著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。

<ol>
	<li>Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+mechanisms+underlying+CFTR+channel+activity,+the+molecular+basis+for+cystic+fibrosis+and+strategies+for+therapy.">Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy.</a> Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).</li><li>Bear, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Cell. 68 (4), 809-818 (1992).</li><li>Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-resolution+single-channel+recording+to+functional+studies+of+cystic+fibrosis+mutants.">Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants.</a> Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).</li><li>Kerem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+genetic+analysis.">Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis.</a> Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+defective+anion+transport+in+L+cells+expressing+recombinant+forms+of+CFTR.">Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR.</a> Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).</li><li>Mendoza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+efficient+correction+of+DeltaF508+CFTR+revealed+by+analyses+of+evolved+sequences.">Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences.</a> Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).</li><li>Rabeh, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+both+NBD1+energetics+and+domain+interface+is+required+to+restore+DeltaF508+CFTR+folding+and+function.">Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function.</a> Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).</li><li>Aleksandrov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulation+balances+thermodynamic+stability+and+restores+function+of+DeltaF508.">Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508.</a> CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).</li><li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation.">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li><li>Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+recombinant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+from+Chinese+hamster+ovary+and+insect+cells.">Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells.</a> J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).</li><li>Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> JoVE. (61), (2012).</li><li>Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).</li><li>Peng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+affinity+isolation+of+recombinant+protein+using+the+baculovirus/insect+cell+expression+system.">One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system.</a> Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).</li><li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).</li><li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+reconstitution+of+epithelial+chloride+channel+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).</li><li>Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+protein+derived+from+the+baculovirus+expression+system+using+glutathione+affinity+agarose.">Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose.</a> Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).</li><li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+potentiator+VX-770+(ivacaftor)+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).</li><li>Alkhouri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+properties+of+molecular+probes+for+the+rescue+site+on+mutant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).</li><li>Eckford, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VX-809+and+Related+Corrector+Compounds+Exhibit+Secondary+Activity+Stabilizing+Active+F508del-CFTR+after+Its+Partial+Rescue+to+the+Cell+Surface.">VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface.</a> Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).</li><li>Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+corrector+modifies+the+channel+function+of+F508del-CFTR.">A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR.</a> Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).</li><li>Verkman, A. S., Galietta, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+channels+as+drug+targets.">Chloride channels as drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).</li><li>Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interaction+of+a+small-molecule+modulator+with+G551D-CFTR,+a+cystic+fibrosis-causing+mutation+associated+with+severe+disease.">Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease.</a> Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).</li><li>Norez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+CFTR+chloride+channel+activity+and+pharmacology+using+radiotracer+flux+methods.">Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods.</a> J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).</li><li>Whitney, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+alginate+secretion+across+the+bacterial+outer+membrane.">Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).</li><li>Islam, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-dependent+gating+and+proton+uptake+by+Wzx+support+O-antigen-subunit+antiport+across+the+bacterial+inner+membrane.">Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane.</a> mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).</li><li>Ramjeesingh, M., Conn, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+16.">Ch. 16.</a> Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. , 337-357 (2010).</li><li>Wellhauser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability.">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H++channels.">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).</li><li>Chang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+(PKA)+still+activates+CFTR+chloride+channel+after+mutagenesis+of+all+10+PKA+consensus+phosphorylation+sites.">Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites.</a> J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).</li><li>Gadsby, D. C., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CFTR+Cl-+ion+channels+by+phosphorylation+and+dephosphorylation.">Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation.</a> Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).</li><li>Ma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinone+CFTR+inhibitor+identified+by+high-throughput+screening+blocks+cholera+toxin-induced+intestinal+fluid+secretion.">Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion.</a> J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).</li><li>Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+CFTR+inhibition+by+a+thiazolidinone+derivative.">On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative.</a> J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).</li><li>Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+new+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibitor+on+Cl-+conductance+in+human+sweat+ducts.">Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts.</a> Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).</li></ol>

