗浄工程をもう一度繰り返します。 </li><li>各サンプルPBMCプレートのウェル、さらに私に：1：15（1.5×10 6のPBMC10万K562s）の比率でCFSE標識K562細胞を追加37℃で5時間、5％CO 2のためncubate。 </li><li> RTで3分間300×gで遠心分離することにより細胞ミックスを洗ってください。液体を廃棄することにより、上清を吸引除去する。カバーを置き、プレートの底をボルテックス。 </li><li>ランニング緩衝液200μlを加え、ステップ10.14 1より多くの時間に記載されて洗浄工程を繰り返します。 </li><li> 100μl/ウェルの総容積のために各ウェルに7AAD5μlのに続いて実行されているバッファの95を添加する。室温で15分間、暗所でプレートをインキュベートする。 </li><li>各ウェルにバッファを実行している100μlのを追加し、クラスターチューブにプレートの各ウェルから細胞懸濁液のボリューム全体を転送し、フローサイトメーターでサンプルを取得する。 </li><li>解析ソフトウェアフローサイトメトリーを使用して、7AAD陽性とCFSE陽性細胞の割合を決定します。 </li></ol>

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The authors declare that there are no conflicts of interest.

我々は、他の以前のTPPによるPBMCの処理は、サイトカインおよび14を殺し、標的細胞として機能的措置の発現および分泌を含むいくつかの応答を抑制することを実証した。前作に記載された実験の方法はより長いインキュベーション時間を必要とし、大きさが14で控えめだった。基本のためにこの魅力的なex vivoでモデルの潜在的な応用を考えると応用研究、我々はこれら...

