医療用途の新素材の爆発的な増加に伴い、初期スクリーニングは体系的に行う必要があるため、このプロトコルは、新規生体材料の開発と特性評価を目指す研究者にとって基本的なツールになる可能性があります。この方法論により、固体および液体の両方の生体材料および医薬製剤の細胞毒性および生物活性の定量的および定性的評価が可能になります。細胞曝露に続いて、いくつかの相補的なアッセイを実施することができる。
生体材料の細胞毒性の確立は、臨床診療に関連する意味を持つ可能性があります。たとえば、この知識により、臨床医は特定の患者または状態に最適な生体材料を選択できます。このプロトコルにより、歯科、整形外科、外科、眼科、心臓病学などのさまざまな分野で新しい生体材料の特性評価が可能になります。
評価性能は、細胞毒性以外の生体組織における生体材料の生理活性について結論付けることを可能にするべきである。実験の開始にできるだけ近いところで、スパチュラを使用して、新しく準備した生体材料をPVC型にロードし、材料を室温で適切な時間セットします。材料が固まったら、ペレットを型から取り出し、適切なサイズの容器に入れます。
次に、ペレットを紫外線ランプ下で片面20分間滅菌します。ペレットから生体材料を抽出するには、滅菌したペレットを50ミリリットルのチューブに入れ、適切な細胞培養培地をペレットに加えます。チューブを摂氏37度で24時間置きます。
翌日、新鮮な培地を使用して、抽出物を適切な量に希釈します。生体材料曝露に応答して細胞形態を評価するには、滅菌ピンセットを使用して、適切なサイズの滅菌ガラスカバーガラスカバーガラスをマルチウェルプレートの各ウェルに配置します。適切な濃度で各カバーガラスに細胞を追加し、インキュベーターに一晩置きます。
目的の抽出希釈液を適量各ウェルに加え、細胞を適切なインキュベーション期間の間細胞培養インキュベーターに戻す。インキュベーションの最後に、各ウェルから上清を吸引して、カバーガラスを室温で乾燥させます。サンプルが乾燥したら、室温で3分間インキュベートするために、各カバーガラスを十分な量のMay-Grunwald溶液で覆います。
染料を除去した後、カバーガラスを適量の蒸留水で1分間洗浄し、続いて十分な量のギムザ溶液中で15分間インキュベートする。インキュベーションの最後に、カバーガラスを流水で洗い、光学顕微鏡で細胞を画像化します。実証されているように、目的の生体材料への曝露後のタンパク質発現評価によって細胞機能を評価するには、細胞を3.7%パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定する前に、細胞の各ウェルをPBSで洗浄します。
インキュベーションの最後に、細胞をPBSで2回洗浄し、PBS中の0.5%トリトンで細胞を15分間透過処理します。透過の終わりに、ペルオキシダーゼをPBS中の0.3%過酸化水素で5分間ブロックし、続いてPBSで2回洗浄します。2回目の洗浄後、細胞を0.5%BSAで2回洗浄してから、2%BSAで非特異的結合を45分間ブロックします。
インキュベーションの最後に、細胞を0.5%BSAで1回洗浄してから、目的のタンパク質に対する一次抗体で細胞を室温で60分間インキュベートし、続いて新鮮な0.5%BSAで5回洗浄します。最後の洗浄後、細胞を適切な二次抗体と共に室温で90分間インキュベートし、続いて0.5%BSAで1分間洗浄を5回行います。最後の洗浄後、細胞を適切な基質および色原体混合物と共に、基質濃度1ミリリットル当たり20マイクロリットルの色原体で25分間インキュベートする。
インキュベーションの最後に、PBS中の0.5%BSAで培養物を2回洗浄し、細胞をヘマトキシリンで15分間対比染色します。対比染色した細胞をアンモニア1リットル当たり0.037モルで5分間洗浄する。次に、蒸留水で5分間洗浄して余分な染料を取り除き、グリセロールを使用してカバーガラスをスライドに取り付けます。
抽出処理された細胞培養物内の石灰化沈着物の形成を評価するには、各ウェルをPBSで3回洗浄してから、細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間固定します。最後の洗浄後、適量のアリザリンレッド染色溶液で細胞を摂氏37度暗所で20分間染色します。インキュベーションの最後に、余分な色素が完全に除去されるまでウェルをPBSで洗浄し、光学顕微鏡で細胞を画像化します。
次に、抽出溶液を各ウェルに加え、室温で攪拌しながら40分間インキュベートし、490ナノメートルの波長で分光光度計で各ウェルの吸光度を測定します。MTTアッセイは、代謝活性への影響によって測定される材料の細胞毒性の概要を迅速かつ簡単な方法で得るために使用できます。細胞毒性の高い材料は同じ濃度でより高い割合の細胞死を誘導するため、細胞生存率分析では目的の材料の細胞毒性を評価することもできます。
30%を超える削減は重要であると考えられており、材料は生体適合性が低いリスクがあると定義されています。さらに、細胞毒性物質が多いほど、細胞生存率の低下が強調され、アポトーシスおよび壊死細胞死プロファイルが遅くなりますが、細胞毒性の低い物質は細胞死が少なく、アポトーシス性および後期アポトーシスプロファイルが高くなります。形態学的評価は、細胞形態の変化がアポトーシスまたは壊死プロファイルを示すだけでなく、材料粒子の存在を明らかにする可能性があるため、細胞生存率評価を補完します。
さらに、タンパク質発現に対する目的の材料の影響は、生存率への影響とは無関係に観察できます。たとえば、この分析では、一方の材料がタンパク質発現の増加を誘導し、もう一方の材料が有意な減少を促進しました。どちらの場合も、抽出物の濃度はタンパク質発現に直接影響しました。
抽出物の調製では、適切な生体材料の表面と中程度の体積比が重要です。さらに、サンプルは、その特性を変えない方法を使用して滅菌する必要があります。覚えておくべきもう一つの詳細は、調整なしで登録する必要がある抽出pHです。
必要に応じて、追加のコントロールを実行します。生体材料抽出物は、化学および生化学研究、ならびに他のいくつかの分子生物学的技術に使用することができる。得られた結果は、将来のin vivo生体適合性試験の基礎を提供します。
細胞毒性評価は、医療用材料の開発に不可欠です。したがって、このプロトコルは、新しい生体材料または異なる医療分野にすでに存在する他の新しいアプリケーションを評価するための体系的かつ包括的なアプローチを提供します。