著者は、ここに記載される精製方法の開発中に博士Mohabir Ramjeesinghの助言を認める。これらの研究は、ヘルスリサーチ（CIHR）および嚢胞性線維症カナダ（CFC）のカナダの研究所からのCEBに営業補助金によってサポートされていました。 PDWEはCIHRとCFCを通じてフェローシップ賞によって部分的にサポートされていました。著者は、嚢胞性線維症財団ピュー（CFFT）による補正、増強博士R·ブリッジズ（医学部のロザリンド大学と科学）から阻害剤化合物および流通の提供を認める。著者はまた、バキュロウイルス系を用いて、重量および変異型CFTRタンパク質を発現するにベイラー細胞培養施設（NIH助成金をP30 CA125123）により優れたサービスを認める。非アクティブなVX-770アナログ、V-09から1188には、バーテックス·ファーマシューティカルズの贈り物だった。

細胞の過剰発現システムの様々な、完全長の、機能的なCFTRの単離のための精製プロトコルの数が限られている。それはWT-CFTRまたはATPアーゼ、平面二重層内の単一チャネル測定を含むチャネル機能の直接測定を含むアッセイにおいて、高機能である適度な量のF508del-とG551D-CFTRの高濃縮の迅速な精製を可能にするように、ここで説明する方法は有利である小分子19-21の研究に関連性の高?...