心血管疾患（CVD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）および癌1,2を含む慢性喫煙の健康への悪影響に対する知識ポイントの大幅なボディ。慢性の喫煙は、技術が病態生理学的効果の分子基盤を解明することにおいて有用であり、炎症および免疫抑制を引き起こすことが知られており、これらの変化は、喫煙3における微生物感染および癌の危険性の増大に寄与することが報告されている。 インビトロおよびエキソビボタバコの煙4-9（ 表1）と、様々なタバコ製品10,11の新たな規制を案内するための重要なツールとして認識されている。 例えば、我々は、全煙馴化培地（WS-CM）および総粒子状物質（TPM）などの可燃タバコ製品製剤（のTPP）をはるかに細胞毒性および有害にあることを実証している不燃性のTPPまたはニコチン12,13よりDNA。公表された研究と一致して、最近、可燃のTPPまたはニコチン12,13ことが報告された。発表された研究と一致して、我々は最近、可燃のTPPが著しい免疫抑制を引き起こしたことを報告した。これは、受容体（TLR）-ligands Toll様の抑制によって証明された、サイトカイン分泌を刺激し、細胞（K562） のex vivoモデル14でのPBMCによる殺傷を狙っ。タバコの煙によって誘発される疾患プロセスにおける炎症の重要性を考えると、タバコの煙の免疫調節効果を評価するためのアッセイ条件のさらなる最適化は、このレポートに記載されている。 ex vivoでのアッセイは、典型的に、細胞内および分泌されるサイトカインなどアッセイ14を殺すK562細胞における細胞傷害性T細胞およびNK細胞の細胞溶解機能を測定した。アッセイは、WS-CM及びニコチン及びPBMCのその後の刺激とのプレインキュベーションを含んだ3日間にわたってTLRアゴニストとの;最終的な読み出しは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて、および/またはフローサイトメトリーを行っている。我々は、TLR-4受容体に結合し、細胞内サイトカインおよびサイトカインの分泌の産生をもたらすのPBMCを刺激し、細菌性リポ多糖（LPS）を利用する。単離PBMCを、細胞死アッセイ、およびIL-8の定量化のためのTPP、我々はまた、本発明の方法の免疫調節効果を評価するための様々なアッセイ手順の最適化に加えて。これらの方法は、他の研究課題に対処するために適用され、さらなる調節文脈でタバコ製品を評価するために洗練されてもよい。 表1 のin vitroの報告書を発表し、ex vivoでの方法はたばこ製品製剤のvarilus病態生理学的効果を研究するために使用される CS、タバコの煙媒体。 CSC、タバコの煙凝縮。 CSE、タバコの煙抽出物; ELISA、酵素結合免疫吸着アッセイ; GADPH、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ。定量PCR、定量的ポリメラーゼ連鎖反応。 RT、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応。 TS、タバコの煙。 <table><tbody><tr><td> 著者（研究の年） </td><td> ラーンら （2004） </td><td> ムーディら （2004） </td><td> Oltmanns ら （2005） </td><td> Vayssier（1998） </td><td> Witherden ら （2004） </td><td> ビレルら （2008） </td></tr><tr><td> 細胞を使用 </td><td>ヒト気管支内皮細胞（BEAS-2B）、ヒト好中球</td><td>人間の肺胞上皮細胞（A549） </td><td>ヒト気道平滑筋細胞（HASMC） </td><td>ヒトpremonocytic U937細胞、ヒト単球</td><td>肺胞II型上皮細胞（ATII） </td><td>ヒト単球細胞株（THP-1）、ヒト肺マクロファージ</td></tr><tr><td> TPP使用 </td><td> CSE </td><td> CSC </td><td> CSE </td><td> TS </td><td> CSE </td><td> CS </td></tr><tr><td> メソッドの使用 </td><td> ELISA、定量PCR、マイグレーション、電気泳動移動度シフト</td><td>免疫組織化学、電気泳動、Arrayscanキット、RT-PCR、ELISA </td><td> ELISA、RT-PCR、定量PCR、電気泳動</td><td>ゲル移動度シフト</td><td>光学顕微鏡、電子顕微鏡、電気泳動、ELISA </td><td>定量PCR、ELISA、E-toxateキット（Sigma）を、p65のプレートアッセイ（のTransAM）、電気泳動、種々の免疫アッセイキット</td></tr><tr><td> メジャー </td><td> IL-8、GM-CF、AP-1、NF-κB、移行</td><td>ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、NF-κB、IL-8、pIがκB-α、GADPH </td><td> HO-1、GADPH、RANTES、IL-8、エオタキシン</td><td>ヒートショック/ストレスタンパク質（HSP / Hsp70が）、HF転写因子、NF-κB、TNF-α </td><td>界面活性剤タンパク質（SP-A、SP-C）、IL-8、MCP-1、GRO-α、TNF-α、IL-1β、IFN-γ </td><td> IL-8、IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP1-α、GRO-α、MAPK / JNK / ERKリン酸化、cJUN：DNA結合、グルタチオン、P65：DNA結合</td></tr><tr><td> 最終結果 </td><td> CSEは、AP-1活性化の抑制を介してサイトカイン産生をダウンレギュレートする。 </td><td> H 2 O 2とCSC示差的炎症性サイトカインの放出を調節する、ヒストンデアセチラーゼ活性を低下させる、ヒストンタンパク質のアセチル化を高める。 </td><td>タバコの煙は、TNF-α、20％CSE少ないタバコの煙によるIL-8放出、エオタキシンおよびRANTESの阻害によって強化、HASMCからのIL-8の放出を引き起こすことがあります。 </td><td> TSは、Hsp70の過剰発現およびNFkBの結合活性およびTNF-α放出の阻害に関連したHFの転写因子を活性化した。 </td><td>減少ATII細胞由来ケモカインレベルが肺胞を損なうLAR修理、タバコの煙によって誘発される肺胞の損傷および肺気腫に貢献する。 </td><td>データは、喫煙者は呼吸器感染症が増加している理由のための機構的説明を提供する。生得的反応の抑制は、IL-8の増加を伴う。 </td></tr></tbody></table>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:223px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">12 X 75 tubes</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">2 mL Microtubes</td>
			<td style="width:148px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">3R4F reference cigarettes&#160;&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Univ. of Kentucky, College of Agriculture</td>
			<td style="width:119px;">3R4F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">500 ml bottle</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">7AAD</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">559925</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well flat bottom plate</td>
			<td>Termo Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well round bottom plates</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture hood</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">58110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CFSE</td>
			<td style="width:148px;">Molecular Probes Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cluster tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td>4401</td>
			<td>Harmful if swallowed, carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555028</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide )</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DPBS</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FBS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCAP Array</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">652099</td>
			<td>Software analyzes CBA data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Filter unit</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Canto II</td>
			<td>&#160;8 colors, at Ex 405 and Em785.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Calibur</td>
			<td>&#160;4 colors at Ex 495 and Em 785.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Flow cytometry analysis software</td>
			<td style="width:148px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Freezing Container</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Contains DMSO,&#160; irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GogliPlug</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555029</td>
			<td>Carcinogen, Irritant, Corrosive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:223px;">H2SO4</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human Inflammatory Cytokine Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IFN-&#947; V-500 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Horizon</td>
			<td style="width:119px;">561980</td>
			<td>&#160;skin sensitizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IL-8 ELISA Kit</td>
			<td style="width:148px;">R and D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Isolation Buffer</td>
			<td style="width:148px;">Isolymph, CTL Scientific Corp.</td>
			<td style="width:119px;">1114868</td>
			<td>Flammable liquid, Irritant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">LPS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MIP1-&#945; PE Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">554730</td>
			<td>Acute toxicity, Oral</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Monensin</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M5273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotine</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N3876</td>
			<td>Acute toxicity, Environmental hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Parafilm</td>
			<td style="width:148px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">&#8220;M&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>Flammable, Skin irritation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Pen/strep</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Running buffer</td>
			<td style="width:148px;">MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Th1/Th2 CBA Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">TNF-&#945; Alexa Fluor 488 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">502915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tris Base</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to evaluate cytotoxicity and immunosuppression of combustible tobacco product preparations