肺、腸、膵臓および汗腺などの組織における上皮細胞の頂端膜を横切る塩化物輸送は、主に嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）、ATP-とABCのリン酸化調節性メンバー（ATP-によって媒介される1で概説膜タンパク質のカセット）Cサブファミリー（）を結合。 ABCCサブファミリーの他のメンバーと同様に、CFTRは、単一で、適度なATPアーゼ活性を有し、そのヌクレオチド結合ドメイン（NBDは）の界面に形成された2つのヌクレオチド結合部位にATPが結合する大規模なマルチスパニング膜内在性タンパク質であるサイト。しかし、他のABCCサブファミリーメンバーとは異なり、CFTRは、固有の規制のClチャネルとしてではなく、アクティブな溶質輸送体として発展してきた。 morbiにつながるCFTR原因嚢胞性線維症、肺、消化管、膵臓および生殖器官を含む複数の器官に影響を与える疾患の変異、若年成人におけるdityと死亡。肺疾患は、典型的には、嚢胞性線維症、早期死亡を占めており、ほとんどの場合、誘導気道の表面上皮におけるCFTR機能の喪失によって引き起こされる。繊毛気道上皮の頂端面上に流体層を変更するために表面上皮を横切って水の動き- CFTR塩素イオンチャネル活性の欠如は、両方のClの減少を引き起こす。これは、繊毛呼吸上皮細胞、気道の外に効果的に明確な病原体の能力を損なう粘性の気道表面液が得られる。結果として、ほとんどのCF患者は、肺感染症や炎症による肺損傷の再発発作に苦しむ。 予想されるように、正常なCFTRタンパク質の作用メカニズムの研究は、主に、チャネルゲーティング活動の詳細な電気生理学的研究に焦点を当てた。シングルチャネルの研究では、PKA-依存性Clとして直接そのCFTR機能を示している- ATP規制ゲート2を有しているチャンネル。詳細な電気生理学的研究は、単一のCFTRチャネル1,3上の大量の情報を提供する、しかし研究されており、任意の特定の単一チャネルの特性はCFTRチャネルの全人口、したがって、単一チャネルを反映しているかどうかの懸念があるかもしれ結果は常に巨視的人口を研究するための方法と一緒に考慮されるべきである。精製されたCFTRの人口チャネル活性の直接アッセイは、疾患を引き起こす突然変異と関連する分子の欠陥への洞察を提供し、化学モジュレーター修復変異CFTRタンパク質の発見を駆動する可能性がある。現在までに、嚢胞性線維症4を引き起こすと考えCFTRにおける1900の異なる変異を超えるがある。北米と欧州で患者の約90％の少なくとも一つの対立遺伝子に見られる主要な突然変異、F508del-CFTRは、誤った折り畳みタンパク質につながるND小胞体5における保持。 F508del-CFTRはまた、不良チャネル活性6-9を含む他の結果を持っています。細胞表面からのCFTRの結果として存在しないことは、重篤な疾患と関連している。 G551D-CFTR、あまり一般的変異は、正しくまだ折り畳まれた細胞表面6における塩素イオンチャネルとして機能不全であることが考えられている。小分子補正器及び増強剤の開発は、それぞれ、細胞表面に存在フォールディングおよび/またはそのような細胞表面へF508del-CFTRのような変異体のトラフィッキング、および増強の補正や、G551Dような変異のチャンネル活性を増加させるという目標を有する。補正器VX-809およびVX-661は、（まだ患者での使用が承認されていませんが、増強Kalydeco（ivacaftor、VX-770）は、少なくとも1つのG551Dを持つすべての12 CF患者におけるHR&gt; 6歳150ミリグラムで使用されているG178R、S549N、S549R、G551S、G1244E、S1251N、S1255Pの1の患者のためのより最近-CFTR突然変異、及びとG1349D。 Kalydeco安全かつCF疾患10の臨床的指標の改善をもたらすの両方が、しかし、この小分子の作用機序は十分に患者に使用するためのFDA承認の際に理解している。 CFTRの精製方法の一握りが完了するまでにかなりの時間を必要とする多くは、2,11-18、以前に記載されている。最近の刊行物19には、ユニークな精製および再構成の方法は、S fは 9細胞発現系において過剰発現CFTRについて記載し、定義された脂質系において、この精製されたタンパク質は、CFTRの集団CFTRハロゲンチャネル活性アッセイを開発するために使用された分子。アッセイは、CFTR機能上のリン酸化、ヌクレオチドおよび阻害剤の既知の効果を再現。システムは、重量（野生型）、F508del-及びG551D-CFTRに増強VX-770 / Kalydecoの効果を調べるために使用し、それを最初にするために示された薬物が母集団の観点からCFTRおよびヌクレオチドおよび小分子を有する突然変異体の相互作用の研究にこれらの方法の有用性および適用可能性を実証し、ATP非依存的に、チャネル活性を増強するためにCFTRタンパク質と直接相互作用時間タンパク質約臨床的に関連する質問に答える。方法はまた、他の増強剤分子およびそれらの誘導体20、ならびにタンパク質21の活性に対する小分子の補正の効果を研究するために使用されている。 流出アッセイは、以前に、電極、放射性トレーサー、およびフルオロフォア22,23を用いて、全細胞アッセイは、イオン選択性電極24を有する膜小胞を含むCFTR突然変異体の活性およびその活性に対するCFTR調節性化合物の効果を調査するために多くの研究で使用されている、放射性トレーサー25を用いて再構成CFTRを精製した。しかし目精製された再構成されたCFTRを研究するためのイオン選択電極の電子の使用が最初に最近19報告された。現在の方法の応用は、再構成および緑膿菌 、共通CF病原体における2つの膜タンパク質の機能的特徴付けのために使用されてきた。ヨウ化物流出測定と結合して精製AlgE外膜タンパク質の再構成は、このトランス26を介してアニオン性アルギン酸塩分泌のためのモデルをサポートするために使用された。再構成およびヨウ化物流出測定は、モデルは、このタンパク質27によって細菌の内膜を横切る脂質結合オリゴ糖転位のためのH +依存性アンチポートメカニズムを示唆して提案することが許可され精製された例えば、wzxタンパク質に適用した。どちらの場合も、ヨウ化物は、一つは天然基質のために期待するかもしれないよりも低いスループットではあるが、アニオン性基板の代わりとして使用された。この方法は、cと他のタンパク質への適応のために適切であり得るアニオン性基板のためationic輸送又は伝導経路。 ここで迅速な精製手順は、CFTRタンパク質と定義された脂質のプロテオリポソー​​ムへの再構成のために記載されている。迅速な再構成手順は容易に精製において使用される界面活性剤の種類は、ここで使用される方法による除去に適しているか、再構成手順の前に適切な界面活性剤に交換することができれば、他の方法によって精製CFTRでの使用のために調整することができる。精製された再構成CFTRタンパク質のチャンネル活性を測定するためのヨウ化物流出方法について詳細に説明すると、この方法から得ることができるいくつかの典型的な結果を示す。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1269">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:403px;">fos-choline 14 detergent</td>
			<td style="width:515px;">Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)</td>
			<td style="width:145px;">F312</td>
			<td style="width:207px;">Affymetrix: Anatrace Products; CAS#&#160;:77733-28-9</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td>
			<td>04 693 132 001</td>
			<td>EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack&#160;</td>
			<td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td>
			<td>05 892 791 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qaigen GmbH</td>
			<td align="right">1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisherbrand Screening columns</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>11-387-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K</td>
			<td>Millipore (www.millipore.com)</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit</td>
			<td colspan="2">New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)</td>
			<td>Peirce PKA is also suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PC, Chicken Egg</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PS, Porcine Brain</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>840032C</td>
			<td>(CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w))</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PE, Chicken Egg</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>841118C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ergosterol</td>
			<td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td align="right">45480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce Detergent removal spin column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">87779</td>
			<td>1 ml capacity columns</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">valinomycin</td>
			<td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>V-0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VX-770 (ivacaftor)</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iodide selective microelectrode</td>
			<td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)</td>
			<td>LIS-146ICM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Clampex 8.1 software</td>
			<td>Axon Instruments (www.axon.com)</td>
			<td></td>
			<td>we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alternate Software: ArrowLabb System&#160;</td>
			<td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)</td>
			<td>LIS-146LICM-XS</td>
			<td>Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.&#160; This software should serve a similar function to our setup</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">small stir bars</td>
			<td>Big Science Inc (www.stirbars.com)</td>
			<td>SBM-0502-CMB</td>
			<td>choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sephadex G50, fine</td>
			<td>GE Health Care (www.gelifesciences.com)</td>
			<td>17-0042-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies Co, Inc.</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td>Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional reconstitution and channel activity measurements of purified wildtype and mutant cftr protein

嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）の輸送体のATP結合カセット（ABC）スーパーファミリーのユニークな流路形成部材である。 CFTRのリン酸化およびヌクレオチド依存性クロライドチャネル活性は、しばしば全細胞系および切除した膜パッチの単一チャネルとして研究されている。多くの嚢胞性線維症の原因となる変異はこの活性を変化させることが示されている。精製プロトコールの少数が公開されているが、チャネルの活性を保持する高速再構成方法及び精製系人口チャネル活性を研究するための適切な方法は、欠けている。ここで迅速な方法は、調整されたハロゲン化チャネルとしての活性を保持して定義された脂質組成物のプロテオリポソー​​ムに精製および全長CFTRタンパク質の機能的再構成のために記載されている。一緒にチャンネル活性の新規のフラックスベースのアッセイと、この再構成方法は、適したシステムである野生型CFTRと病気の原因となる変異体F508del-とG551D-CFTRの人口チャネル特性を研究。具体的には、本方法は、リン酸化、ヌクレオチドおよびそのようなCFTRチャネル活性における増強および阻害剤としての小分子の直接的な効果の研究において有用性を有する。方法はまた、アニオン性基材用の他の膜チャネル/トランスポーターの研究に適している。

この書かれた刊行物、精製および再CFTRタンパク質の調節されたチャネル活性を測定するための方法が記載される。 図1aは、精製、再構成およびヨウ化物流出手順のためのワークフローを示している。ヨウ化物フラックスによる再構成およびチャンネル活性測定のための方法は、関連するビデオにさらに詳細に示されている。 プロテオへのCFTRの精製と再構成<...

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Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

ここで説明すると、嚢胞性線維症における欠陥があるこの塩素チャネル、のための活動を維持して精製野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成するための迅速かつ効果的な手続きである。 CFTRによって媒介され、再構成プロテオリポソー​​ムからヨウ化物流出は、チャネル活性の研究や小分子の効果を可能にする。

精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

functional-reconstitution-channel-activity-measurements-purified

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K ビュー.  Hospital for Sick Children. ここで説明すると、嚢胞性線維症における欠陥があるこの塩素チャネル、のための活動を維持して精製野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成するための迅速かつ効果的な手続きである。 CFTRによって媒介され、再構成プロテオリポソー​​ムからヨウ化物流出は、チャネル活性の研究や小分子の効果を可能にする。 