他の病態生理学的変化の中で、タバコの煙への慢性暴露は、微生物感染症および腫瘍発生に喫煙者の感受性の増加に関連している炎症および免疫抑制を引き起こす。 エクスビボのヒト末梢血単核細胞における受容体媒介性免疫応答の抑制（PBMC）を煙成分で処理されたメカニズムを研究し、タバコ製品への曝露の可能性のある長期的影響を評価するための魅力的なアプローチである。ここでは、細菌性リポ多糖、Toll様受容体4リガンドによって刺激したPBMCを使用してex vivoでのアッセイを実行するための方法を最適化した。全体煙馴化培地（WS-CM）、可燃タバコ製品製剤（TPP）、及びニコチンの効果はサイトカイン分泌に調査し、ex vivoでのアッセイでのPBMCによる細胞死滅を標的とした。者らは、分泌されたサイトカインIFN-γ、TNF、IL-10、IL-6、及びIL-8および細胞内サイトカインIFN-47 ;, TNF-α、および​​MIP-1αは、WS-CM-暴露PBMCにおいて抑制された。 K562標的細胞殺傷アッセイによって決定されるエフェクターPBMCの細胞溶解機能は、また、WS-CMへの曝露によって減少した。ニコチンはこれらのアッセイにおける最小有効だった。要約すると、我々は、生体外アッセイにおけるTPPの影響を評価するために改良されたアッセイのセットを提示し、これらの方法は、容易に関心のある他の製品をテストするために適合させることができる。

結果は、平均（4ドナーサンプル）の平均値±標準誤差として示した。処理および未処理の対照サンプルとの間のスチューデントのt検定は、対応するコントロールとのすべての治療のためにExcelソフトウェアならびにt検定比較を用い​​て行った。統計的有意性は次式で示された：*、P &lt;0.05; **、P &lt;0.005。 ***、P &lt;0.0005。 WS-CMおよびニコチンへの曝露の効果を測定する?...

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Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.

可燃たばこ製品製剤の細胞毒性および免疫抑制を評価するための方法

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

methods-to-evaluate-cytotoxicity-immunosuppression-combustible

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.3K ビュー.  Wake Forest University Health Sciences. Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure. 

ビデオ: Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

ポリオウイルスの同定のための粒子凝集法

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

免疫・感染学

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

HCVの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化<em&gt;表皮ブドウ球菌</em&gt;と<em&gt;マイコバクテリウムmarinumの</em創薬のためのモデルとして&gt;感染症

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

複製サイクルの初期段階を監視するためにB型肝炎ウイルスのレポーターシステムの開発

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Fcγ受容体媒介食作用を評価するために、単球単層アッセイの使用

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

新規In Vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

敗血症誘発免疫抑制のセカルライゲーションと穿刺および鼻腔感染の二重モデルの設計

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

腫瘍特異的 CD8+ T 細胞応答における Immunodominance を研究するためのインビボ細胞毒性アッセイ

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

狂犬病ワクチンの効力を評価するインビトロELISA試験

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...